CC BY
8
рить. Кто-то бросил совсем курить, кто-то сократил количество выкуриваемых сигарет.
Во время проведения третьего Дня без сигарет 24 сентября 1989 г. состоялся Всесоюзный семинар-совещание специалистов научных учреждений и практического здравоохранения по проблеме «Курение и здоровье». Он был организован по инициативе Минздрава СССР., Минздрава БССР, ВНИЦ профилактической медицины и Мозырского городского центра здоровья. В работе семинара-совещания приняли участие специалисты из Госкомитета СССР по народному образованию, ВНИЦ профилактической медицины Минздрава СССР, Всесоюзного онкологического центра АМН СССР, Каунасского НИИ физиологии, патологии сердечно-сосудистой системы им. 3. Янушкявичуса, ряда республиканских, областных и городских центров здоровья. Семинар-совещание предоставил возможность обмена мнениями и опытом между специалистами научных организаций и учреждений практического здравоохранения по вопросам дальнейшего совершенствования методов и средств антитабачной пропаганды. Были налажены рабочие контакты между научными учреждениями и центрами здоровья, необходимые для осуществления бу-
« • ^ . ' > ■ —• —- "■»""*•< ' ' * • Га р.*
дущей программы по преодолению курения. По единодушному мнению участников совещания, праздники здоровья под девизом «День без сигарет» призваны сыграть важную роль в программах борьбы с курением.
Всемирная организация здравоохранения призвала ежегодно 31 мая проводить Всемирный день без табака. Учитывая, что в это время учащаяся молодежь готовится к экзаменам и ее трудно привлечь к данному мероприятию, мы предлагаем проводить «День без табака» у нас в стране в конце сентября или 7 апреля.
Литература
1. План действий по борьбе с потреблением табака / ЕиИ/ИС, 37/7.—Женева, 1988.
2. 5-летний план действия. Европа без табачного дыма! — Копенгаген, 1988.
3. Табак или здоровье? Женева, 1987.
Поступила 11.12.89
Методы исследования
6. И. ЛИНЕВА, В. И. КАРНАУХ, 1991
. А • > 4 ' , У; Ч
» % • ч * • • ^ # • * ■ С® ♦ •
УДК 6)8.33-02:613.632|-07
О. И. Линева, В. И. Карнаух
СКРИНИНГ-МЕТОД ОЦЕНКИ ВЛИЯНИЯ КСЕНОБИОТИКОВ НА
РЕПРОДУКТИВНУЮ ФУНКЦИЮ
Куйбышевский медицинский институт им. Д. И. Ульянова
Изучение влияния различных производственных факторов на организм работающих женщин и их потомство — актуальная социальная и медицинская проблема. Пренатальную токсичность промышленных вредных веществ оценивают, как правило, путем проведения эпидемиологических исследований, постановки эксперимента на лабораторных животных и определения концентрации химических веществ в биосредах. Эти методы достаточно трудоемки и длительны, требуют больших материальных затрат, а при наличии комплекса токсичных веществ в рабочей зоне малоинформативны.
Проведенные нами клинические и эпидемиологические исследования выявили неблагоприятное влияние факторов производственной среды цеха окраски автомобилей на состояние здоровья 1275 работниц, в том числе и на их репродуктивную функцию. В качестве контроля было обследовано 240 женщин из числа инженерно-технических работников завода. Обследованные группы сопоставимы по возрасту, стажу и социально-бытовым условиям. У работниц цеха окраски обращает на себя внимание четкая зависимость от стажа развития астеноневротического синдрома, синдрома вегетативно-сосу-дистой дисфункции, периферического ангиодистоничёского синдрома, токсической пангемоцитопении, геморрагического синдрома, нарушений обоняния и слуха, вестибулярных расстройств, частых простудных заболеваний, выявленных у 40 % обследованных. Гинекологические заболевания обнаружены у 59,2 % осмотренных работниц цеха окраски, что в 2 раза превышает заболеваемость в контрольной группе (29,2 %). Из осложнений беременности доминировали гестозы (33,5± ±1,9 %), анемии (36,9±1,9 %), невынашивание беременности (14,3±1,2 %) преимущественно в первом триместре; частота перечисленных осложнений гестации в контрольной группе составила 14±3,6, 19±3,9, 3±1,7 % (р<0,001). Выявленные нами морфологические изменения плаценты, а также сни-
жение уровня плацентарного лактогена, эстриола и прогестерона в крови свидетельствуют о развитии у 50 % беременных работниц первичной и' вторичной фетоплацентарной недостаточности, что клинически подтверждалось увеличением частоты перинатальной смертности, синдрома задержки развития плода и асфиксии новорожденного в 2—4 раза в сравнении с контролем. Учитывая общие социально-бытовые и экологические условия, сопоставимость групп по стажу и возрасту, мы связываем обнаруженные изменения с воздействием производственных факторов.
Гигиенические исследования показали, что воздушная среда цеха окраски загрязняется химическими веществами: хромовым ангидридом, малеиновым ангидридом, формальдегидом, дибутилфталатом, эпихлоргидрином, изопропиловым спиртом, триэтиламином, ксилолом, толуолом, уайт-спиртом, непредельными углеводами, бутилацетатом, двуокисью титана. При выполнении отдельных операций в 20—40 % проб отмечается превышение ПДК ряда веществ в 1,3—22,6 раза. Для суммарной оценки токсичности ксенобиотиков, находящихся в воздухе рабочей зоны, в биосредах у работниц вне и во время гестации, мы разработали скрининг-метод с использованием тест-объекта.
Метод базируется на рекомендациях, касающихся условий хранения и транспортировки спермы животных [4], определения характера подвижности спермиев [5, 3], а также на способе определения токсичности полимерного материала [1, 2]. Тест-объектом служила замороженная в парах жидкого азота гранулированная сперма быка, которую транспортировали и хранили в сосудах Дьюара, наполненных жидким азотом. В качестве биосред исследовали сыворотку крови работниц цеха окраски и контрольной группы как вне, так и во время беременности, экстракты из хориальной ткани, плаценты и тканей плода, сыворотку пуповинной крови новорожденных.
Количество подвижных сперматозоидов (в % к общему числу) в биосредах в зависимости от времени воздействия
ксенобиотиков (Л1±т)
Биосреда (число наблюдении)
Время воздействия, ч
0 1 2
Основная группа
31,24=2,4* 7,44=1,4**
триместре 24,5=1=1,8** 21,2-4-1,2** 19=1=1,4** 6,14-1,1** 1,74-0,6** 1,94=0,8** 0,84=0,4**
Контрольная группа %
40,2=1=2,3 18,84=1,8 2,34= 1,3
триместре 46,84=2,5 46,54-2,7 46,34-2,4 23,74= 1,4 26,84-1,5 25,64-1,6 9,74-0,9 10,34-1,4 10,44-1,6
К
ТОКС
Сыворотка крови небеременных работниц (п=27) Сыворотка крови беременных работниц в первом
("=17)
Экстракт из хориальной ткани (л=7) Экстракт из тканей плода (п—7)
Сыворотка крови небеременных женщин (я=13) Сыворотка крови беременных женщин в первом (лг= 10)
Экстракт их хориальной ткани (п= 10) Экстракт из тканей плода (лг= 10)
0,55=1=0,01 **
0,54=0,02** 0,224=0,01** 0,26+0,01**
0,85±0,04
1,04=0,03 1,34=0,04 1,2=4=0,05
Контрольная среда 199 (/г=11)
Примечание. Одна звездочка — исследования не проводили.
46,34= 1,7
26,5=1= 1,9
9,84=2,6
достоверные различия с контролем при р<0,01, две
то же при р<0,001;
Образцы тканей брали в стерильных условиях, материал хранили в замороженном виде при температуре от —28° до —32 °С в морозильной камере.
За 12—24 ч до постановки опыта ткань растирали в гомогенизаторе и заливали равным объемом питательной среды 199 на среде Хенкса. За 1 ч до начала опыта смесь центрифугировали, а надосадочную жидкость исследовали на токсичность. Весь исследуемый материал в течение эксперимента находился в водяной бане при температуре 37,54=0,5 °С. Каждую гранулу спермы быка размораживали в отдельной пробирке в 0,5 мл среды 199, которая одновременно служила контрольной средой для определения токсичности биосред. Сразу после размораживания спермы содержимое пробирок с целью приготовления маточного раствора сливали в одну пробирку и тщательно перемешивали. После этого 0,1 мл маточного раствора спермы добавляли к 0,3 мл исследуемых биосред.
Подвижность сперматозоидов оценивали путем подсчета под микроскопом при увеличении в 400 раз общего количества спермиев и подвижных семенных нитей в 5 больших квадратах камеры Горяева через каждые 30 мин в течение 3 ч.
На определение токсичности одной пробы затрачивали в среднем 50—60 мин. Всего исследованы 133 пробы. По результатам изучения опытных и контрольных сред строили графики зависимости подвижности сперматозоидов от времени воздействия и высчитывали коэффициент токсичности по формуле:
К
токе
опыт
контр
где 1{
И Г,
опыт - -контр — среднее время потери подвижности сперматозоидов на 50 % от исходной величины в опытных и контрольных образцах. Так, если в начале опыта в исследуемой среде определяется 60 % подвижных спермиев, а через 1 ч — только 30 %, то I равняется 60 мин.
Наиболее информативные результаты исследований представлены в таблице. Было установлено, что подвижность сперматозоидов в сывороточной среде меньше, чем в контрольной питательной среде 199. Коэффициент токсичности для сыворотки крови женщин контрольной группы равен в наших исследованиях 0,85=1=0,04. Следовательно, о степени токсичности сыворотки крови работниц можно судить, имея достоверно более низкие значения показателя.
Ктокс сыворотки крови работниц равен 0,55=4=0,01 (рС
<0,001), причем в начале рабочей смены — 0,75=1=0,02 (р<0,05), а в конце — 0,5=1=0,03 (р<0,001). При анализе токсичности сыворотки в зависимости от стажа работы в цехе установлено, что она была максимальной у работниц со
стажем менее 2 лет за счет несовершенства механизмов адаптации, а также при стаже работы свыше 10 лет, когда развиваются процессы декомпенсации. Однако полученные данные не имеют статистически значимых различий из-за малочисленности наблюдений.
В первом триместре беременности токсичность сыворотки крови у работниц цеха окраски определяли в день производства артифициального аборта через 16—20 ч после пребывания в воздухе рабочей зоны цеха. Ктокс составил 0,5=1=0,02 (р<0,001), что значительно ниже такового у небеременных работниц в начале смены. Этот факт свидетельствует о снижении механизмов обезвреживания и выведения ксенобиотиков из организма женщины во время беременности.
В наших исследованиях изучены в основном биосреды, полученные во время срочных или преждевременных родов. Установлено, что в третьем триместре беременности действие сыворотки крови работниц цеха окраски на тест-объект ничем не отличается от сыворотки женщин контрольной группы. По-видимому, концентрация токсичных веществ в крови беременных работниц через несколько месяцев после выведения последних из зоны контакта недостаточна для выявления их суммарной токсичности с помощью нашей методики.
Важен, по нашему мнению, с теоретических и практических позиций вопрос о проницаемости плацентарного барьера для токсичных веществ и возможности их депонирования в тканях плаценты и плода.
Проведенные нами исследования выявили, что экстракт плаценты и абортусов, полученных у женщин контрольной группы, активизирует подвижность сперматозоидов в пробирке (Ктокс>1), вероятно, за счет присутствия гормонов и биологически активных веществ.
В первом триместре беременности у работниц отмечается высокая токсичность экстрактов хориальной ткани и абортусов (Ктокс равен соответственно 0,224=0,01 и 0,264=0,01). Этот
показатель значительно ниже Ктокс сыворотки крови матери,
что позволяет сделать вывод о достаточно высокой проницаемости плацентарного барьера для ксенобиотиков и возможности депонирования последних в плаценте и тканях плода.
В третьем триместре беременности имеют место аналогичные изменения, что и в опытах с сывороткой крови, т. е. токсичность биосред не отличается от таковой в контрольной группе. Отсутствие каких-либо признаков токсичности биосред при доношенной беременности послужило доказательством нецелесообразности определения токсичности околоплодных вод и молока у работниц цеха окраски.
Учитывая неблагоприятное влияние ксенобиотиков воздушной среды цеха окраски на подвижность сперматозоидов в пробирке, их способность легко преодолевать биологические
мембраны, можно косвенно сделать вывод о возможном неблагоприятном влиянии их на оплодотворяющую способность спермы мужчин, работающих в цехе окраски. Однако данное предположение нуждается в дальнейшем исследовании и клиническом подтверждении.
Полученные данные свидетельствуют о высокой информативности, простоте и доступности предлагаемого метода определения суммарной токсичности ксенобиотиков производственной среды в отношении биологических объектов и позволяют рекомендовать его -в качестве скринингового при проведении
токсикологических исследований.
Установленный нами эмбриотоксический эффект вредных веществ, находящихся в воздухе рабочей зоны цеха окраски автомобилей, дает основание для разработки рекомендаций о запрещении труда женщин репродуктивного возраста на окрасочных работах.
ЛИТЕРАТУРА
1. Еськов А. П., Каюмов Р. И., Лужецкий А. С. и др. // Гиг. и сан.— 1985.—№ 1.—С. 62—64.
2. Количественный экспресс-метод оценки токсичности полимеров с использованием клеточного тест-объекта: Метод, рекомендации / Каюмов Р. И. и др.— М., 1986.
3. Кунин М. А. Бесплодие в браке.— М., 1973.
4. Милованов В. К. Биология воспроизведения и искусственное осеменение животных.— М., 1962.
5. Порудомский И. М. Половые расстройства у мужчин.— М., 1968.
Поступила 17.04.90
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1991 УДК 615.916/.917.099.015.4.076.7
Г. М. Лахонина, И. С. Ирлина, С. Н. Этлин
ОСОБЕННОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ КУЛЬТУРЫ ИНФУЗОРИЙ В
ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
НИИ профилактической медицины Минздрава Эстонской ССР, Таллинн; Институт цитологии АН СССР, Ленинград
Актуальность проблемы ускоренного изучения токсичности химических веществ обусловливает необходимость поиска биологических объектов среди низших эукариот, которые чувствительны к тем же химическим веществам, что и высшие животные, но позволяют в короткие сроки и с небольшими затратами получать определенную информацию о действии этих веществ, экстраполируя выявленные эффекты на высших животных. Одним из таких объектов служат инфузории тетра-химены,- работы с которыми ведутся как в нашей стране [1, 2, 4, 5], так и за рубежом [6—9].
Не останавливаясь в данной статье на таких важных и все еще дискуссионных вопросах, как возможная область применения простейших организмов в токсикологических исследованиях, допустимость экстраполяции на высшие организмы результатов, полученных в опытах на инфузориях, и т. д., мы опишем некоторые методические особенности проведения исследований с инфузориями тетрахименами (Те1:га11утепа руп-(оггшб), используя при этом в основном свой многолетний опыт работы с данным объектом.
Инфузории культивируют в стерильных условиях. В этой связи одной из важных задач является предотвращение загрязнения культуры, что может быть достигнуто, если придерживаться схемы пересевов в трех линиях.
Линия 1: в пробирки со средой (10 мл 0,05 М фосфатного буфера рН 6,4 с двумя кусочками по 1 см3 печени крыс или мышей) засевают по 0,1 мл 2—3-суточной культурой с плотностью (1 —1,5)-105 клеток в 1 мл [3].
На печеночной среде культура развивается медленнее, с меньшей скоростью размножения клеток, а длительные интервалы между пересевами уменьшают риск загрязнения. Линия 1 — «музей», предназначена для длительного хранения всех имеющихся в лаборатории штаммов тетрахимен.
Линия 2 является резервной культурой для проведения опытов с определенным штаммом, ведется на той же среде, на которой выполняются опыты.
Линия 3 — культура, которую непосредственно используют в опыте. Желательно возобновлять линию 3 от линии 2 не реже одного раза в месяц. В случае бактериального или грибкового заражения культур линий 2 и 3 их ликвидируют, а от линии 1 возобновляют культуры линии 2, а затем линии 3. Если произойдет заражение линии 1, то тетрахимен переводят на «рабочие» среды: аминопептидную или глюкозную [3], куда добавляют антибиотики: стрептомицин, пенициллин, полимик-син (в случае грибкового заражения). Поскольку оценка действия антибиотиков выражается в единицах активности, то
необходимо знать, сколько миллиграммов антибиотика содержится во флаконе с известным количеством единиц активности. Например, 1 мл пенициллина содержит 1600 ЕД активности; значит, во флаконе, где 200 000 ЕД активности, содержится 125 мг пенициллина. Содержимое флакона разбавляют в 10 мл стерильной дистиллированной воды, из флакона стерильным шприцем со стерильной иглой берут 0,01—0,02 мл раствора и переносят в пробирку с 5 или 10 мл культуральной среды. Так, путем последовательного разбавления достигают нужной слабой концентрации, не летальной для инфузорий, которая не должна превышать 150 мкг/мл. Тетрахимены ежедневно в течение 4—5 сут переносят в свежую пробирку с антибиотиками. Наличие или отсутствие заражения контролируют под микроскопом и путем посева на среду Китта — Тароцци, глюкозный бульон, тиогликолевую среду, агар Сабу-ро и кровяной агар. После очистки антибиотиками культуру рекомендуется использовать в опытах только после нескольких пассажей .на культуральной среде без антибиотиков.
Необходимым условием успешного тестирования является воспроизведение результатов от опыта к опыту. Это достигается только однородностью культуры, т. е. клетки в культуре должны находиться в более или менее одинаковом физиологическом состоянии. Известно, что в своем развитии культура тетрахимен проходит лаг-фазу (отсутствие деления), экспоненциальную фазу (интенсивное размножение инфузорий), фазу замедленного размножения при переходе от экспоненциальной к стационарной фазе, стационарную фазу и фазу «упадка». Наш опыт работы с культурой по тестированию токсичности и обеспечению при этом воспроизводимых результатов показывает, что оптимальной является работа с культурой в возрасте от 18 до 24 ч при плотности ее в момент тестирования от 5—7 до 10-104 клеток в 1 мл. Именно в этот период своего развития культура находится в экспоненциальной фазе роста, инфузории в культуре чувствительны к тестируемым веществам. Работа с одним и тем же веществом на разных фазах роста культуры (т. е. с инфузориями в различном физиологическом состоянии) даст в опыте разные результаты, которые потом будет трудно интерпретировать.
Синхронизация культуры тепловыми шоками или физическим отбором делящихся клеток под бинокуляром необходима и плодотворна скорее для специальных научных исследований и малоэффективна при масштабном тестировании токсичности.
При проведении исследований следует учитывать, что оптимальной для жизнедеятельности инфузорий является сре-
