CC BY
111
ИММУНОЛОГИЯ
УДК 616.24-002.5-078.33
ДИСФУНКЦИИ МАКРОФАГОВ, ГЕНЕРИРОВАННЫХ ИЗ МОНОЦИТОВ КРОВИ БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЛЕГКИХ
Людмила Васильевна САХНО1, Марина Александровна ТИХОНОВА1, Сергей Данилович НИКОНОВ2, Олег Александрович ЖДАНОВ2, Александр Анатольевич ОСТАНИН1, Елена Рэмовна ЧЕРНЫХ1
1НИИ клинической иммунологии СО РАМН 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14
2Новосибирская клиническая туберкулезная больница № 1 630082, г. Новосибирск, ул. Вавилова, 14
В работе исследованы фенотипические и функциональные свойства макрофагов, генерированных из моноцитов крови здоровых доноров и больных туберкулезом легких, включая больных с сохранным и сниженным ответом на очищенный туберкулин (ППД). Показано, что макрофаги ППД-анергичных больных характеризуются низким содержанием клеток, экспрессирующих антигены НЬЛ-БК и СБ86, дисбалансом продукции цитокинов (уменьшенной секрецией интерферона-у, ИЛ-18 и повышенной продукцией ИЛ-6, ИЛ-10), а также низкой аллостимуляторной активностью в смешанной культуре лимфоцитов. Полученные данные позволяют предположить наличие взаимосвязи между изменением свойств макрофагов и нарушением антигенспецифического Т-клеточного ответа при туберкулезной инфекции.
Ключевые слова: макрофаги, цитокины, аллостимуляторная активность, туберкулез легких.
Хорошо известно, что у преобладающего большинства людей, инфицированных Mycobacterium tuberculosis, активная болезнь не развивается, что указывает на возможность эффективного контроля туберкулезной инфекции со стороны иммунной системы. Ведущая роль в механизмах иммунной защиты отводится клеточным реакциям врожденного и адаптивного иммунитета, опосредуемых макрофагами (Мф) и Т-клетками. Первичное инфицирование макрофагов M. tuberculosis приводит к активации их микробицидной функции, направленной на непосредственное уничтожение патогена. Кроме того, поглощение микобактерий индуцирует продукцию провоспалительных цитокинов, которые ограничивают рост фагоцитированных микроорганизмов и обеспечивают рекрутирование и активацию дополнительного количества лейкоцитов [1, 2]. Впоследствии подавление роста и элиминация M. tuberculosis определяется эффективностью межклеточного взаимодействия макрофагов и рекрутированных антигенспецифических Т-лимфоцитов. Так, в ответ на Т-клеточные активирующие сигналы происходит выраженное усиление цитотоксической активности макрофагов, направленной против внутриклеточных патогенов. Поскольку одним из ключевых факторов, стимули-
рующих цитотоксическую активность макрофагов, является интерферон-гамма (ИФН-у), продуцируемый Т-хелперными клетками Iтипа (Ш), активация П1 рассматривается в качестве необходимой составляющей эффективного контроля за туберкулезной инфекцией [3, 4].
Функциональная активность макрофагов, а также баланс продуцируемых ими про- и противовоспалительных цитокинов во многом определяют направленность и силу развития протективно-го, антигенспецифического Т-клеточного ответа при туберкулезной инфекции. Нарушение функций макрофагов в очаге поражения может быть обусловлено непосредственным действием мико-бактериальных антигенов, способных подавлять образование фаголизосом и ингибировать экспрессию ко-стимуляторных молекул [5—8]. Кроме того, дисфункции макрофагов могут быть связаны с изменением свойств циркулирующих моноцитов, которые рекрутируются в очаг повреждения. Ранее нами и другими авторами было показано, что моноциты периферической крови больных туберкулезом легких отличаются повышенной супрессорной активностью, обусловленной синтезом интерлейкина-10 (ИЛ-10), и сниженной экспрессией ко-стимуляторных молекул [9—12].
Сахно Л.В. — к.б.н., старш.н.с. лаборатории клеточной иммунотерапии, e-mail: ct_lab@mail.ru
Тихонова М.А. — к.б.н., старш.н.с. лаборатории клеточной иммунотерапии, e-mail: ct_lab@mail.ru
Никонов С.Д. — д.м.н., проф., зав. отделением гравитационной хирургии крови, e-mail: sibnovomed@mail.ru
Жданов О.А. — врач анестезиолог-реаниматолог, e-mail: sibnovomed@mail.ru
Останин A.A. — д.м.н., проф., руководитель клинического отдела, e-mail: ct_lab@mail.ru
Черных Е.Р. — д.м.н., проф., руководитель лаборатории клеточной иммунотерапии, ct_lab@mail.ru
Следовательно, можно предположить, что дифференцирующиеся из моноцитов макрофаги также могут иметь ряд дисфункций. Исходя из этого, целью исследования стало изучение фенотипических и функциональных свойств макрофагов, генерируемых из моноцитов периферической крови больных туберкулезом легких.
Материал и методы
В исследование были включены 64 больных туберкулезом легких: 36 (56 %) мужчин и 28 (44 %) женщин в возрасте от 20 до 60 лет. Обследованная группа включала 11 (17,2 %) пациентов с фиброзно-кавернозной, 44 (68,8 %) пациента с инфильтративной и 9 (14 %) пациентов с диссеминированной формами туберкулеза. Активное бацилловыделение было выявлено у 28 (43,8 %) больных. При лабораторном исследовании лекарственная резистентность M. tuberculosis регистрировалась у 18 (28,1 %) пациентов. Контрольную группу составили 30 здоровых доноров крови, сопоставимых по полу и возрасту.
Мононуклеарные клетки выделяли из гепари-низированной венозной крови центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина и культивировали (0,1 х 106/лунку) в 96-луночных планшетах для иммунологических исследований в среде RPMI-1640 («Sigma-Aldrich», США), дополненной 0,3 мг/мл L-глутамина, 5 мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 10 % инактивированной сыворотки доноров крови IV (АВ) группы при 37 °С в СО2-инкубаторе. Для стимуляции клеток использовали туберкулиновый очищенный белковый дериват (ППД) в концентрации 50 мкг/мл. Интенсивность пролиферации оценивали на 6 сут по включению 3Н-тимидина (1 мкКи на лунку), добавленного за 18 ч до окончания культивирования. В зависимости от уровня пролиферативного ответа мононуклеарных клеток на ППД больные были разделены на 2 подгруппы: подгруппа 1 — с сохранным (> 12 500 имп/мин; n = 40) и подгруппа 2 — со сниженным (< 12 500 имп/мин; n = 24) ответом на ППД.
Макрофаги получали путем культивирования прилипающей фракции мононуклеарных клеток периферической крови в 6-луночных планшетах («Nunclon», Дания) в среде RPMI-1640 дополненной 5 % аутоплазмы, 2 % сыворотки крови плодов коровы («Биолот», Санкт-Петербург),
2-меркаптоэтанолом (5 х 10-5М, «Serva», Германия), пируватом Na (2 х 10-3 М, «Sigma-Aldrich»),
1 % раствором незаменимых аминокислот в присутствии гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ; 50 нг/мл, «Sigma-Aldrich») в течение 6 сут. По окончании культивирования отделение Мф от пластиковой поверхности осуществляли с использованием 20 мМ раствора этилендиаминтетраацетата. Полученные Мф 2-кратно отмывали средой RPMI-1640, дополненной 5 % сыворотки крови плодов коровы.
Продукцию фактора некроза опухолей-а (ФНО-а), ИЛ-1, рецепторного антагониста интерлейкина-1 (РАИЛ), ИЛ-6, ИЛ-10, трансформирующего рост фактора-ßj (ТРФ-ßj), интерферона-у (ИФН-у) и ИЛ-18 оценивали в супернатантах 6-суточных культур Мф, а также в 24-часовых супернатантах Мф, нестимулированных и стимулированных липополисахаридом (ЛПС E. coli0111:B4, «Sigma-Aldrich») в дозе 10 мкг/мл. Концентрацию цитокинов определяли методом иммунофер-ментного анализа, используя соответствующие тест-системы производства «Вектор-Бест», Новосибирск (ФНО-а, ИЛ-1, РАИЛ, ИЛ-6, ИФН-у, ИЛ-18), «Цитокин», Санкт-Петербург (ИЛ-10) или «R&D Systems», Великобритания (ТРФ-ßj).
Аллостимуляторную активность Мф оценивали в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ) при культивировании мононуклеарных клеток доноров (0,1 х 106/лунку) в 96-луночных круглодонных планшетах в присутствии аллогенных Мф здоровых доноров или больных туберкулезом в соотношении 10:1. Интенсивность пролиферации оценивали на 5 сут радиометрически по включению 3Н-тимидина. Индекс влияния Мф (ИВМф) в СКЛ рассчитывали как отношение пролиферативного ответа мононуклеарных клеток в присутствии Мф к уровню их спонтанной пролиферации.
Оценку поверхностных маркеров Мф проводили методом проточной цитометрии («FACS Calibur, Becton Dickinson», США) с использованием моноклональных FITC-меченных антител (для оценки экспрессии CD 16 и HLA-DR) или PE-меченных анти-CD 14-антител («Сорбент», Москва), а также FITC-меченных анти-CD86-антител («BD PharMingen», США).
Математическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ «Sta-tistica 6.0». Данные представлены в виде M ± S.E., где M — среднее арифметическое значение, S.E. — ошибка среднего арифметического значения. Различия между подгруппами оценивали с помощью критериев Стьюдента для независимых выборок (t) и Вилкоксона — Манна — Уитни (U), достоверными считались результаты при p < 0,05.
Результаты и обсуждение
Популяция прилипающих к пластику клеток у больных туберкулезом так же, как и у здоровых доноров, была представлена в основном CD^-мо-ноцитами (76,9 ± 2,3 и 82,4 ± 2,8 %, соответственно). В результате 6-суточного культивирования с ГМ-КСФ моноциты приобретали типичные морфологические черты макрофагов в виде появления крупных клеток с большой цитоплазмой и ядром неправильной формы. Жизнеспособность Мф во всех экспериментах была не менее 90 % и не различалась у доноров и больных туберкулезом. Среднее количество генерируемых Мф также было сопоставимо и составляло в исследуемых группах доноров и больных туберкулезом соответственно 40 ± 9 и 31 ± 5 х 103 Мф/106 мононуклеарных клеток.
Таблица 1
Фенотипическая характеристика Мф здоровых доноров и больных туберкулезом легких
Маркеры Здоровые доноры (n = 18) Больные туберкулезом
В целом по группе (n = 20) Подгруппа 1 (n = 11) Подгруппа 2 (n = 9)
CD14+ (%) 78 ± 3,9 78 ± 2,8 79 ± 4,1 76 ± 4,0
CD16+ (%) 29 ± 3,8 41 ± 4,2 50 ± 5,6* 30 ± 4,2#
HLA-DR+ (%) 91 ± 2,2 89 ± 3,1 96 ± 1,7 80 ± 4,8*- #
CD86+ (%) 38 ± 4,7 26 ± 5,4* 31 ± 9,4 19 ± 3,9*
Примечание: здесь и в табл. 2, 3: * — отличие от соответствующего показателя в группе доноров достоверно при ри < 0,05; # — отличие от соответствующего показателя в подгруппе 1 достоверно при ри < 0,05.
Сравнительный фенотипический анализ полученных Мф показал (табл. 1), что и у доноров, и у больных туберкулезом преобладающее большинство клеток (около 80 %) экспрессировали CD14. При этом около трети полученных Мф здоровых доноров и половина Мф больных туберкулезом также экспрессировали CD 16. Интересно отметить, что у больных с сохранным ответом на ППД относительное количество CD^-Мф было достоверно выше, чем у доноров или у пациентов со сниженным ответом на ППД. Снижение доли CD86-позитивных клеток, которое обнаруживалось в общей группе больных туберкулезом, было обусловлено, главным образом, наиболее выраженным (2-кратным) уменьшением их количества у пациентов с ППД-анергией, тогда как в подгруппе ППД-реактивных больных относительное содержание CD86+-Мф оставалось сохранным. Кроме того, у ППД-анергичных больных отмечалось умеренное, но статистически достоверное снижение относительного количества HLA-DR+Мф. Таким образом, генерируемые in vitro Мф у больных с сохранным антигенспецифическим ответом практически не отличаются по своему фенотипу от Мф здоровых доноров, за исключением повышенного содержания CD16+-клеток. Напротив, клеточная популяция, полученная от ППД-анергичных больных, характеризовалась количественным дефицитом макрофагов, экспрессирующих молекулы, необходимые для эффективной презентации антигена (HLA-DR) и ко-стимуляции Т-клеток (CD86).
Исследование содержания цитокинов в супернатантах 6-суточных культур макрофагов не выявило статистически значимых различий в уровне продукции ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-18, ИЛ-1, РАИЛ и ТРФ-Pj в подгруппах здоровых доноров и больных туберкулезом (табл. 2). Тем не менее у последних регистрировалось выраженное 10-кратное снижение
уровня ИФН-у и 2-кратное снижение продукции ИЛ-1 (Ри < 0 ,05), а также отмечалась отчетливая тенденция к увеличению синтеза ТРФ-Р1 (в среднем до 1835 против 1197 пкг/мл у доноров). Кроме того, Мф пациентов со сниженным антигенспеци-фическим ответом характеризовались практически
3-кратным увеличением продукции ИЛ-10 и достоверно отличались по этому показателю от Мф как здоровых доноров, так и пациентов с сохранным ППД-ответом. Полученные результаты свидетельствуют о дисбалансе цитокинов, продуцируемых Мф больных туберкулезом, который проявляется в виде повышенной секреции противовоспалительных и иммуносупрессорных медиаторов (ИЛ-10, ТРФ-р1) в сочетании с недостаточностью продукции цитокинов (ИФН-у, ИЛ-1), участвующих в запуске и контроле воспалительных и клеточноопосредованных иммунных реакций. Важно отметить, что выявленные нарушения цитокин-секреторной функции Мф были в большей степени характерны для пациентов со сниженным антиген-специфическим ответом на ППД.
Исследования цитокинов, которые Мф се-кретируют на этапе генерации в течение всего периода 6-суточного культивирования, были дополнены оценкой уровня спонтанной и ЛПС-стимулированной продукции цитокинов в 24часовых культурах Мф, стандартизованных по количеству клеток-продуцентов (0,05 х 106 Мф/ лунку). Как видно из данных табл. 3, Мф больных туберкулезом в целом сохраняют свою цитокин-секреторную функцию и активно продуцируют про- (ФНО-а, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-18) и противовоспалительные (РАИЛ-1, ИЛ-10) медиаторы на уровне, сопоставимом с донорскими значениями. При этом, однако, регистрировалось нарушение продукции ИФН-у, которое проявлялось снижением уровня спонтанной секреции цито-кина и отсутствием чувствительности Мф к сти-
Таблица 2
Цитокин-секреторная активность Мф здоровых доноров и больных туберкулезом легких
Содержание цитокинов, пкг/мл Здоровые доноры Больные туберкулезом
В целом по группе Подгруппа 1 Подгруппа 2
ФНО-а 557 ± 95 (14) 447 ± 70 (25) 508 ± 120 (11) 399 ± 83 (14)
ИЛ-1 769 ± 199 (8) 375 ± 140* (12) 397 ± 198 (7) 345 ± 217 (5)
РАИЛ 9896 ± 405 (10) 10 508 ± 247 (12) 10 560 ± 250 (7) 10 435 ± 517 (5)
ИЛ-6 2119 ± 39 (10) 1740 ± 173 (13) 1820 ± 220 (7) 1645 ± 291 (6)
ИЛ-10 53 ± 22 (13) 98 ± 30 (17) 53,5 ± 24 (10) 162 ± 58*- # (7)
ТРФ-Pj 1197 ± 127 (7) 1835 ± 423 (11) 1895 ± 612 (7) 1733 ± 569 (4)
ИФН-у 2588 ± 1232 (5) 284 ± 77* (12) 315 ± 104* (8) 221 ± 109* (4)
ИЛ-18 41 ± 6,7 (7) 51 ± 8,5 (13) 44 ± 10 (8) 62 ± 15 (5)
Примечание: представлены средние значения содержания цитокинов в супернатантах 6-суточных культур МФ, генерированных из моноцитов крови доноров и больных туберкулезом в присутствии ГМ-КСФ; в скобках — количество наблюдений.
муляции эндотоксином (ИВЛПС = 1,1; ри < 0,05). Видно, что средний уровень спонтанной и ЛПС-стимулированной продукции ИФН-у в культурах Мф больных туберкулезом составлял соответственно 59 и 54 пкг/мл, что было в 2 и 6 раз ниже значений здоровых доноров.
Сравнительный анализ продукции ИФН-у макрофагами больных, оппозитных по характеру пролиферативного ответа мононуклеарных клеток на ППД, показал, что в обеих подгруппах выражен дефект спонтанного и особенно ЛПС-стимулированного синтеза цитокина. Тем не менее Мф ППД-отвечающих больных отличались максимально высоким уровнем спонтанной секреции ИЛ-18, что, возможно, в определенной степени компенсирует дефицит продукции ИФН-у и позволяет сохранить чувствительность Т-клеток к антигенам M. tuberculosis in vitro. В то же время Мф больных со сниженным ответом на ППД характеризовались наиболее выраженными нарушениями продукции ИФН-у и ИЛ-18, которые сочетались с увеличением уровня спонтанной продукции ИЛ-6 и ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-10.
Заключительным этапом работы стало сравнительное исследование аллостимуляторной активности Мф больных и здоровых доноров в СКЛ (табл. 4). Видно, что пролиферативный ответ в алло-СКЛ, индуцированный макрофагами больных туберкулезом, практически в 2 раза ниже, чем в аналогичных культурах, содержащих Мф здоровых доноров (соответственно 8520 ± 1280 и 15 050 ± 3090 имп/мин, р( < 0,05). Сравнительный анализ аллостимуляторной активности Мф больных с сохранным и сниженным ответом на ППД показал, что наиболее выраженное уменьшение было характерно именно для последних.
Согласно полученным нами ранее данным, около 40 % больных туберкулезом легких характеризуются дефектом антигенспецифического ответа на ППД, что проявляется снижением пролиферации и продукции ИФН-у [9, 10, 13—15]. Причем, помимо повышенного апоптоза и анергии Т-клеток [15], дефект антигенспецифического ответа ассоциируется с дисфункциями моноцитов [9]. Полученные в настоящем исследовании данные впервые демонстрируют, что Мф, гене-
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, ТОМ 30, № 2, 2010 г. 105
Таблица 3
Спонтанная и ЛПС-стимулированная продукция цитокинов в 24-часовых культурах Мф доноров и больных туберкулезом легких
Содержание цитокинов, пкг/мл Условия продукции Здоровые доноры Больные туберкулезом
В целом по группе Подгруппа 1 Подгруппа 2
Медиана (п) ИВдпс Медиана (п) ИВдпс Медиана (п) ИВдпс Медиана (п) ИВдпс
ФНО-а Спонтанная 85,4 (5) 236 (9) 198 (6) 295 (3)
ЛПС-стимулированная 940 (5) 4,5 940 (9) 4,0 940 (6) 4,2 814 (3) 2,3
ИЛ-1 Спонтанная 3,6 (8) 9,1 (15) 8,5 (12) П (3)
ЛПС-стимулированная 13,6 (8) 3,1 15,7 (15) 2,3 16,1 (12) 2,4 12 (3) 0,9
РАИЛ Спонтанная 5040 (9) 5138 (17) 5184 (14) 2904 (3)
ЛПС-стимулированная 6390 (9) 1,4 6270 (17) 1,1 5594 (14) 1,1 6945 (3) 1,2
ИЛ-6 Спонтанная 734 (7) 1127 (13) 691 (9) 1219 (4)*
ЛПС-стимулированная 2180 (7) 3,0 2200 (13) 2,1 2111 (9) 3,0 2212 (4) 1,8*
ИЛ-10 Спонтанная 1,3 (8) 1,3 (16) 1,3 (8) 1,8 (8)
ЛПС-стимулированная 8,5 (8) 6,1 17,7 (16) 6,2 12,2 (8) 5,7 22,3 (8)* 7,2
ИФН-у Спонтанная 134 (5) 59 (7) 89,5 (4) 34 (3)*
ЛПС-стимулированная 326 (5) 2,5 54 (7)* 1,1* 80,5 (4)* 1,3* 38 (3)* 1,1*
ИЛ-18 Спонтанная 16,9 (5) 24,4 (9) 34,4 (6)* 8,1 (3)*#
ЛПС-стимулированная 27,3 (5) 1,6 35,8 (9) 1,4 53,3 (6) 1,5 8,6 (3)* # 1,0
Примечание: представлены медианные значения спонтанной и Л ПС-стимулированной продукции цитокинов в 24-часовых культурах Мф (0,05 х 10бМф/лунку) здоровых доноров и больных туберкулезом легких.
Сахно Л.В. и др. Дисфункции макрофагов, генерированных из моноцитов крови больных... / с. 101—108
Таблица 4
Аллостимуляторная активность Мф здоровых доноров и больных туберкулезом легких
Пролиферация (имп/мин) Здоровые доноры (п = 14) Больные туберкулезом
В целом по группе (п = 27) Подгруппа 1 (п = 21) Подгруппа 2 (п = 6)
Спонтанная 725 ± 98 650 ± 70 700± 90 505 ± 50
Алло-СКЛ 15 050 ± 3090 8520 ± 1280* 9630 ± 1490 4650 ± 1870*- #
ИВМф 20,2 ± 3,7 12,2 ± 1,5* 13,7 ± 1,7 7,3 ± 2,5*’ #
Примечание: мононуклеарные клетки доноров (0,1 х 106/лунку) культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах в отсутствие (спонтанная пролиферация) и в присутствии аллогенных Мф здоровых доноров или больных туберкулезом в соотношении 10:1 (алло-СКЛ); * — отличие от соответствующего показателя в группе доноров достоверно при р( < 0,05, # — отличие от соответствующего показателя в подгруппе 1 достоверно при ри < 0,05.
рируемые из моноцитов крови больных туберкулезом, характеризуются рядом фенотипических и функциональных изменений, которые также четко ассоциируются со сниженным антиген-специфическим ответом на ППД и проявляются низкой экспрессией ко-стимуляторных молекул (СБ86, НЬЛ-БЯ), дисбалансом спонтанной и ЛПС-стимулированной продукции провоспа-лительных (ИФН-у, ИЛ-18) и противовоспали-тельных/иммуносупрессорных цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-10), а также снижением аллостимуляторной активности.
Как правило, ИФН-у продуцируют Т-лимфоциты и NK-клетки, но отдельные публикации так же, как и полученные нами данные, свидетельствуют о возможности синтеза ИФН-у самими макрофагами [16, 17]. Вероятно, в этом случае ИФН-у может выступать в качестве аутокринного фактора, стимулирующего функциональную активность макрофагов.
Известно, что уничтожение внутриклеточных микроорганизмов реализуется с вовлечением Т-хелперных клеток 1-го типа (ТЫ-клеток), в то время как элиминация внеклеточных патогенов осуществляется с участием ТЬ2-клеток. Поэтому факторы, которые регулируют поляризацию иммунных реакций, являются определяющими для формирования адекватного иммунного ответа по ТЫ- или ТИ2-направлению. В этом контексте обнаруженный нами дефект продукции Мф таких цитокинов, как ИФН-у и ИЛ-18, в сочетании с повышенной продукцией ИЛ-6 и ИЛ-10 может, по-видимому, являться одной из причин нарушения антигенспецифического ответа при туберкулезной инфекции. Действительно, хорошо известно, что секретируемый антиген-презентирующими клетками ИЛ-6 способен вызывать поляризацию наивных СБ4+ Т-лимфоцитов в сторону ТИ2, а ИЛ-10 является ингибитором ТЫ-клеток [1, 18, 19]. Снижение экспрессии НЬЛ-БЯ и ко-стимуляторных
молекул в совокупности с усилением продукции иммуносупрессорных цитокинов, очевидно, тесно связано с нарушением антигенпрезентирующей функции Мф, выявленным нами в виде снижения их аллостимуляторной активности в СКЛ.
Согласно данным литературы, Мф обладают функциональной плюрипотентностью и способны не только активировать, но и подавлять Т-клеточные иммунные реакции. Причем наличие той или иной регуляторной активности макрофагов отчасти определяется особенностями их активации [4, 20]. Например, супрессорную активность Мф связывают с их альтернативной активацией в присутствии ТИ2-цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-13) или ма-крофагального колониестимулирующего фактора. Фенотипическим признаком альтернативно активированных макрофагов является низкая экспрессия антигенов НЬЛ-БЯ и СБ86, а функциональной особенностью — усиление продукции противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10, ТРФ-р) и снижение антигенпрезентирующей функции [4, 20]. Мф, полученные из моноцитов крови ППД-анергичных больных, по своим характеристикам очень схожи с альтернативно активированными макрофагами, поскольку также низко экспрессируют антигены НЬЛ-БЯ и СБ86, характеризуются повышенной продукцией ИЛ-6, ИЛ-10 и низкой аллостимуля-торной/антигенпрезентирующей активностью в СКЛ. При этом отсутствие указанных дисфункций у макрофагов больных с сохранным ответом на ППД позволяет предположить наличие взаимосвязи между изменением свойств Мф и нарушением антигенспецифического Т-клеточного ответа при туберкулезной инфекции.
Обычно причины нарушения функций макрофагов при туберкулезной инфекции обсуждают в контексте непосредственного влияния на них микобактерий и/или их антигенов [1, 21]. Проведенные нами исследования показали, что дефект
макрофагов может быть обусловлен не только прямым воздействием микобактерий, но и генерацией иммуносупрессивных (альтернативно активированных?) макрофагов из моноцитов, которые рекрутируются в очаг туберкулезной инфекции из периферической крови больного.
Заключение
Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы.
1. Снижение экспрессии ко-стимуляторных молекул (CD86) и антигенов главного комплекса гистосовместимости II класса (HLA-DR) в культурах макрофагов ППД-анергичных больных и отсутствие указанных изменений у пациентов с сохранным пролиферативным ответом на ППД указывает на нарушение дифференцировки/со-зревания макрофагов у больных с дефектом анти-генспецифического ответа.
2. Макрофаги, генерированные из моноцитов крови больных со сниженным антигенспецифиче-ским ответом, характеризуются нарушением анти-генпрезентирующей и цитокинсекретирующей функций, что подтверждается усилением спонтанной продукции ИЛ-6 и ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-10, а также снижением аллостиму-ляторной активности макрофагов.
Список литературы
1. Giacomini E., Iona E., Ferroni L. et al. Infection of human macrophages and dendritic cells with Mycobacterium tuberculosis induces a differential cytokine gene expression that modulates T-cell response // J. Immunol. 2001. 166. (12). 7033-7041.
2. Van Crevel R., Ottenhoff T.H.M., van der Meer J. W.M. Innate immunity to Mycobacterium tuberculosis // Clin. Microbiol. Rev. 2002. 15. (2). 294-309.
3. Hickman S.P., Chan J., Salgame P. Mycobacterium tuberculosis induces differential cytokine production from dendritic cells and macrophages with divergent effects on naive T-cell polarization // J. Immunol. 2002. 168. (9). 4636-4642.
4. Verreck F.A., de Boer T., Langenberg D.M. et al. Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. 101. (3). 4560-4565.
5. Noss E.H., Pai R.K., Sellati T.J. et al. Toll-like receptor 2-dependent inhibition of macrophage class
II MHC expression and antigen processing by 19-kDa lipoprotein of Mycobacterium tuberculosis // J. Immunol. 2001. 167. (2). 910-918.
6. Pieters J., Gatfield J. Hijacking the host: survival of pathogenic mycobacteria inside macrophages // Trends Microbiol. 2002. 10. (3). 142-146.
7. Singh B., Singh G., Trajkovic V., Sharma P. Intracellular expression of Mycobacterium tuberculosis-specific 10-kDa antigen down-regulates macrophage B7.1 expression and nitric oxide release // Clin. Exp. Immunol. 2003. 134. (1). 70-77.
8. Stenger S., Niazi K.R., Modlin R.L. Down-regu-lation of CD1 on antigen-presenting cells by infection with Mycobacterium tuberculosis // J. Immunol. 1998. 161. (7). 3582-3588.
9. Сахно Л.В., Тихонова М.А., Кожевников В.С. и др. Фенотипическая и функциональная характеристика моноцитов у больных туберкулезом легких // Мед. иммунол. 2005. 7. (1). 49—5б.
Sakhno L.V., Tihonova M.A., Kozhevnikov V.S. et al. The phenotype and function of monocytes in patients with pulmonary tuberculosis // Med. immunol. 2005. 7. (1). 49—56.
10. Сахно Л.В., Леплина О.Ю., Тихонова М.А. и др. Характеристика дендритных клеток, генерируемых в присутствии интерферона-а, у больных туберкулезом легких // Пробл. туберкулеза и болезней легких. 2007. (3). 42—46.
Sakhno L. V., Leplina O.Yu., Tihonova M.A. et al. Characteristics of а-interferon-generated dendritic cells in patients with pulmonary tuberculosis // Probl. tu-berkuleza i boleznei legkikh. 2007. (3). 42—46.
11. Fietta A., Meloni F., Francioli C. et al. Virulence of Mycobacterium tuberculosis affects interleukin-8, monocyte chemoattractant protein-1 and interleukin-10 production by human mononuclear phagocytes // Int. J. Tissue React. 2001. 23. (4). 113—125.
12. Pereira C.B., Palaci M., Leite O.H. et al. Monocyte cytokine secretion in patients with pulmonary tuberculosis differs from that of healthy infected subjects and correlates with clinical manifestations // Microbes. Infect. 2004. 6. (1). 25—33.
13. Сахно Л.В., Тихонова М.А., Курганова Е.В. и др. Т-клеточная анергия в патогенезе иммунной недостаточности при туберкулезе легких // Пробл. туберкулеза и болезней легких. 2004. (5). 23—28.
Sakhno L.V., Tihonova M.A., Kurganova E.V. et al. T-cellular anergy in the pathogenesis of im-mundeficiency in pulmonary tuberculosis // Probl. tu-berkuleza i boleznei legkikh. 2004. (5). 23—28.
14. Сахно Л.В., Хонина Н.А., Норкина О.В. и др. Участие оксида азота в развитии туберкулиновой анергии у больных туберкулезом легких // Пробл. туберкулеза и болезней легких. 2001. (8). 42 —46.
Sakhno L.V., Khonina N.A., Norkina O.V. et al. Involvement of nitric oxide in the development of tuberculin anergy in patients with pulmonary tuberculosis // Probl. tuberkuleza i boleznei legkikh. 2001. (8). 42—46.
15. Черных Е.Р., Сахно Л.В., Хонина Н.А. и др. Субпопуляционная принадлежность Т-клеток, подверженных анергии и апоптозу у больных туберкулезом легких // Пробл. туберкулеза и болезней легких. 2002. (7). 43—48.
Chernykh E.R., Sakhno L. V., Khonina N.A. et al. T-cell subsets undergoing apoptosis and anergy in patients with pulmonary tuberculosis // Probl. tuberkuleza i boleznei legkikh. 2002. (7). 43—48.
16. Gessani S., Belardelli F. IFN-y expression in macrophages and it’s possible biological significance // Cytokine Growth Factor Rev. 1998. 9. 117—123.
17. Munder M., Mallo M., Eichmann K., Modo-lell M. Murine macrophages secrete interferon gamma upon combined stimulation with interleukin (IL)-12 and IL-18: a novel pathway of autocrine macrophage activation // J. Exp. Med. 1998. 187. 2103-2108.
18. Geijtenbeek T.B., van Vliet S.J., Koppel E.A. et al. Mycobacteria target DC-SIGN to suppress dendritic cell function // J. Exp. Med. 2003. 197. (1). 7-17.
19. Rincon M., Anguita J., Nakamura T. et al. Interleukin (IL)-6 directs the differentiation of IL-4-pro-ducing CD4+ T-cells // J. Exp. Med. 1997. 185. (3). 461-469.
20. Gordon S. Alternative activation of macrophages // Nat. Rev. Immunol. 2003. 3. (1). 23—35.
21. Ильинская А.Н., Пичугина Л.В., Олифе-рук Н.С., Пинегин Б.В. Сравнительная оценка некоторых функциональных изменений при стимуляции PPD макрофагов и дендритных клеток, полученных из периферической крови здоровых доноров // Иммунология. 2006. 4. 209—211.
Il’inskaya A.N., Pichugina L.V., Oliferuk N.S., Pinegin B. V. Comparative estimation of some functional changes of PPD-stimulated macrophages and dendritic cells, separated from peripheral blood of healthy donors // Immunologiya. 2006. (4). 209—211.
DYSFUNCTIONS OF MACROPHAGES, GENERATED FROM BLOOD MONOCYTES OF THE PATIENTS WITH PULMONARY TUBERCULOSIS
Luydmila Vasil’evna SAKHNO1, Marina Aleksandrovna TIKHONOVA1, Sergey Danilovich NICONOV2,
Oleg Aleksandrovich ZHDANOV2, Aleksandr Anatolievich OSTANIN1, Elena Removna CHERNYKH1
1Institute of Clinical Immunology SB RAMS 630099, Novosibirsk, Yadrintsevskaya st., 14
2Novosibirsk Clinical Tubercular Hospital № 1 630082, Novosibirsk, Vavilova st., 14
The phenotype and functional properties of macrophages, generated from peripheral blood monocytes of healthy donors and patients with pulmonary tuberculosis with or without PPD-anergy, were investigated. It was revealed that macrophages of PPD-anergic patients were characterized by decreasing of CD86+ and HLA-DR+ cells, by shifting of Th1/Th2 cytokines balance (down-production of IFN-gamma, IL-18 and up-production of IL-6, IL-10), and by reducing of allostimulatory activity in mixed lymphocyte reaction. Our data allow proposing that macrophage dysfunctions in patients with pulmonary tuberculosis are associated with decrease of antigenspecific T-cell response to M. tuberculosis.
Key words: macrophages, cytokines, allostimulatory activity, pulmonary tuberculosis.
Sakhno L.V. — candidate of biological sciences, senior researcher of laboratory of cellular immunotherapy, e-mail: ct_lab@mail.ru
Tikhonova M.A. — candidate of biological sciences, senior researcher of laboratory of cellular immunotherapy, e-mail: ct_lab@mail.ru
Nikonov S.D. — doctor of medical sciences, professor, head of department of blood gravitational surgery, e-mail: sibnovomed@mail.ru
Zhdanov O.A. — physician of intensive care medicine, e-mail: sibnovomed@mail.ru Ostanin A.A. — doctor of medical sciences, professor, head of clinical department, e-mail: ct_lab@mail.ru Chernykh E.R. — doctor of medical sciences, professor, head of laboratory of cellular immunotherapy, e-mail: ct lab@mail.ru
