CC BY
464
96
Методы исследований
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГИСТОТЕХНИЧЕСКИЕ РЕШЕНИЯ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПРЕПАРАТОВ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, ВЫДЕЛЕННЫХ
из парафиновых блоков
А.Н. Ваганова
ООО «БиоВитрум», Москва, Россия
Histotechnical solutions for quality improvement of nucleic acid specimens extracted from paraffin blocks
A.N. Vaganova
BioVitrum Ltd, Moscow, Russia
По мере накопления сведений о молекулярной природе ряда заболеваний, встал вопрос о применимости методов молекулярной биологии для исследования гистологического материала. Существующие в настоящее время архивы могли бы предоставить огромное количество материала для ретроспективных исследований, однако наиболее часто используемый фиксатор — формалин, повреждает нуклеиновые кислоты в ткани. Сходная проблема возникает и при работе с материалом, поступающим в патологоанатомические отделения и проходящим общепринятую гистологическую обработку. Особенно актуальным получение качественного препарата нуклеиновых кислот стало в последние годы, с вхождением в практику диагностических методов, основанных на молекулярно-биологическом подходе. Исследования, посвящённые разработке новых методов обработки гистологического материала с одной стороны, и способов выделения нуклеиновых кислот из подвергнутого стандартной обработке материала — с другой выявили ряд путей преодоления проблемы низкого качества препарата нуклеиновых кислот при выделении из парафинового блока. Целью данного обзора является освещение модификаций методов гистологической обработки материала, которые позволяют получить препараты нуклеиновых кислот более высокого качества.
Ключевые слова: гистология, патологическая анатомия, молекулярная биология, ДНК, РНК.
Введение
Фиксация ткани в формалине, проводка согласно тому или иному протоколу и заливка в парафин для последующего изготовления препаратов — общепринятый способ подготовки образцов к гистологическому исследованию. Этот подход позволяет сохранить структуру тканей и хранить материал в течение длительного времени. Архивы, в которых хранятся образцы ткани в виде парафиновых блоков, служат незаменимым источником материала для масштабных ретроспективных исследований, включая исследования с использованием методик, недоступных на момент помещения блока в архив. Сегодня, когда появляется всё больше сведений о молекулярных основах патогенеза различных заболеваний, исследование ДНК и РНК, содержащихся в гистологическом материале, необходимо для научных исследований и становится частью рутинной диагностической практики. Однако оказалось, что качество препарата нуклеиновых кислот, выделенного из образца ткани,
With the growing body of information about molecular nature of a set of diseases, the question of molecular biology techniques acceptability for histological material study came up. Currently available pathology archives could provide vast quantity of material for retrospective studies, however, the most frequently used fixative formalin dramatically damages nucleic acids in the tissue. A similar problem arises with the material that come into the pathology department and undergoing conventional histological processing in nowadays. In recent years with the entry into the practice of diagnostic methods based on molecular biology methods it has become especially important to obtain high-quality samples of nucleic acids. Research devoted to development of new approaches of histological material handling from one side and solutions for nucleic acids extraction from tissue after standard histological treatment on the other side revealed a number of ways to overcome the problem of poor quality of nucleic acids isolated from the paraffin block. The aim of this review is to highlight the modifications histological processing techniques that allow prepare nucleic acids samples of higher quality.
Key words: histology, pathology, molecular biology, DNA, RNA.
который был зафиксирован в формалине и залит в парафин, значительно уступает качеству аналогичного препарата из образца, который немедленно после получения был заморожен [1].
С момента наступления ишемии, когда орган или его фрагмент утрачивает связь с кровеносной системой организма, начинаются процессы деградации нуклеиновых кислот [2]. На содержание нуклеиновых кислот, прежде всего РНК, имеет значительное влияние аутолиз ткани, особенно в первые два часа тепловой ишемии [3]. В тканях, богатых РНК-азами, разрушение РНК протекает особенно интенсивно, это, прежде всего, ткани поджелудочной железы, желчного пузыря, кожи и печени [4, 5]. Чем быстрее ткань будет помещена в формалин, тем раньше будет остановлено аутолитическое разрушение нуклеиновых кислот. Однако воздействие формалина также оказывает негативное влияние на качествобиомолекул. Более подвержена его воздействию одноцепочечная РНК, но, так как формалин иници-
е-mail: [email protected]
Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014
Методы исследований
97
ирует денатурацию ДНК в АТ-богатых регионах, её основания также становятся доступными для химических превращений [6]. МикроРНК, напротив, меньше подвержены повреждению при формалиновой фиксации [7]. Потери РНК при изготовлении парафинового блока традиционным методом можно оценить как 99% [3]. Через два часа фиксации в формалине 40% содержащейся в ней ДНК претерпевает необратимые повреждения. Через сутки в фиксирующем растворе в ткани сохраняется не более 25% содержавшейся в ней ДНК [8].
Таким образом, под воздействием формалина происходят разрывы цепей нуклеиновых кислот, что ограничивает размер исследуемых последовательностей и возможность их амплификации, а также происходит возникновение артефактных мутаций. Для анализа экспрессии в парафиновых блоках путём обратной транскрипции предпочтительно использовать мишени не более 100 п.н. [9]. Сравнительная геномная гибридизация на микрочипе в принципе возможна только при хорошем накоплении ампликонов более 100 п.н. [10], поэтому РНК, выделенная из парафиновых блоков практически непригодна для исследования на микрочипах [11].
Длительное хранение парафинового блока больше влияет на качество РНК, чем ДНК. Основные повреждения РНК, ведущие к снижению её качества, происходят в первый год хранения блока [42]. В архивном блоке продолжается формирование перекрёстных сшивок за счёт сохраняющихся в нём следовых количеств формальдегида. Это один из факторов, приводящих к тому, что архивные блоки становятся твёрдыми, и с ними сложнее работать, чем со свежими блоками [8].
Воздействие формалина на конкретную мишень может зависеть и от её вторичной структуры. Поэтому, в зависимости от мишени, отклонения при фиксации могут быть различными [12]. Краевые последовательности РНК больше повреждаются при фиксации и проводке, чем центральная часть молекулы [2]. Кроме тщательного выбора участка для исследования (центральные регионы РНК, последовательности не более нескольких сотен пар оснований — в случае ДНК), существуют некоторые приёмы, позволяющие улучшить качество препарата нуклеиновых кислот. Добавление большего количества MgCl2 в реакционную смесь при синтезе кДНК на матрице выделенной РНК, повышение содержания олигонуклеотидов случайной последовательности может повысить концентрацию считанной кДНК, однако неизвестно, помогает ли какой-либо из этих подходов решить проблему неравномерного считывания с различных матриц [11]. Более репрезентативный набор кДНК при обратной транскрипции деградировавшей РНК можно получить, используя методику, основанную на использовании транскрипции in vitro и последовательном применении различных праймеров и ферментов [13].
Повысить размер амплифицируемых фрагментов препарата ДНК можно с использованием Taq полимеразы. Для этого проводится инкубация с ферментом при 72°С. В ходе этого процесса происходит репарация небольших повреждений материала, например, гидролитического нарушения структуры цитозина [14, 15].
В этом обзоре будут освещены возможные решения для сохранения качества нуклеиновых кислот
на этапах, предшествующих их выделению из парафинового блока тем или иным способом. Наиболее исследованными аспектами данной проблемы является влияние различных фиксаторов, а также способы подготовки материала к выделению нуклеиновых кислот.
Влияние фиксации на нуклеиновые кислоты
и способы фиксации, щадящие по отношению
к ним
Все фиксаторы можно разделить на денатурирующие (коагулирующие) и образующие перекрёстные сшивки. Фиксатор Буэна приводит как к формированию перекрёстных сшивок, так и к коагуляции белков. Практически все используемые фиксаторы повреждают структуру нуклеиновых кислот, вопрос в том, насколько это воздействие влияет на возможность их дальнейшего исследования. Общепринятая фиксация в формалине и распространённая фиксация в спирте — не самые агрессивные по отношению к нуклеиновом кислотам методы. В частности, при фиксации в жидкости Буэна нуклеиновые кислоты через несколько часов становятся полностью непригодными для исследования [16].
Наиболее распространённым реактивом для фиксации тканей является формалин, в основе действия которого лежит формирование метиленовых мостиков между биомолекулами, то есть их химическая модификация. Его применение для фиксации тканей, для исследования которых планируется использование молекулярно-биологических методов, допустимо, однако он не является оптимальным фиксатором для данной задачи.
Фиксация материала в формалине значительно снижает содержание нуклеиновых кислот в препарате по сравнению со свежим материалом. Оптимальной является длительность фиксации 12—24 ч (в течение ночи). Важно понимать, что и более короткое время фиксации снижает выход нуклеиновых кислот. Крайне нежелательной является фиксация в формалине более 48 ч, после этого периода отмечаются значительные потери нуклеиновых кислот, прежде всего, РНК [2, 12, 17]. Непродолжительная фиксация в формалине при пониженной температуре позволяет получить более информативные образцы нуклеиновых кислот, но крайне неблагоприятно сказывается на структуре ткани, поэтому данный вариант в большинстве случаев неприемлем [8].
Формалин присоединяет к аминогруппам азотистых оснований в составе нуклеиновых кислот гидроксиметильные группы, после чего между соседними основаниями могут формироваться метиленовые мостики [4, 11, 12]. Особенно подвержены данному типу повреждений остатки аденина, что, помимо прочего, ведёт к нарушению структуры полиА хвостов мРНК, которые используются в качестве мишени полиТ праймеров для накопления кДНК [4]. Из-за сшивания цитозина со второй цепью в ДНК, которое также происходит под действием формалина, он неверно распознаётся полимеразой и в комплементарную цепь встраивается аденин, а полимераза может при этом перейти на другую матрицу, что ведёт к ошибочному копированию цепи [4]. Способность формалина к образованию артефактных мутаций недооценена, и ряд таких изменений, выявленных в архивном материале,
Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014
98
Методы исследований
мог быть охарактеризован как истинные мутации [8]. Помимо химических превращений азотистых оснований, формалин вызывает фрагментацию РНК и, в меньшей мере, ДНК.
Как с точки зрения сохранения морфологии ткани, так и с позиции сохранности биомолекул важно качество используемого формалина. Например, при пониженных концентрациях клетки могут метаболи-зировать формалин альдегид-дегидрогеназой, что ещё снижает его воздействие, блокирующее аутолиз. Формалин с повышенной кислотностью ведёт к более выраженному нарушению структуры оснований, и, как следствие, к увеличению количества артефактных мутаций [4]. Оптимальным является применение 10% формалина, принятое в большинстве лабораторий.
Использование фиксации в 70% растворе этанола также достаточно распространённый и известный способ сохранения структуры образца ткани. Он позволяет получить гистологические препараты и образцы ДНК, РНК и белков, пригодные для последующего исследования. При спиртовой фиксации изменения определяются не химическими модификациями молекул, а физическими явлениями на молекулярном уровне — денатурацией и дегидратацией, ведущих в блокированию активности ферментов, в том числе, повреждающих нуклеиновые кислоты [8]. ДНК в таком материале менее подвержена фрагментации, чем при фиксации в формалине, и подходит для исследования относительно крупных фрагментов [18]. Повышение концентрации спирта может привести к неблагоприятным последствиям. В частности, 99% этиловый спирт приводит к значительным повреждениям РНК при фиксации в течение суток [5]. 70% этанол хорошо сохраняет морфологию большинства типов тканей, но применять его для работы, например, с образцами почки нельзя, поскольку, в этом случае существенно нарушается морфология ткани [5].
Жидкость Карнуа и её модифицированный вариант, содержащий метанол вместо этанола, известный как метакарн, хорошо сохраняют структуру биомолекул, в том числе нуклеиновых кислот. Метакарн вызывает преципитацию рибосомных белков, инактивируя РНКазы или защищая мРНК от их воздействия [4]. При использовании этих растворов хорошо сохраняется морфология ткани, за исключением эритроцитов [20]. Также в жидкости Карнуа и ме-такарне хорошо сохраняются антигены, выявляемые иммуногистохимически [21].
Значимость проблемы сохранения нуклеиновых кислот в препарате привела к разработке ряда коммерческих реактивов, предназначенных для решения данной задачи. Доступные коммерческие реактивы для фиксации тканей предназначены для лабораторий, где наряду с гистологическими исследованиями проводятся исследования, основанные на молекулярно-биологических методах. В целом, растворы, рекомендованные для фиксации ткани с целью последующего молекулярного исследования, не изменяют её морфологии [21]. Поскольку эти фиксаторы являются коагулирующими, для обработанных ими тканей характерно нарушение структуры эритроцитов и потеря гемоглобина, из-за чего их окраска на препарате изменяется. Могут несколько изменяться и особенности гистологических окрасок, в частности, их яркость, и вид препарата, в результате, будет отличаться от привычного, однако, не сильно затрудняя диагностику [8].
PAXgene — набор для фиксации гистологических образцов. Он включает ёмкость с реагентом для фиксации на основе метанола и уксусной кислоты и ёмкость, содержащую стабилизирующий раствор, представляющий собой смесь спиртов, в том числе этанол [22]. ДНК и РНК в составе образца малочувствительна к длительности фиксации при использовании данной системы: препараты сопоставимого качества были получены при проведении фиксации 3 ч и 120 ч. При этом сохраняется высокий, по сравнению с фиксацией в формалине, уровень накопления как коротких, так и длинных ампликонов (более 600 п.н.) [5, 23]. PAXgene сохраняет морфологию ткани, но для ряда антител показано ослабление иммуногисохимической окраски после фиксации в данном реактиве по сравнению с традиционной фиксацией в формалине. Фиксация в растворе Rapid Fix™ (75% метанол, 20% формальдегид, 5% ледяная уксусная кислота) также позволяет получать более высокий выход продукта при ОТ-ПЦР, чем фиксация в 10% нейтральном за-буференном формалине [1].
Универсальный молекулярный фиксатор (Universal Molecular Fixative, UMFIX), не вызывающий формирования перекрёстных сшивок, основан на метиловом спирте с добавлением полиэтиленгликоля [21]. Полиэтиленгликоль делает мембраны клеток более проницаемыми и ускоряет процесс коагуляции белков. Его присутствие позволяет предотвратить деформацию клеток при обезвоживании и препятствует уплотнению тканей, что облегчает дальнейшую работу с ними [8]. Возможность получать более длинные ампликоны кДНК на матрице РНК из образцов, зафиксированных в молекулярном фиксаторе (по сравнению с образцами, зафиксированными в формалине) объясня-етсяне меньшей фрагментацией РНК, а её лучшей сохранностью с точки зрения отсутствия химических модификаций [11]. Качество препарата ДНК мыши, выделенной из замороженной печени и печени, зафиксированной в универсальном молекулярном фиксаторе,было сопоставимым, в то время как при воздействии формалина наблюдалось повреждение ДНК. Сходная картина наблюдалась при оценке качества препарата РНК из этих образцов, причём в образцах, зафиксированных в формалине, происходила утрата пиков 28S и 18S рибосомных РНК, чего не наблюдалось в универсальном молекулярном фиксаторе [24]. Даже при хранении в универсальном молекулярном фиксаторе в течение восьми недель при комнатной температуре РНК хорошо сохранялась в образце. Сохранялись, в том числе, фрагменты величиной порядка 800 п.н. [10]. Гистологические препараты, полученные из образцов, зафиксированных в универсальном молекулярном фиксаторе, по качеству неотличимы от образцов, зафиксированных по общепринятому протоколу в 10% нейтральном забуференном формалине, хотя некоторые специалисты отмечают повышенную интенсивность окраски эозином [10]. Несколько изменяется активность взаимодействия такого препарата с антителами при иммуногистохимической окраске, как правило, окрашивание при фиксации в молекулярном фиксаторе становится несколько интенсивнее, за исключением антител Hep Par 1, интенсивность окрашивания которыми снижалась в материале, зафиксированном в молекулярном фиксаторе [24].
Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014
Методы исследований
99
Декальцинация
Декальцинирующие растворы вызывают фрагментацию ДНК. Считается, что после их применения выделить адекватный материал для молекулярнобиологического исследования часто практически невозможно. При исследовании опухолей, метастазиру-ющих в костную ткань, а так же опухолей щитовидной железы и других злокачественных новообразований, связанных с дистрофической минерализацией тканей, рекомендуется сохранять часть материала для молекулярного исследования. В этом случае ткань заливается в парафин без проведения декальцинации [42]. Однако, поскольку вопрос о возможности молекулярного исследования тканей, нуждающихся в декальцинации, стоит остро, ведётся поиск и оптимизация методов декальцинации для данной задачи.
Показано, что сильнофрагментированная ДНК может быть найдена и в материале, прошедшем декальцинацию достаточно агрессивными агентами, такими как азотная кислота, если декальцинация длилась небольшой промежуток времени — несколько часов [25]. Однако в таких образцах не всегда удаётся получить накопление продукта даже размером до 100 п.н., а выявляемые ПЦР в реальном времени результаты могут наблюдаться на 10 циклов позже, чем в свежем образце ткани [26]. Согласно результатам оценки индекса интегрированности РНК, сохранность РНК выше в препаратах, выделенных из ткани, декальцинированной в муравьиной кислоте, чем в аналогичных препаратах, из материала, декальцинированного азотной кислотой. На её матрице можно синтезировать кДНК и получить накопление продукта порядка 100 п.н. в реакции ПЦР, который можно успешно секвенировать [27]. Тем не менее, более крупных фрагментов, пригодных для исследования, при такой обработке из материала не получить, даже если речь идёт о более устойчивой ДНК [28].
Наиболее общепринятым способом декальцинации для последующего молекулярно-биологического исследования является декальцинация с использованием ЭДТА, это длительный процесс, который может занимать несколько недель, но его можно ускорить, перемешивая раствор. Благодаря данному методу удалось получить ампликоны ДНК размером более 600 п.н. [29]. Совместное использование обработки ультразвуком и ЭДТА позволяет сохранить ДНК и РНК в доступном для исследования состоянии, а также морфологию ткани и её антигенную структуру, ускорив при этом процесс обработки [30]. Напротив, микроволновая обработка,также ускоряющая процесс декальцинации в ЭДТА, ведёт к повреждению ДНК [31].
Что касается более сложных по составу растворов, они также могут применяться для работы с тканями, подлежащими молекулярно-биологическому исследованию. Раствор Морсе (Morse), содержащий 22,5% муравьиной кислоты и 10% цитрата натрия позволяет сохранить в амплифицируемом состоянии ДНК и РНК тканей [32]. Возможно использование декальцинирующего раствора Планка — Ричло (Plank-Rychlo) для подготовки к молекулярнобиологическому исследованию образцов костного мозга, в том числе с целью выявления возбудителей инфекционных заболеваний [33]. Раствор также подходит для декальцинации цист свиного цепня, зафиксированных в формалине для последующего генотипирования [34].
Проводка ткани и заливка парафинового блока
Нуклеиновые кислоты, содержащиеся в ткани, становятся менее устойчивы к повреждающим воздействиям после фиксации материала в формалине, что следует учитывать при дальнейшей работе с образцом, если при фиксации был выбран данный реагент [35]. Каким бы ни был протокол фиксации, для проводки предпочтительно выбирать способы, обеспечивающие максимальное обезвоживание тканей, поскольку даже следовые количества воды могут вызвать повреждение нуклеиновых кислот [2]. Кроме того, ксилол оказывает повреждающее воздействие на нуклеиновые кислоты. Значительные потери могут произойти после часа пребывания материала в растворе, но в течение первых 15 мин РНК хорошо сохраняется в ткани. Тем не менее, широко распространённый протокол проводки, предполагающий обработку ткани ксилолом в течение двух часов лучше заменить одним из протоколов бескси-лольной проводки [36].
В современной практике, помимо химической обработки, ткань подвергается различным физическим воздействиям для ускорения фиксации и проводки, в том числе — воздействию ультразвука и микроволнового излучения. Последствия таких воздействий на препарат были исследованы и не должны вызывать беспокойство. В частности, фиксация в формалине с применением ультразвука может обеспечить более высокую сохранность морфологической структуры ткани, а также входящих в её состав нуклеиновых кислот, по сравнению с традиционной фиксацией в формалине [37]. Практически в любом фиксаторе применение микроволнового излучения также позволяет улучшить результат с точки зрения сохранности структуры ткани [20]. Поскольку микроволновое излучение блокирует энзиматическую активность, оно защищает препарат от воздействия ферментов и обеспечивает большую сохранность нуклеиновых кислот [4]. При использовании микроволнового излучения можно получить продукты ОТ-ПЦР до 500 п.н. после фиксации в формальдегиде с последующей проводкой в растворах, содержащих ацетон, изопропанол, полиэтиленгликоль, ледяную уксусную кислоту и диметилсульфоксид [38]. Применение микроволнового излучения в сочетании с фиксатором UMFIX позволяет получать ампликоны до 700 п.н. [39].
Заливка блока — ещё один этап работы, на котором происходит повреждение биомолекул, содержащихся в тканях. Использование заливочных сред с низкой температурой плавления обеспечивает лучшую сохранность ДНК, РНК и белков в образце [18]. Более подвержены повреждению при этом образцы, зафиксированные в формалине [19].
Депарафинизация и обработка препарата
перед экстракцией нуклеиновых кислот
Для выделения нуклеиновых кислот, как правило, отбирают один или несколько срезов парафинового блока толщиной 3-20 мкм. Не так много исследований указывает на точное необходимое количество ткани. Показано, что препараты нуклеиновых кислот, пригодные для дальнейшего исследования, могут быть получены из фрагментов материала, содержащих несколько тысяч клеток (1 мм2 препарата толщиной 10 мкм) [40], хотя большая часть исследований проводится на большем объеме ткани [13, 41-43].
Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014
100
Методы исследований
Часто для исследования важна определённая часть препарата, получить которую можно, например, путём лазерной микродиссекции. Показано, что воздействие лазеров, применяемых для этих целей, не влияет на качество препарата РНК [1]. Если для правильного отбора материала для последующего исследования необходимо подкрасить ткань с целью более точной идентификации интересующих участков, рекомендуется проводить окраску препарата только эозином, более щадящим по отношению к биомолекулам, по сравнению с гематоксилином [18].
Как правило, перед началом выделения нуклеиновых кислот проводится депарафинизация материала, хотя есть сведения, что эта процедура не является обязательным шагом подготовки среза к выделению нуклеиновых кислот и мало влияет на качество препарата [14]. Существуют различные способы депарафинизации, наиболее распространённый из которых — промывка в ксилоле, которую проводят обычно в нагретом растворе [40, 42]. Ксилол можно заменить D-лимоненом, это не скажется на качестве препарата, но поможет сократить использование в лаборатории токсичного ксилола [13]. Также избежать использования токсичного ксилола можно применяя для депарафинизации минеральное масло [44]. Специализированные растворы, как правило, входящие в состав коммерческих наборов реактивов, предназначенных для работы с парафиновыми блоками, могут оставлять следовые количества парафина в препарате, что несколько снижает эффективность ПЦР, но общий выход ДНК, полученной таким методом, как правило, высок [43].
Депарафинизацию проводят как на стекле, так и в пробирке, единого мнения по этому поводу нет. Есть, однако, сообщения, что, хотя после депарафинизации в пробирках при выделении ДНК получаются более концентрированные препараты, сохранность ДНК выше при депарафинизации на стекле [45].
Некоторые дополнительные меры могут быть приняты для повышения качества препарата ДНК или РНК непосредственно перед началом процедуры выделения. Это термическая обработка и ферментативная обработка материала с использованием протеиназы К. Использование повышенных температур при инкубировании образца обосновано тем, что в таких условиях происходит восстановление обратимых повреждений нуклеиновых кислот, вызванных воздействием формалина, в частности, отсоединение метилольных групп, блокирующих обратную транскрипцию [9]. Оптимальным является проведение этой процедуры при температуре порядка 65°C [14]. Хотя нагревание помогает удалить перекрёстные сшивки между молекулами, оно может негативно сказаться на сохранности РНК, поэтому, особенно если для фиксации применялся коагулирующий фиксатор, рекомендуется избегать данной процедуры при работе с РНК [23].
Протеиназа K повышает качество конечного препарата РНК. Во-первых, она разрушает перекрёстные сшивки, а, во-вторых, инактивирует РНК-азы, которые могут активизироваться при отмывке препарата от химических реагентов [9, 42].
Что касается самой процедуры выделения нуклеиновых кислот, здесь существует множество решений, в том числе коммерческих наборов, предназначенных для материала данного типа. Пригодный для некоторых задач материал можно получить из правильно подготовленного среза даже простым термолитическим разрушением тканевых структур,
однако, когда для получения более надёжного результата важно высокое качество препарата, лучше использовать более сложные методы для удаления примесей и белков, а также сохранения структуры нуклеотидных цепей [46].
Оценка качества препарата нуклеиновых кислот
при работе с препаратом, полученным
из парафинового блока
Отдельно следует остановиться на требованиях к оценке качества препарата нуклеиновых кислот, полученного из материала, прошедшего гистологическую обработку. Это связано с многообразием возможных нарушений структуры, которые могут произойти на различных этапах работы. В итоге, препарат содержит сильно фрагментированные нуклеиновые кислоты, часть оснований в составе которых претерпела химические превращения. Например, несмотря на то, что выход РНК больше из образцов, зафиксированных в формалине, сохранность нуклеиновых кислот выше при фиксации метакарном. Хотя общий выход РНК повышается при фиксации в формалине в течение нескольких месяцев, это не повышает её амплифицируемость [42].
Таким образом, оценка степени очистки препарата от белков и примесей путём спектрометрии и определения размера фрагментов ДНК или РНК, присутствующих в препарате путём электрофореза, не достаточно информативна для заключения о пригодности препарата для дальнейшего исследования. Хорошим способом определить пригодность РНК для исследования является оценка возможности получения накопления продукта ОТ-ПЦР [11, 13].
Заключение
Фиксация ткани и хранение её в виде парафинового блока — традиционный и рациональный способ работы с гистологическим материалом, полностью отказаться от которого невозможно, хотя бы из-за отсутствия полноценных альтернатив. Тем не менее, запросы, как исследователей, так и медицинских сотрудников требуют в настоящее время методов обработки гистологического материала, не уступающих общепринятым, и позволяющим сохранить нуклеиновые кислоты в пригодном для исследования состоянии. Замороженные образцы не являются оптимальным решением — хранение их требует особых условий, а единожды размороженный материал не может быть заморожен повторно, поскольку биомолекулы в этом случае претерпевают необратимые повреждения [3].
С учётом растущей важности данной проблемы был найден ряд решений по расширению возможностей исследования гистологического материала. Ряд из них может быть реализован путём пересмотра протоколов рутинной работы гистологической лаборатории, прежде всего введения в практику новых реактивов — метакарна и тех или иных коммерческих растворов. Эта процедура требует усилий со стороны всего персонала лаборатории, направленных, прежде всего, на создание и валидацию новых процедур, поэтому она осуществима далеко не всегда. В тех случаях, когда пересмотр принятых в лаборатории протоколов по тем или иным причинам не может быть осуществлён, некоторые модификации процедуры выделения нуклеиновых кислот могут позволить повысить качество препарата. Это также касается работы с архивным материалом.
Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014
Методы исследований
101
Нуклеиновые кислоты, выделенные с соблюдением требуемых условий из ткани, залитой в парафиновый блок, могут быть использованы для ПЦР и ОТ-ПЦР, секвенирования, исследования на микрочипах и других молекулярно-биологических методик. Чтобы получить достоверные результаты, следует уделять
ЛИТЕРАТУРА:
1. Goldsworthy S.M., Stockton P.S.Jrempus C. S. et al. Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue. Mol Carcinog. 1999; 25(2): 86—91.
2. Chung J.Y., Braunschweig T., Williams R. et al. Factors in tissue handling and processing that impact RNA obtained from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J. Histochem. Cytochem. 2008; 56(11): 1033-42.
3. Abrahamsen H.N., Steiniche T., Nexo E. et al. Towards
quantitative mRNA analysis in paraffin-embedded tissues using real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction: a
methodological study on lymph nodes from melanoma patients. J. Mol. Diagn. 2003; 5(1): 34-41.
4. Srinivasan M., Sedmak D., Jewell S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am. J. Pathol. 2002; 161(6): 1961-71.
5. Viertler C., Groelz D., Gundisch S. et al. A new technology for stabilization of biomolecules in tissues for combined histological and molecular analyses. J. Mol. Diagn. 2012; 14(5): 458-66.
6. Nam S.K., Im J., Kwak Y. et al. Effects of fixation and storage of human tissue samples on nucleic Acid preservation. Korean J. Pathol. 2014; 48(1): 36-42.
7. Arzt L., Kothmaier H., Quehenberger F. et al. Evaluation of formalin-free tissue fixation for RNA and microRNA studies. Exp. Mol. Pathol. 2011; 91(2): 490-5.
8. Boon M.E., Kok L.P. Theory and practice of combining coagulant fixation and microwave histoprocessing. Biotech Histochem. 2008; 83(6): 261-77.
9. Li J., Smyth P., Cahill S. et al. Improved RNA quality and TaqMan Pre-amplification method (PreAmp) to enhance expression analysis from formalin fixed paraffin embedded (FFPE) materials. BMC Biotechnol. 2008; 6; 8: 10.
10. Turashvili G., Yang W., McKinney S. et al. Nucleic acid quantity and quality from paraffin blocks: defining optimal fixation, processing and DNA/RNA extraction techniques. Exp Mol Pathol. 2012; 92(1): 33-43.
11. Kashofer K., Viertler C., Pichler M. et al. Quality control of RNA preservation and extraction from paraffin-embedded tissue: implications for RT-PCR and microarray analysis. PLoS One. 2013; 8(7): e70714.
12. Macabeo-Ong M., Ginzinger D. G., Dekker N. et al. Effect of duration of fixation on quantitative reverse transcription polymerase chain reaction analyses. Mod. Pathol. 2002;15(9): 979-87.
13. Roberts L., Bowers J., Sensinger K. et al. Identification of methods for use of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples in RNA expression profiling. Genomics. 2009; 94(5): 341-8.
14. Gilbert M.T., Haselkorn T., Bunce M. et al. The isolation of nucleic acids from fixed, paraffin-embedded tissues-which methods are useful when? PLoS One. 2007; 2(6): e537.
15. Имянитов Е.Н., Григорьев М.Ю., Городинская В.М. и др. Способ восстановления ДНК, изолированной из архивных патоморфологических образцов тканей. Патент РФ № 2219243. 20.12.2003.
16. Ben-Ezra J., Johnson D.A., Rossi J. et al. Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J. Histochem. Cytochem. 1991; 39(3): 351-4.
17. Bresters D., Schipper M.E, Reesink H.W. et al. The duration of fixation influences the yield of HCV cDNA-PCR products from formalin-fixed, paraffin-embedded liver tissue. J. Virol. Methods. 1994; 48(2/3): 267-72.
18. Gillespie J.W., Best C.J., Bichsel V.E. et al. Evaluation of nonformalin tissue fixation for molecular profiling studies. Am. J. Pathol. 2002; 160(2): 449-57.
19. Matsuda Y., Fujii T., Suzuki T. et al. Comparison of fixation methods for preservation of morphology, RNAs, and proteins from paraffin-embedded human cancer cell-implanted mouse models. J. Histochem. Cytochem. 2011; 59(1): 68-75.
20. Cox M.L., Schray C.L., Luster C.N. et al. Assessment of fixatives, fixation, and tissue processing on morphology and RNA integrity. Exp Mol Pathol. 2006; 80(2): 183-91.
21. Howat W.J., Wilson B.A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 2014. pii: S1046-2023(14)00060-7.
22. Belloni B., Lambertini C., Nuciforo P. et al. Will PAXgene substitute formalin? A morphological and molecular comparative study using a new fixative system. J. Clin. Pathol. 2013; 66(2): 124-35.
23. Groelz D., Sobin L., Branton P. et al. Non-formalin fixative versus formalin-fixed tissue: a comparison of histology and RNA quality. Exp. Mol. Pathol. 2013; 94(1): 188-94.
24. Vincek V., Nassiri M., Nadji M. et al. A tissue fixative that protects macromolecules (DNA, RNA, and protein) and histomorphology in clinical samples. Lab. Invest. 2003; 83(10): 1427-35.
особое внимание контролю качества такого материала, в частности, проводить контрольные реакции, результат которых отражает пригодность молекул образца для исследования данного типа. Стандартная оценка качества препарата путём электрофореза в геле и спектрометрии в данном случае недостаточна.
25. Talaulikar D., Shadbolt B., McNiven M. et al. DNA amplification from formalin-fixed decalcified paraffin-embedded bone marrow trephine specimens: does the duration of storage matter? Pathology 2008; 40(7):702-6.
26. Talaulikar D., Gray J. X., Shadbolt B. et al. A comparative study of the quality of DNA obtained from fresh frozen and formalin-fixed decalcified paraffin-embedded bone marrow trephine biopsy specimens using two different methods. J Clin Pathol. 2008; 61(1): 119-23.
27. Mangham D.C., Williams A., McMullan D.J. et al. Ewing's sarcoma of bone: the detection of specific transcripts in a large, consecutive series of formalin-fixed, decalcified, paraffin-embedded tissue samples using the reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Histopathology 2006; 48(4): 363-76.
28. Wickham C.L., Sarsfield P., Joyner M.V. et al. Formic acid decalcification of bone marrow trephines degrades DNA: alternative use of EDTA allows the amplification and sequencing of relatively long PCR products. Mol. Pathol. 2000; 53(6): 336.
29. Wickham C.L., Boyce M., Joyner M.V. et al. Amplification of PCR products in excess of 600 base pairs using DNA extracted from decalcified, paraffin wax embedded bone marrow trephine biopsies. Mol. Pathol. 2000; 53(1): 19-23.
30. Reineke T., Jenni B., Abdou M. T. et al. Ultrasonic decalcification offers new perspectives for rapid FISH, DNA, and RT-PCR analysis in bone marrow trephines. Am. J. Surg. Pathol. 2006; 30(7): 892-6.
31. Imaizumi K., Taniguchi K., Ogawa Y. An evaluation of the effect of microwave irradiation on bone decalcification aimed to DNA extraction. Leg. Med. (Tokyo) 2013; 15(5): 272-7.
32. Farahani R. M., Nguyen K.A., Simonian M. et al. Adaptive calcified matrix response of dental pulp to bacterial invasion is associated with establishment of a network of glial fibrillary acidic protein+/glutamine synthetase+ cells. Am. J. Pathol. 2010; 177(4): 1901-14.
33. Sano M., Sugitani M., Ishige T. et al. Supplemental utility of nested PCR for the pathological diagnosis of disseminated trichosporonosis. Virchows Arch. 2007; 451(5): 929-35.
34. Yamasaki H., Nagase T., Kiyoshige Y. et al. A case of intramuscular cysticercosis diagnosed definitively by mitochondrial DNA analysis of extremely calcified cysts. Parasitol. Int. 2006;55(2):127-30.
35. Evers D.L., Fowler C.B., Cunningham B.R. et al. The effect of formaldehyde fixation on RNA: optimization of formaldehyde adduct removal. J. Mol. Diagn. 2011; 13(3): 282-8.
36. Vincek V., Nassiri M., Knowles J. et al. Preservation of tissue RNA in normal saline. Lab. Invest. 2003; 83(1): 137-8.
37. Chu W. S., Liang Q., Tang Y. et al. Ultrasound-accelerated tissue fixation/processing achieves superior morphology and macromolecule integrity with storage stability. J. Histochem. Cytochem. 2006; 54(5): 503-13.
38. Morales A.R., Essenfeld H., Essenfeld E. et al. Continuous-specimen-flow, high-throughput, 1-hour tissue processing. A system for rapid diagnostic tissue preparation. Arch. Pathol. Lab. Med. 2002; 126(5): 583-90.
39. Nassiri M., Nadji M. Experience with a Molecular-friendly Histology System for Preservation of Biomolecules in Breast Cancer Tissue. Connection 2008; 12: 72-74.
40. van Eijk R., Stevens L., Morreau H. et al. Assessment of a fully automated high-throughput DNA extraction method from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue for KRAS, and BRAF somatic mutation analysis. Exp. Mol. Pathol. 2013; 94(1):121-5.
41. Bonin S., Hlubek F., Benhattar J. et al. Multicentre validation study of nucleic acids extraction from FFPE tissues. Virchows Arch. 2010; 457(3): 309-17.
42. Hu Y. C., Zhang Q., Huang Y. H. et al. Comparison of two methods to extract DNA from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues and their impact on EGFR mutation detection in non-small cell lung carcinoma. Asian. Pac. J. Cancer Prev. 2014; 15(6): 2733-7.
43. Steinau M., Patel S.S. 0, Unger E.R. et al. Efficient DNA extraction for HPV genotyping in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 2011; 13(4): 377-81.
44. Lin J., Kennedy S. H., Svarovsky T. et al. High-quality genomic DNA extraction from formalin-fixed and paraffin-embedded samples deparaffinized using mineral oil. Anal. Biochem. 2009; 395(2): 265-7.
45. Senguven B., Baris E., Oygur T. et al. Comparison of methods for the extraction of DNA from formalin-fixed, paraffin-embedded archival tissues. Int. J. Med. Sci. 2014; 11(5): 494-9.
46. Dedhia P., Tarale S., Dhongde G. et al. Evaluation of DNA extraction methods and real time PCR optimization on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Asian Pac. J. Cancer Prev. 2007; 8 (1): 55-9.
Поступила 25.07.2014
Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014
