CC BY
10
мембраны, можно косвенно сделать вывод о возможном неблагоприятном влиянии их на оплодотворяющую способность спермы мужчин, работающих в цехе окраски. Однако данное предположение нуждается в дальнейшем исследовании и клиническом подтверждении.
Полученные данные свидетельствуют о высокой информативности, простоте и доступности предлагаемого метода определения суммарной токсичности ксенобиотиков производственной среды в отношении биологических объектов и позволяют рекомендовать его -в качестве скринингового при проведении
токсикологических исследований.
Установленный нами эмбриотоксический эффект вредных веществ, находящихся в воздухе рабочей зоны цеха окраски автомобилей, дает основание для разработки рекомендаций о запрещении труда женщин репродуктивного возраста на окрасочных работах.
ЛИТЕРАТУРА
1. Еськов А. П., Каюмов Р. И., Лужецкий А. С. и др. // Гиг. и сан.— 1985.—№ 1.—С. 62—64.
2. Количественный экспресс-метод оценки токсичности полимеров с использованием клеточного тест-объекта: Метод, рекомендации / Каюмов Р. И. и др.— М., 1986.
3. Кунин М. А. Бесплодие в браке.— М., 1973.
4. Милованов В. К. Биология воспроизведения и искусственное осеменение животных.— М., 1962.
5. Порудомский И. М. Половые расстройства у мужчин.— М., 1968.
Поступила 17.04.90
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1991 УДК 615.916/.917.099.015.4.076.7
Г. М. Лахонина, И. С. Ирлина, С. Н. Этлин
ОСОБЕННОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ КУЛЬТУРЫ ИНФУЗОРИЙ В
ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
НИИ профилактической медицины Минздрава Эстонской ССР, Таллинн; Институт цитологии АН СССР, Ленинград
Актуальность проблемы ускоренного изучения токсичности химических веществ обусловливает необходимость поиска биологических объектов среди низших эукариот, которые чувствительны к тем же химическим веществам, что и высшие животные, но позволяют в короткие сроки и с небольшими затратами получать определенную информацию о действии этих веществ, экстраполируя выявленные эффекты на высших животных. Одним из таких объектов служат инфузории тетра-химены,- работы с которыми ведутся как в нашей стране [1, 2, 4, 5], так и за рубежом [6—9].
Не останавливаясь в данной статье на таких важных и все еще дискуссионных вопросах, как возможная область применения простейших организмов в токсикологических исследованиях, допустимость экстраполяции на высшие организмы результатов, полученных в опытах на инфузориях, и т. д., мы опишем некоторые методические особенности проведения исследований с инфузориями тетрахименами (Те1:га11утепа руп-(оггшб), используя при этом в основном свой многолетний опыт работы с данным объектом.
Инфузории культивируют в стерильных условиях. В этой связи одной из важных задач является предотвращение загрязнения культуры, что может быть достигнуто, если придерживаться схемы пересевов в трех линиях.
Линия 1: в пробирки со средой (10 мл 0,05 М фосфатного буфера рН 6,4 с двумя кусочками по 1 см3 печени крыс или мышей) засевают по 0,1 мл 2—3-суточной культурой с плотностью (1 —1,5)-105 клеток в 1 мл [3].
На печеночной среде культура развивается медленнее, с меньшей скоростью размножения клеток, а длительные интервалы между пересевами уменьшают риск загрязнения. Линия 1 — «музей», предназначена для длительного хранения всех имеющихся в лаборатории штаммов тетрахимен.
Линия 2 является резервной культурой для проведения опытов с определенным штаммом, ведется на той же среде, на которой выполняются опыты.
Линия 3 — культура, которую непосредственно используют в опыте. Желательно возобновлять линию 3 от линии 2 не реже одного раза в месяц. В случае бактериального или грибкового заражения культур линий 2 и 3 их ликвидируют, а от линии 1 возобновляют культуры линии 2, а затем линии 3. Если произойдет заражение линии 1, то тетрахимен переводят на «рабочие» среды: аминопептидную или глюкозную [3], куда добавляют антибиотики: стрептомицин, пенициллин, полимик-син (в случае грибкового заражения). Поскольку оценка действия антибиотиков выражается в единицах активности, то
необходимо знать, сколько миллиграммов антибиотика содержится во флаконе с известным количеством единиц активности. Например, 1 мл пенициллина содержит 1600 ЕД активности; значит, во флаконе, где 200 000 ЕД активности, содержится 125 мг пенициллина. Содержимое флакона разбавляют в 10 мл стерильной дистиллированной воды, из флакона стерильным шприцем со стерильной иглой берут 0,01—0,02 мл раствора и переносят в пробирку с 5 или 10 мл культуральной среды. Так, путем последовательного разбавления достигают нужной слабой концентрации, не летальной для инфузорий, которая не должна превышать 150 мкг/мл. Тетрахимены ежедневно в течение 4—5 сут переносят в свежую пробирку с антибиотиками. Наличие или отсутствие заражения контролируют под микроскопом и путем посева на среду Китта — Тароцци, глюкозный бульон, тиогликолевую среду, агар Сабу-ро и кровяной агар. После очистки антибиотиками культуру рекомендуется использовать в опытах только после нескольких пассажей .на культуральной среде без антибиотиков.
Необходимым условием успешного тестирования является воспроизведение результатов от опыта к опыту. Это достигается только однородностью культуры, т. е. клетки в культуре должны находиться в более или менее одинаковом физиологическом состоянии. Известно, что в своем развитии культура тетрахимен проходит лаг-фазу (отсутствие деления), экспоненциальную фазу (интенсивное размножение инфузорий), фазу замедленного размножения при переходе от экспоненциальной к стационарной фазе, стационарную фазу и фазу «упадка». Наш опыт работы с культурой по тестированию токсичности и обеспечению при этом воспроизводимых результатов показывает, что оптимальной является работа с культурой в возрасте от 18 до 24 ч при плотности ее в момент тестирования от 5—7 до 10-104 клеток в 1 мл. Именно в этот период своего развития культура находится в экспоненциальной фазе роста, инфузории в культуре чувствительны к тестируемым веществам. Работа с одним и тем же веществом на разных фазах роста культуры (т. е. с инфузориями в различном физиологическом состоянии) даст в опыте разные результаты, которые потом будет трудно интерпретировать.
Синхронизация культуры тепловыми шоками или физическим отбором делящихся клеток под бинокуляром необходима и плодотворна скорее для специальных научных исследований и малоэффективна при масштабном тестировании токсичности.
При проведении исследований следует учитывать, что оптимальной для жизнедеятельности инфузорий является сре-
да, имеющая рН 6,5—7,0. При рН 4,0 и 8,5 отмечается гибель до 50 % тетрахимен, а при рН 3,0 и 9,7 — соответственно до 100 и 70%, причем в среде с рН 3,0 100% гибель инфузорий наступает в течение 30 мин после посева. Учитывая, что многие вещества способны влиять на рН питательной среды, контроль рН необходимо осуществлять на всех этапах проведения опытов по изучению токсичности веществ [3].
В токсикологических исследованиях, используя в качестве критерия оценки токсичности веществ задержку роста культуры инфузорий, учет результатов рекомендуют проводить через 18—20 ч экспозиции с исследуемым веществом. Мы в своих опытах обычно применяем примерно такую же (18—24 ч) продолжительность экспозиции, так как чем длительнее исследование, тем больше вероятность испарения исследуемого вещества из культуральной жидкости, а при меньшей продолжительности исследований обычно нарастание плотности культуры недостаточно велико, что затрудняет учет результатов.
Между количеством инфузорий, внесенных при посеве и выросших через сутки, имеется прямая корреляция: при культивировании в колбах г=0,84, в пробирках г=0,63. При отсутствии в среде токсичных веществ или других неблагоприятных воздействий на культуру через 24 ч после посева количество простейших, внесенных на 1 мл питательной среды, увеличивается при культивировании в пробирках приблизительно в 13—14 раз. Обычно при посеве мы вносим около 20 тыс. инфузорий на 10 мл питательной среды, т. е. исходная плотность в пробирке устанавливается в пределах 2000 особей/мл.
Для повышения плотности культуры инфузорий при изучении их биологических свойств используют аэрацию культуры воздухом. В токсикологических исследованиях этот метод применим, если изучают нелетучие вещества, например микроэлементы. В то же время пропускание газов через культуру, видимо, может быть одним из методов их токсикологического исследования. Так, пропуская через культуру инфузорий отработанные газы двигателя автомобиля, мы наблюдали разную степень задержки роста культуры в зависимости от условий прокачки газа. Но к таким исследованиям, на наш взгляд, надо подходить весьма критично, так как остается открытым, например, вопрос о том, какие компоненты прокачиваемых смесей и в каком количестве были поглощены питательной средой, а какие и сколько прошли через нее и т. д.
В заключение необходимо отметить, что в целом инфузории просты в культивировании и методы работы с ними как с тест-объектом могут быть реализованы в любой санэпидстанции, где имеется бактериологическая лаборатория. Уже сейчас имеются методические разработки, позволяющие использовать инфузорий тетрахимен для ускоренного ориентировочного определения токсичности химических веществ [3, 4] ^и вытяжек из полимерных материалов [4]. Дальнейшие исследования, вероятно, дадут возможность в большей мере конкретизировать роль и место, а также .установить наиболее, целесообразную область применения биологических тест-объ-ектов, в том числе и инфузорий тетрахимен, в токсикологических исследованиях.
Литература
1. Игнатьев А. Д., Шаблий В. #. Использование инфузорий тетрахимена пириформис как тест-объект при биологических исследованиях в сельском хозяйстве.— М., 1978.
2. Корнеева Н. А. // Ускоренное прогнозирование отдаленных проявлений реакции живых систем на химические воздействия.—Рязань, 1983.—С. 50—52.
3. Ускоренная ориентировочная оценка токсичности веществ с использованием в качестве тест-объекта инфузорий тетрахимен: Метод, рекомендации.— Таллинн, 1988.
4. Ускоренный способ определения токсичности химических веществ и вытяжек из полимерных материалов: Метод, рекомендации.— Минск, 1982.
5. Этлин С. Н., Лахонина Г. М., Ирлина И. С. и др. // Гиг. и сан.— 1987.—№ 9.—С. 80—82.
6. Hutner S. И. // The Biology of Tetrahymena.— Strousberg PA, Dowden, 1973.—P. 411—433.
7. Shultz T., Wayne, Moulton B. A. // QSAR Environ. Toxicol. Proc. Workshop Quant. Struct.— Activ. Relat. Environ. Toxicol.—Dordrecht, 1984.—P. 337—352.
8. Wilkins M., Mcardle E. // Trans. Amer. Microbiol. Soc.— 1980.—Vol. 99, N 2.— P. 232.
9. Yoshioka Yoshitada, Ose Yoiiki, Sato Takahiko // Sei. Total. Environ.— 1985.—Vol. 43, N 1—2.—P. 149—157.
i ê « • "^^íe^^lds Щ - - ' W * : * ' •
Поступила 22.11.89
© Ф. М. ФАЗЛИЕВА, Н. Н. ДРЮЧИНА, 1991 УДК 614.7:615.917.099]-092.9-074
Ф. М. Фазлиева, Н. Н. Дрючина ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕНАЗОЛА II В ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
НИИ санитарии, гигиены и профзаболеваний Минздрава Узбекской ССР, Ташкент
Д. Ж у уг г • V .. • ' . ^' * . ! г I % : у • , • • . 4 е / 1 Ч
_ * > Р| .'4 ' * \ I. Л -»-. . - | ^ " ;* г » 1 <Ц • *у • _х -•« • 1 . • , л * \ • ■ , . •*' • в , Г'. г ш- • . _ •
Беназол II (тинувин II) используют как светостабилизатор полистирола, поливинилхлорида, полипропилена, ацетата целлюлозы, полиамидных волокон, лакокрасочных покрытий на основе перхлорвиниловых смол и термостабилизатор полиамидов.
Действующее вещество препарата — 2-(2'-гидрокси-5'-ме-тилфенил)бензтриазол.
Химически чистое вещество представляет собой кристаллический порошок бледно-желтого цвета, молекулярная масса 225,22, содержание основного вещества 98—100 %; растворим в ацетоне, бензоле, ксилоле, хлороформе, водных растворах щелочей. Температура плавления 129 °С. Агрегатное состояние в воздухе — аэрозоль. Препарат относится к группе гетероциклических соединений ароматического ряда.
Получают беназол II диазотированием о-нитроанилйна, сочетанием полученного диазосоединения с п-крезолом и последующим восстановлением.
Имеются единичные источники литературы [1, 4, 5], описывающие токсикологические свойства беназола II. Наши исследования показали, что беназол II относится к группе малоопасных соединений [2, 3]. Поскольку в литературе нет
сведений о методах определения беназола II, целью настоящей работы являлась разработка метода определения данного соединения в объектах окружающей среды — возХухе, воде, почве.
Метод основан на извлечении действующего вещества препарата из исследуемой пробы органическим растворителем (ацетоном). Идентификацию и количественный анализ беназола II осуществляли методом газожидкостной хроматографии на хроматографе, снабженном детектором по захвату электронов. Хроматографирование проводили на стеклянной колонке длиной 1,5 м с внутренним диаметром 3 мм, заполненной хроматоном-Ы-Бирег (0,16—0,20 мм). В качестве газа-носителя использовали азот, расход котопого равен 40 мл/мин. Расход воздуха 300 мл/мин. Температуре испарителя 250 °С, термостата колонок 200 °С, рабочая шкала электрометра 2» Ю-10 а, скорость диаграммной ленты 240 мм/ч, время удерживания 3 мин 36 с. Подготовку проб к анализу проводят в зависимости от характера изучаемого объекта.
Воздух. Воздух со скоростью 10 л/мин аспирируют в течение 30 мин через фильтродержатель с фильтром «синяя лента». Фильтр переносят в стакан и экстрагируют беназол II
