CC BY
55DOI: 10.25712/ASTU.2072-8921.2018.03.006 УДК 579:579.873.13(045)
ОСОБЕННОСТИ ПОЛУЧЕНИЯ СИНБИОТИЧЕСКОГО КИСЛОМОЛОЧНОГО ПРОДУКТА НА ОСНОВЕ КОНСОРЦИУМА БИФИДОБАКТЕРИЙ
Е.П. Каменская, М.В. Обрезкова, Е.Е. Базеева
Одним из приоритетных направлений пищевых технологий является создание продуктов, обладающих лечебно-профилактическим и функциональным действием, в частности кисломолочных симбиотических продуктов, сочетающих в себе сложные компоненты направленного действия - пробиотики и пребиотики. Цель работы - исследование взаимодействия штаммов различных видов бифидобактерий для получения на их основе консорциума с новыми биотехнологическими свойствами и создание синбиотического кисломолочного продукта с высоким титром бифидобактерий. Объектами исследований были выбраны штаммы Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium longum 379 М, Bifidobacterium adolescentis МС-42. При оценке качества в работе применяли общепринятые методы исследований. Установлено, что оптимальным соотношением штаммов B. bifidum 791, B. longum 379 М, B. аdolescentis МС-42 в составе комбинированной закваски является 1:1:2. Диско-диффузионным методом проведен анализ устойчивости консорциума к 23 антибиотикам разных поколений и спектров действий. Наибольшая устойчивость отмечена к бета-лактамным антибиотикам, бактерицидная активность которых обусловлена ингибированием синтеза клеточной стенки микроорганизмов. Также изучено влияние различных концентраций пребиотиков полисахаридной природы (пектина и инулина) на изменение количества жизнеспособных клеток бифидобактерий. Показано, что синбиотический кисломолочный продукт на основе подобранного консорциума бифидобактерий с внесением 2,5 % пектина может быть рекомендован для профилактики и коррекции нарушений дисбаланса кишечной микрофлоры, а также поддержания неспецифической резистентности организма.
Ключевые слова: бифидобактерии, штаммы, антибиотики, консорциум, пробиотики, пре-биотики, пектин, инулин, синбиотический кисломолочный продукт, резистентность.
В настоящее время одним из приоритетных направлений в развитии пищевых технологий является создание продуктов функционального назначения, способных оказывать определенное регулирующее воздействие как на организм в целом, так и на его определенные системы и органы. При этом все большую актуальность приобретают работы, связанные с производством синбиотических кисломолочных биопродуктов, сочетающих в себе сложные компоненты направленного действия -пробиотики и пребиотики. Применение син-биотиков является наиболее эффективным путем нормализации микрофлоры кишечника человека, поскольку позволяет не только дополнительно вводить пробиотические микроорганизмы, а также избирательно стимулировать рост и активизировать метаболизм инди-генной микрофлоры, в частности лакто- и бифидобактерий [1, 2].
К наиболее многочисленной группе представителей нормальной микрофлоры кишечника человека относят бифидобактерии, обладающие выраженными пробиотическими
свойствами и большим биотехнологическим потенциалом. Эти бактерии участвуют в синтезе ряда витаминов группы В: В1, В2, В5, В6, В9, витамина К, аминокислот, органических кислот, полисахаридов, оказывают антагонистическое действие по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре, обладают уникальными антимутагенными и иммуностимулирующими свойствами. Именно би-фидобактериям принадлежит ведущая роль в нормализации дисбаланса кишечной микрофлоры и поддержании неспецифической резистентности организма. Поэтому, благодаря своим уникальным свойствам и благотворному влиянию на организм человека в целом, бифидобактерии стали объектом многочисленных исследований [3-5].
Основными принципами биотехнологии бифидосодержащего продукта являются: подбор сырья, селекция микроорганизмов, создание консорциума и набор перспективных би-фидогенных факторов. В качестве основных видов пребиотических соединений для избирательной стимуляции роста и биологической
активности бифидобактерий применяют, аминокислоты, ненасыщенные жирные кислоты, витамины, волокна полисахаридной природы, олигосахариды, растительные и микробные экстракты, пептиды и др. [5-7].
Как известно, включение в продукт сочетания монокультур более эффективно, чем их отдельное использование, поскольку в процессе симбиоза микроорганизмов происходит взаимная стимуляция их роста за счет синтеза различных метаболитов, а также более интенсивная ферментация лактозы до молочной кислоты.
Определение титруемой кислотности закваски и кисломолочного продукта проводили титриметрическим методом [8]. По показателю титруемой кислотности устанавливали количество синтезируемых бифидобактери-ями кислот, образовавшихся кислых солей и свободных кислотных групп, которые в свою очередь влияют на скорость образования сгустка и его консистенцию. Метод основан на нейтрализации продуктов раствором едкого натра в присутствии индикатора фенолфталеина. Активность ферментации определяли по сроку образования сгустка. Определение активной кислотности проводили потенциомет-рическим методом с помощью универсального ионометра ЭВ-74 для определения степени диссоциации белковых веществ и накопления продуктов гидролиза молочного жира под действием кислот, продуцируемых бифидобакте-риями. Степень синерезиса устанавливали по количеству сыворотки, отделившейся при центрифугировании 10 см3 разрушенного сгустка. Количественный учет бифидобактерий проводили на плотной кукурузно-лактозной среде, методом предельных разведений [9]. Органо-лептические показатели определяли после выдерживания проб при температуре плюс 4 °С в течение 20 часов.
Известно, что между различными штаммами бактерий возможен синергизм, поэтому на начальном этапе исследования изучались взаимоотношения данных штаммов в консорциуме. Для этого определяли лучшую комбинацию штаммов бифидобактерий путем срав-
В связи с этим, целью данной работы являлось исследование взаимодействия штаммов различных видов бифидобактерий для получения на их основе консорциума с новыми биотехнологическими свойствами и создание синбиотического кисломолочного продукта с высоким титром бифидобактерий.
Для получения пробиотического микробного консорциума были выбраны следующие штаммы бифидобактерий: Bifidobacterium bifi-dum 791, Bifidobacterium longum 379 М, Bifidobacterium adolescentis МС-42, источники которых приведены в таблице 1.
нения органолептических и биотехнологических показателей их различных соотношений. Для определения сочетаемости штаммов би-фидобактерий в 100 см3 стерильного обезжиренного молока вносили 2 % исследуемой комбинации бифидобактерий с концентрацией клеток не менее 109 КОЕ/см3 и термостатиро-вали до образования сгустка при температуре плюс 37 °С. Параллельно исследовали отдельные монокультуры, входившие в комбинацию. Результаты эксперимента представлены в таблице 2.
Данные таблицы 2 свидетельствуют, что все исследуемые образцы заквасок обладали достаточно хорошими органолептическими и биотехнологическими свойствами. При совместном культивировании исследуемых штаммов бифидобактерий было отмечено, что они не проявляли антогонистической активности по отношению друг к другу. При этом наблюдались симбиотические взаимодействия, которые выражались в сокращении времени ферментации, увеличении количества жизнеспособных клеток, улучшении консистенции и внешнего вида заквасок по сравнению с чистыми культурами. Также, было установлено, что оптимальным соотношением штаммов B. bifidum 791, B. longum 379 М, B. аdolescentis МС-42 в составе комбинированной закваски является - 1:1:2, поскольку данный образец обладал лучшей ферментативной активностью, характеризовался наименьшим отделением сыворотки от сгустка и содержал высокое количество жизнеспособных клеток - 1,6х1010 КОЕ/смз.
Таблица 1 - Источники штаммов бифидобактерий
Штамм бифидобактерий Наименование и производитель препарата
Bifidobacterium bifidum 791 Пробиотик «Бифидумбактерин», ФГУП НПО «Микроген»
Bifidobacterium longum 379 М Жидкий концентрат бифидобактерий, ООО «Пропионикс»
Bifidobacterium adolescentis МС-42 Пробиотик «Биовестин», ООО «Био-Веста»
Таблица 2 - Основные органолептические и биотехнологические характеристики заквасок
Характеристика заквасок
Показатель B. bifidum B. longum B. adoles- Варианты комбинированных заквасок
centis 1:1:1 1:2:1 1:1:2 2:2:1 2:1:2
Консистенция и внешний вид В меру вязкая, сгусток плотный Слабовязкая, сгусток дряблый Слабовязкая, сгусток дряблый Однородная, вязкая, сгусток плотный
Вкус и запах Чистый, кисломолочный
Цвет Молочно-белый, равномерный по всей массе
Активность
фермента- 54±3 47±3 53±3 31±3 30±3 28±3 30±3 31±3
ции, ч
Титруемая кислотность, °Т 60±1 63±2 64±1 75±2 81 ±2 79±2 80±2 76±2
Активная кислотность, ед. рН 4,40±0,1 4,33±0,1 4,16±0,1 4,12±0, 1 3,95±0, 1 3,94±0, 1 3,91 ±0, 1 4,04± 0,1
Количество
жизнеспособных клеток, 2,5*109 4*109 3*109 1,37* 1010 1,25* 1010 1,6* 1010 1,35* 1010 1,3* 1010
КОЕ/см3
Степень си-нерезиса, см3 5,0±0,2 5,4±0,2 6,0±0,1 5,0± 0,1 5,4± 0,1 4,7± 0,1 5,0± 0,2 4,9± 0,1
При производстве синбиотических кисломолочных продуктов функционального и лечебно-профилактического назначения немаловажное значение на этапе подбора культур бифидобактерий в состав заквасок придается такому свойству как устойчивость к антибиотикам.
Из литературных источников известно, что уже в процессе лечения антибиотиками совместное их применение с антибиотикоре-зистентными штаммами микроорганизмов способствует эффективному восстановлению микробиоценоза кишечника. Поэтому на следующем этапе исследования проводился анализ устойчивости консорциума к 23 антибиотикам разных поколений и спектров действий, относящимся к 7 группам антибактериальных препаратов с использованием диско-диффузионного метода [10]. Диффузионные методы определения чувствительности основаны на диффузии антибиотика из носителя в плотную питательную среду и подавлении роста исследуемой культуры в той зоне, где концентрация антибиотика превышает минимальную предельную концентрацию.
Исследуемый консорциум микроорганизмов выращивали на плотной питательной среде ГМК-1, в которую вносили 1 см3 иноку-лята, далее после аппликации бумажных дисков с различными концентрациями антибиоти-
ков в чашки Петри, их инкубировали в термостате в течение суток при температуре плюс 35 °С. После окончания инкубации отмечали образование зон подавления роста исследуемых микроорганизмов вокруг дисков и проводили замеры диаметров зон задержки роста. Результаты исследований приведены в таблице 3.
Из представленных данных таблицы 3 видно, что к 48 % всех изученных антибиотиков консорциум, состоящий из различных штаммов бифидобактерий B. bifidum, B. longum, B. adolescentis в соотношении 1:1:2, оказался устойчивым, а к 13 % имел промежуточный тип устойчивости. Наибольшая устойчивость (к 9 из 10 антибиотиков) была отмечена к бета-лактамным антибиотикам, бактерицидная активность которых обусловлена ингибированием синтеза клеточной стенки микроорганизмов. Устойчивость к антибиотикам у изучаемых штаммов бифидобактерий в составе консорциума, вероятно, обусловлена наличием у них определенных механизмов природной резистентности, например, наличием в плазмиде маркеров устойчивости к антибиотикам, а также специфическими мутационными изменениями белков клеточной стенки и приобретением новой генетической информации в клетках микроорганизмов за счет коньюгационного переноса плазмид.
Таблица 3 - Чувствительность консорциума бифидобактерий к антибиотикам
Название антибиотика Содержание антибиотика в диске, мкг Диаметр зоны ингибирования роста, мм Интерпретация значений
БЕТА-ЛАКТАМЫ
Азлоциллин 75 8 резистентный
Ампициллин 10 - резистентный
Амоксициллин 20 11 резистентный
Амоксициллин и клавулановая кислота 30 8 резистентный
Имипинем 10 18 чувствительный
Цефаклор 30 - резистентный
Бензилпенициллин 10 Ед - резистентный
Оксациллин 1 - резистентный
Цефазолин 30 12 резистентный
Пиперациллин 100 16 резистентный
АМИНОГЛИКОЗИДЫ
Гентамицин 10 20 чувствительный
Стрептомицин 30 28 чувствительный
Неомицин 30 20 промежуточный
Амикацин 30 30 чувствительный
ТЕТРАЦИКЛИНЫ
Тетрациклин 30 20 чувствительный
Доксициклин 30 24 чувствительный
ГЛИКОПЕПТИДЫ
Ванкомицин 30 15 промежуточный
МАКРОЛИДЫ И ЛИНКОЗАМИДЫ
Линкомицин 15 18 резистентный
Олеандомицин 15 21 чувствительный
Эритромицин 15 30 чувствительный
Азитромицин 15 30 чувствительный
НИТРОФУРАНЫ
Фурагин 300 18 промежуточный
ПОЛИМЕКСИНЫ
Полимиксин 300 8 резистентный
Известно, что бифидобактерии, обитающие в желудочно-кишечном тракте, где имеются готовые питательные вещества, в процессе эволюции утратили способность к синтезу первичных метаболитов. Поэтому для активизации их роста и с целью создания кисломолочных продуктов с высоким титром бифидобактерий, особенно при ферментации молока требуется дополнительное внесение различных пищевых добавок с выраженными пребиотическими свойствами. Поэтому в дальнейшей работе было изучено влияние различных концентраций полисахаридов: пектина (2 %, 2,5 %, 3 %) и инулина (2 %, 2,5 %, 3 %) на изменение количества жизнеспособных клеток бифидобактерий. В опытные образцы со стерильным обратом вносили 5 % инокулята комбинированной закваски,
различные концентрации пектина и инулина, а затем инкубировали при температуре плюс 37 °С до появления сгустка. Контролем служил образец без внесения пребиотиков. Динамика роста титра бифидобактерий пробиотического консорциума в присутствии различных концентраций пектина и инулина представлена на рисунке 1.
В ходе исследований было установлено, что внесение в питательные среды на молочной основе, таких пребиотиков как пектин и инулин в концентрациях 2,5 % позволяет максимально стимулировать развитие изучаемого консорциума, что выражается в повышении титра бифидобактерий и сокращении времени ферментации в среднем в два раза.
а) б)
Рисунок 1 - Изменение количества клеток бифидобактерий в процессе ферментации
с пектином (а), с инулином (б)
Таблица 4 - Основные качественные показатели синбиотических кисломолочных продуктов
Показатель Продукт с содержанием пектина 2,5 % Продукт с содержанием инулина 2,5 % Образец без внесения пребиотика
Консистенция и внешний вид Однородная, в меру вязкая, сгусток плотный Жидкая, сгусток дряблый В меру вязкая, сгусток плотный
Вкус и запах Чистый, кисломолочный, без посторонних привкусов и запахов Чистый, кисломолочный, без посторонних привкусов и запахов Чистый, кисломолочный, без посторонних привкусов и запахов
Цвет Светло-кремовый, равномерный по всей массе Молочно-белый, равномерный по всей массе Молочно-белый, равномерный по всей массе
Титруемая кислотность, °T 88±2 68±2 64±2
Активная кислотность, ед^ 5,30±0,1 5,24±0,1 5,20±0,1
Количество жизнеспособных клеток бифидобактерий, КОЕ/см3 3,5*109 2,0*109 1,0*107
На заключительном этапе исследования были получены опытные образцы синбиотиче-ских кисломолочных продуктов с использованием консорциума штаммов B. bifidum 791, B. longum 379 М, B. adolescentis МС-42 в соотношении 1:1:2 и с внесением оптимальных концентраций пребиотиков инулина (2,5 %) и пектина (2,5 %). Основные качественные показатели синбиотических кисломолочных продуктов представлены в таблице 4.
Сопоставляя результаты исследований
органолептических и биотехнологических свойств синбиотических продуктов, включающих в себя пребиотики пектин и инулин в концентрации 2,5 %, можно заключить, что внесение бифидогенных волокон способствует изменению качественных характеристик готового продукта. В частности, в обоих опытных образцах отмечается увеличение на порядок количества клеток бифидобактерий, сокращается время ферментации, и увеличивается показатель титруемой кислотности.
Лучшими органолептическими свойствами обладал образец с пектином. Он имел однородную, в меру вязкую консистенцию и плотный сгусток, в отличие от образца с инулином, в котором консистенция к концу ферментации оставалась жидкой, и образовывались хлопья.
Таким образом, полученный в ходе исследований синбиотический кисломолочный продукт на основе подобранного консорциума бифидобактерий, с внесением 2,5 % пектина, полностью соответствовал требованиям ГОСТ 32923-2014 [11]. Данный напиток обладал высоким титром бифидобактерий, улучшенными потребительскими и биотехнологическими свойствами и может быть рекомендован для профилактики и коррекции нарушений дисбаланса кишечной микрофлоры, а также поддержания неспецифической резистентности организма.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Артюхова, С.И. Использование пробиоти-ков и пребиотиков в биотехнологии производства биопродуктов: монография / С.И. Артюхова, Ю.А. Гаврилова. - Омск: Изд-во ОмГТУ, 2010. - 112 с.
2. Етепнева, Т.В. Исследование возможности использования консурциума пропионовокислых и молочнокислых бактерий в биотехнологии производства синбиотического кисломолочного продукта / Т.В. Етепнева, Е.П. Каменская // Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых с международным участием «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности».- Алт. гос тех. ун-т, БТИ. - Бийск: Изд-во Алт. гос. тех. ун-та, 2013. - С. 410-413.
3. Янковский, Д.С. Получение пробиотически ценных штаммов бифидобактерий / Д.С. Янковский, Г.С. Дымент, Е.П. Потребчук // Здоровье женщины. - 2008. - № 1. - С. 216-222.
4. Базеева, Е.Е. Изучение влияния бифидо-генных факторов на прирост биомассы бифидобактерий / Е.Е.Базеева, Е.П. Каменская // Материалы IX Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых с международным участием «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности». - Алт. гос. техн. ун-т, бТи. -Бийск: Изд-во Алт. гос. техн. ун-та, 2016. - С. 445448.
5. Barascu, E. Growth rate of bifidobacteria in milk supplemented with yeast extract and wheat germs / E. Barascu, M. Iordan, J. Ciumac. - 2007. - № 8. - P. 42-46.
6. Лаптев, С.В. Химия, микробиология и экспертиза молока и молочных продуктов: учебное по-
собие / С.В. Лаптев, Н.И. Мезенцева, Е.П. Каменская. - Бийск: Изд-во Алт. гос. техн. ун-та, 2009. -237 с.
7. Дроздов, Р.А. Оптимизация рецептуры пробиотического кисломолочного напитка с добавлением пищевых волокон топинамбура / Р.А. Дроздов, М.А. Кожухова, Т.В. Бархатова [и др.] // Ползу-новский вестник. - 2016. - № 4. - Т. 2. -С. 4-11.
8. ГОСТ 3624-92 Молоко и молочные продукты. Титриметрические методы определения кислотности. - Введ. 1994-01-01. - М.: Стандартин-форм, 2009. - 7 с.
9. МУК 4.2.999-00. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Определение количества бифидобактерий в кисломолочных продуктах. / Сборник методических документов, необходимых для обеспечения применения Федерального закона от 12 июня 2008 г. № 88-ФЗ «Технический регламент на молоко и молочную продукцию». - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - С. 5568.
10. МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: Методические указания. - М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. - 91 с.
11. ГОСТ 32923-2014 Продукты кисломолочные, обогащенные пробиотическими микроорганизмами. Технические условия. - Введ. 2016-01-01. -М.: Стандартинформ, 2015. - 14 с.
Каменская Елена Петровна, к.б.н., доцент, доцент кафедры технологии бродильных производств и виноделия ФГБОУ ВО «Алтайский государственный технический университет им. И.И. Ползунова», 656038, Россия, г. Барнаул, пр. Ленина, 46, е-mail: ekam2007@yandex.ru, тел.: 8-905-927-2709.
Обрезкова Марина Викторовна, к.т.н., доцент, доцент кафедры биотехнологии Бийского технологического института (филиала) ФГБОУ ВО «Алтайский государственный технический университет им. И.И. Ползунова» (БТИ АлтГТУ), 659305, Россия, г. Бийск, ул. имени Героя Советского Союза Трофимова, 27, е-mail: obrezkova1962@mail.ru, тел.: (3854)43-53-05.
Базеева Евгения Евгеньевна, магистрант кафедры биотехнологии Бийского технологического института (филиала) ФГБОУ ВО «Алтайский государственный технический университет им. И.И. Ползу-нова» (БТИ АлтГТУ), 659305, Россия, г. Бийск, ул. имени Героя Советского Союза Трофимова, 27, е-mail: bazeew@mail.ru, тел.: (3854)43-53-05.
