CC BY
161
Определение сроков возникновения повреждений основывается на известных положениях общей и частной патологической анатомии и судебной медицины, а также на большом многолетнем практическом опыте нашей гистологической лаборатории. В гистологическом отделе ежегодно исследуется большое количество случаев насильственной смерти. Только за 2015 год было проведено 8120 таких исследований. Среди них в 4801 случае стоял вопрос об определении давности и прижизненности повреждений. Это составило 59 % от всех случаев насильственной смерти. Анализу и обобщению подлежат случаи с точно установленными сроками получения травмы. Полученные результаты во многом совпадают с морфологическими критериями, предложенными в монографии «Гистологический и цитологический методы исследования в судебной медицине» (В. Г. Науменко, Н. А. Митяева) по оценке микроскопических изменений в мягких тканях при травме.
Любые повреждения сопровождаются кровоизлияниями. При гистологическом исследовании выявляются и оцениваются реактивные изменения, возникающие в различные сроки посттравматического периода в зоне травматических кровоизлияний.
Суть реактивного процесса заключена в том, что при механическом повреждении тканей и органов организм человека способен отвечать генетически заложенными реакциями, адекватными силе воздействия. Такой реакцией является асептическое воспаление (т.е. протекающее без участия микроорганизмов).
Для определения давности повреждения необходимо использовать наиболее информативные морфологические признаки, для развития которых необходимо определенное время. Такими морфологическими признаками являются клеточные реакции. Одна из первых клеточных реакций - лейкоцитарная, на развитие которой необходимо около часа. В этот период в зоне кровоизлияния и вокруг него в просветах сосудов и периваскулярно определяются скопления лейкоцитов. Со временем интенсивность лейкоцитарной реакции возрастает.
Процесс повреждения всегда сопровождается процессами восстановления. Морфологическим признаком начала восстановительных процессов является макрофа-гальная реакция. Первые макрофаги появляются в лейкоцитарном инфильтрате примерно через 12 часов. После ухода лейкоцитов с поля реактивного воспаления количество макрофагов увеличивается. На вторые-третьи сутки в зоне кровоизлияния определяются фибробласты. Эти клетки в дальнейшем участвуют в процессе организации зоны повреждения.
На 3-4-й день в кровоизлиянии при специальной окраске по Перлсу выявляются положительно окрашенные на железо макрофаги - гемосидерофаги. В их цитоплазме происходит образование железосодержащего пигмента - гемосидерина. Появление в зоне повреждения гемосидерофагов свидетельствует о начале процесса резорбции (рассасывания) кровоизлияния. В последующем окраска цитоплазмы гемосидерофагов становится более интенсивной, формируются внутриклеточные зерна гемо-сидерина. На третьей неделе (на 17-19-й день, по данным Н. А. Митяевой) макрофаг, содержащий пигмент, разрушается и гемосидерин в виде зерен оказывается свободно лежащим в мягких тканях.
Параллельно с процессом резорбции кровоизлияния развивается процесс его организации. Первые морфологические признаки организации выявляются на 4-7-е сутки, когда в зоне повреждения отмечается врастание фибробластов в виде клеточных тяжей, с последующим формированием соединительнотканных волокон.
ВЫВОДЫ
При исследовании препаратов - помимо подробного описания выявленной морфологической картины в мягких тканях с кровоизлиянием - большое значение имеет объективная оценка полученных результатов, отраженная в выводах. При неизвестных обстоятельствах травмы в составлении выводов о давности следует ориентироваться на минимальное время, необходимое для развития выявленного морфологического признака, являющегося критерием определения давности. В некоторых случаях ориентировочное время получения травмы может определяться временным интервалом. Его границами являются: минимальное время, необходимое для развития имеющегося морфологического признака, и время развития следующего морфологического признака, с учетом динамики реактивного процесса.
При известных обстоятельствах, в том числе при проведении комиссионных экспертиз, выявленная микроскопическая картина позволяет подтвердить или опровергнуть время получения травмы, указанное в материалах дела.
ОСОБЕННОСТИ ПОЛУЧЕНИЯ И АНАЛИЗА ДНК ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ, ФИКСИРОВАННЫХ ВФОРМАЛИНЕ(ПОСТЕР)
к.б.н. А.Г. Смоляницкий1, к.б.н. Н. Н. Хромов-Борисов2, А. И. Смоляницкая1
• 1Бюро судебно-медицинской экспертизы
Ленинградской области (нач. - к.м.н., доц.
В. Н. Лебедев)
• 2Российский научно-исследовательский
институт травматологии и ортопедии
им. Р. Р. Вредена (директор - Р. М. Тихилов)
• Аннотация: Выделение и анализ ДНК
из биоматериалов, хранящихся в формалине или в парафиновых блоках, представляют серьезную методическую проблему. Статья посвящена апробации и внедрению в практику судебно-генетических исследований способов обработки таких материалов для получения из них препаратов геномной ДНК, пригодных для энзиматической амплификации. Приведены примеры успешных экспертиз образцов тканей и фрагментов органов, заключенных в парафин или погруженных в формалин, благодаря применению модифицированных методических приемов. Проведен анализ причин, затрудняющих исследования ДНК в таких образцах, и рассмотрены пути их преодоления. Предложен оптимизированный метод пробоподготовки препаратов ДНК из гистологических образцов, тканей и органов, хранившихся в формалине.
• Ключевые слова: экстракция ДНК, гено-типирование гистологических препаратов, формалин, формальдегид
ВВЕДЕНИЕ
Генотипирование объектов биологической природы, находившихся или доставленных на исследование в формалине, - достаточно обычная практика. Ткани и фрагменты органов от трупов доставляются в судебно-хими-ческое и гистологическое отделения в 10 % нейтральном формалине для максимальной защиты материала от гнилостных изменений. Фиксации в формалине подвергаются также ткани перед заключением их в парафиновые блоки. Многочисленными исследованиями показано не-
гативное влияние формалина и его производных на пригодность нуклеиновых кислот к анализу. Основные повреждения ДНК, вызываемые формальдегидом, могут быть классифицированы как следующие: 1) инициация денатурации ДНК вследствие разрыва межцепочечных водородных связей; 2) присоединение к аминогруппам азотистых оснований оксиметильных групп (-CH2OH), приводящее к образованию метиленовых мостиков между соседними основаниями; 3) образование перекрестных сшивок ДНК с гистонами; 4) фрагментация ДНК, образование одноцепочечных разрывов. Для преодоления негативных последствий воздействия формальдегида используется ряд методов, позволяющих получить пригодную к анализу ДНК. Нами проанализированы некоторые из таких приемов и предложены алгоритмы работы с тканями, фиксированными в формалине длительное время.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
При работе с гистологическими блоками -в большинстве стандартных подходов - от парафина освобождаются с применением ряда последовательных обработок ксилолом и этиловым спиртом. Широко распространенная процедура, достаточно затратная по времени, включает вредные для здоровья человека агенты. В предлагаемой нами методике используются такие свойства нуклеиновых кислот, как устойчивость к высокой температуре (100 °C и более) и щелочной среде (pH 11 и выше). Указанные физико-химические условия достигались погружением вырезанного из парафинового блока фрагмента ткани, весом примерно 2-3 мг, в буфер на основе TRIS pH 11 и кипячением на водяной бане в течение 25 минут. После переноса фрагмента ткани в новую пробирку дальнейшие этапы получения ДНК были классическими: обработка в течение 18 часов при 56 °C протеиназой К в присутствии дитиотреитола, фенол-хлороформная экстракция, концентрирование переосаждением изопропиловым спиртом с использованием в качестве соосадителя ацетата аммония. В случае нахождения тканей и фрагментов органов в формалине в депарафинизации биологического материала не было необходимости. Нами были проанализированы некоторые из приемов и найден алгоритм работы с тканями, находившимися долгое время в формалине. Методика заключается в применении специального буфера с глицином, в котором тонкие срезы ткани инкубируются в течение 3 суток. Глицин в данном случае препятствует взаимодействию ДНК с высвобождающимся из ткани формальдегидом, связывая последний. После такой обработки размягченная ткань служила источником для органической экстракции геномной ДНК. Полученные препараты обычно (уже после нескольких часов нахождения в 10 % формалине) представляли собой относительно деградированную ДНК, однако с наличием высокомолекулярных фрагментов. Опыт показывает, что вымачивание ткани в воде или в буфере без добавления глицина не способствует увеличению количества пригодной к амплификации ДНК. Таким образом, при работе с обработанными формалином тканями решаются две основные задачи: добиться максимального выхода ДНК из исследуемого фрагмента биологического материала и одновременно создать условия для нейтрализации освобождающегося формальдегида и его производных. Следует отметить, что на этапе амплификации, достаточно строго стандартизированном в судебной генетике, остается немного возможностей внесения модификаций с целью получения позитивного результата генотипиро-вания поврежденной ДНК. Поэтому основное внимание
нами уделялось этапам предобработки формалинизи-рованных тканей и нейтрализации освобождающегося в процессе лизиса тканей формальдегида.
ВЫВОДЫ
На основании практического опыта работы с биологическими материалами (фрагментами органов и тканей человека), находившимися или доставленными на исследование в формалине, предложена оптимизированная методика получения ДНК, пригодной к дальнейшему мультилокусному фрагментному анализу и секвенирова-нию. Методика включает в себя этапы пробоподготовки формалинизированных тканей и экстракцию геномной ДНК. Предложенные модификации стандартных протоколов повышают эффективность получения ДНК в количественном и качественном аспектах.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ НЕОПОЗНАННЫХ ОСТАНКОВ. ОПЫТ РАБОТЫ ЛЕНИНГРАДСКОГО ОБЛАСТНОГО БЮРОСМЭ
к.б.н. А. Г. Смоляницкий, А. И. Смоляницкая • Бюро судебно-медицинской экспертизы Ленинградской области (нач. - к.м.н., доц. В. Н. Лебедев)
• Аннотация: Статья касается идентификации неопознанных останков с помощью молеку-лярно-генетического анализа. Рассмотрены возможности генотипирования сложных биологических объектов, особенности прямой
и непрямой идентификации. Отмечена необходимость оснащения судебно-генетического подразделения, занимающегося идентификацией неопознанных лиц, широким спектром технологий анализа ДНК.
• Ключевые слова: идентификация, неопознанные тела, ДНК-профиль, скелетированные останки
ВВЕДЕНИЕ
Задача идентификации неопознанных тел, в том числе скелетированных, разрушенных воздействием внешней среды или техногенных факторов, с развитием молеку-лярно-генетической экспертизы получила уникальный инструмент успешного решения. Для целей индивидуализации, как правило, используются генотипы предполагаемых родственников неустановленного лица либо сохранившийся биологический материал пропавшего без вести человека, удовлетворяющего версии дознания. В настоящее время сравнительный анализ ДНК не ограничивается близкими родственниками по вертикали, да и возможности прямого сравнительного анализа биологических материалов значительно выросли. Все большую роль играет установление ряда фенотипических характеристик неопознанного лица по данным, полученным при изучении структуры ДНК. Так, с высокой надежностью определяется цвет волос, радужной оболочки глаз, кожи человека. Анализ определенных последовательностей ядерной и митохондриальной ДНК дает представление об этническом происхождении человека, относя его к одной из 4 расовых групп.
Нами обобщен многолетний опыт идентификационных исследований, проводимых в Ленинградском областном БСМЭ, предложены алгоритмы экспертной работы, намечены основные недостатки и направления взаимодействия с правоохранительными структурами.
