CC BY
13
ОБЩЕСТВЕННОЕ ЗДОРОВЬЕ И ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ, ЭКОЛОГИЯ И ГИГИЕНА ЧЕЛОВЕКА
УДК 340.6:616-091.1
ОСОБЕННОСТИ ИЗЪЯТИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ ТРУПОВ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ УГОЛОВНЫХ И ГРАЖДАНСКИХ ДЕЛ
Абдулина Е.В., Зыков В.В.
ФГБОУ ВО Кировский государственный медицинский университет Минздрава России, Киров, Россия (610027, г. Киров, ул. К. Маркса, 112); e-mail: [email protected]
Целью работы явилось установление оптимальной номенклатуры биологических объектов трупов для генетических исследований, имеющих качественную ДНК. Проведен анализ результатов генетических исследований по 1286 Заключениям эксперта и 281 Акту исследования в период с 2011-го по 2016 год. Объектами исследования являлись кровь, выделения, волосы, зубы, кости, мягкие ткани (мышцы и кожа), плодные объекты (абортивный материал, плацента, амниотическая жидкость). Особую группу объектов составили ткани, находившиеся в формалине и парафиновых блоках. Установлены наиболее частые обстоятельства дел, при которых генетическое исследование данных объектов было необходимо. Рассмотрены различные варианты тактики взятия и хранения объектов для получения качественных препаратов ДНК и положительных результатов генетических исследований. Предложены рекомендации по изъятию, транспортировке и хранению этих объектов для судебно-медицинских экспертов отделов экспертизы трупов. Использование данных рекомендаций может способствовать получению достоверных и гарантированных результатов генетических экспертиз.
Ключевые слова: судебная медицина, генетические исследования трупных биологических объектов, правила изъятия, практические рекомендации.
PECULIARITIES OF TAKING BIOLOGICAL OBJECTS OF CORPSES FOR GENETIC RESEARCH ON MATERIALS OF CRIMINAL AND CIVIL LAW CASES
Abdulina E.V., Zykov V.V.
Kirov State Medical University, Kirov, Russia (610027, Kirov, K. Marx Street, 112), e-mail: [email protected]
The purpose of the study was to determine nomenclature of biological objects of corpses that have high-quality DNA for genetic researches. The results of genetic researches of over a thousand of expert conclusions and 281 acts of the investigations done in 2011-2016 were analyzed. The objects of the study were: blood, secretions, hair, teeth, bones, soft tissues (muscles and skin) and fetal objects (abortive material, placenta, amniotic fluid). A special group of objects included tissues kept in 10% formalin and paraffin blocks. The most common conditions of cases in which the genetic research of these objects were necessary were determined. Various options of tactics of taking and storage of the objects for receiving quality DNA specimens and positive results of genetic researches were considered. Recommendations on taking, transportation and storage of these objects for forensic medical examiners of the Department of Forensic Medical Examinations were given. These recommendations can help obtaining reliable results of genetic examinations.
Key words: forensic medicine, a genetic research biological objects of corpses, rules of taking, practical recommendations.
Введение
В экспертной практике генетические исследования, проводимые с целью идентификации личности и установления родства, приобретают все большую распространенность и, обладая высокой точностью и достоверностью, представляют собой альтернативу серологическим методам судебно-биологического исследования по определению групповой принадлежности [1]. Многообразие биологических объектов, которые могут изыматься у трупов для проведения генетических исследований, очень велико, что диктует необходимость разработки правил их изъятия и хранения. В настоящее время в действующих нормативных документах отсутствуют методические
рекомендации для судебно-медицинских экспертов отделений экспертизы трупов относительно правил и порядка взятия биологических объектов для проведения генетических экспертиз и исследований, что может приводить к ошибочной тактике изъятия и потере важных биологических объектов, являющихся порой единственным вещественным доказательством по делу [2]. Кроме того, отсутствуют данные о надлежащих условиях транспортировки и хранения биологического материала до момента исследования, что также свидетельствует об актуальности темы настоящей работы. Анализ практических случаев показал, что генетическая экспертиза неподходящего биологического объекта, а также неправильное его взятие,
доставка и хранение приводили к получению ложных либо отрицательных результатов типирования.
Таким образом, очевидно, что необходима разработка правил и порядка взятия биологических объектов при исследовании трупов для проведения генетических экспертиз с учетом практического опыта проведения данных исследований.
Целью исследования явилась разработка рекомендаций о порядке изъятия, транспортировки и хранения биологических объектов, изъятых при исследовании трупа для проведения генетических экспертиз.
Материал и методы
Работа выполнена на практическом судебно-медицинском материале. В молекулярно-генетическом отделении были проведены генетические исследования 157984 генотипов за 2011-2016 гг., среди них: кровь - 105101, выделения - 33182, волосы - 2135, зубы - 2423, кости - 11180, мягкие ткани (мышцы, кожа) - 845, прочие - 2565. Следы крови составили 66% от всех исследуемых объектов, выделения -22%, волосы - 1%, зубы - 2%, кости - 6%, мягкие ткани - 0,5%, прочие - 2,5%. В группу «прочие» вошли следующие объекты: гистологические препараты, кусочки органов, абортивный материал, плацента, амниотическая жидкость. Исследования были проведены на основании постановлений правоохранительных органов с последующим оформлением 1286 Заключений эксперта, а также на основании направлений и заявлений с последующим оформлением 281 Акта исследования.
Наилучшие результаты были получены в 8091% случаев исследования следов крови и выделений, мягких тканей, гистологических препаратов и плодного материала. При исследовании костей и зубов удалось получить генотипы лишь в 68% случаев, волос - в 52%. Основными причинами отрицательных результатов явились деградация ДНК, отсутствие или недостаточное количество ДНК, связанные с неудовлетворительным качеством исследуемого объекта. В 5% случаев исследования объектов, изъятых от трупа, проведение исследований не представлялось возможным ввиду изъятия не того объекта либо неправильного его изъятия, а также в результате нарушения условий транспортировки и хранения.
Особую группу составили объекты, помещенные при изъятии в 10% нейтральный формалин, а также заключенные в парафиновые блоки для изготовления стеклопрепаратов с целью проведения гистологических исследований. Объем данного материала составил 2% от всех генетических исследований, причем ценность этих объектов заключается в возможности их длительного хранения. В отдельных случаях генетическое исследование необходимо было провести спустя длительное время (до 3-х лет) после захоронения трупа, и парафиновые блоки или кусочки органов в формалине оказывались единственным биологическим материалом, который возможно было использовать.
Результаты исследования
Проведенные исследования позволили получить следующие результаты и предложить рекомендации по взятию биологического материала трупа на генетические исследования.
1. Костная ткань. В большинстве случаев костная ткань исследовалась при обнаружении
неопознанных скелетированных и термически измененных трупов, а также при эксгумации, когда мягкие ткани были непригодны для исследования или отсутствовали. По результатам проведенных исследований было установлено, что оптимальными объектами для проведения генетических исследований являлись длинные трубчатые кости, такие как бедренная, плечевая и большеберцовая. Для генетического исследования необходима костная мука, получаемая из компактного (не из губчатого) вещества кости, которое в наибольшей степени локализуется в крупных гребнях диафиза, в отделах, прилегающих к эпифизам. Кость следует представлять не фрагментами, а в целом виде, чтобы эксперт генетического отделения самостоятельно мог выбрать наилучший участок для исследования, а также для предотвращения контаминации и гниения. Далее кость необходимо отмыть проточной водой, очистить от мягких тканей, высушить на листе чистой бумаги, упаковать в бумажный сверток, чтобы замедлить гнилостные изменения. Нельзя использовать для упаковки объектов полиэтиленовые пакеты ввиду ускорения процессов гниения. Хранить кости до генетического исследования необходимо в условиях морозильной камеры при температуре -18°С не более 4 недель, для более длительного хранения кости следует поместить в морозильную камеру при температуре -60-80°С.
Наихудшие результаты были получены при исследовании костей, которые длительное время находились во влажных и теплых условиях, например, в канализационных колодцах, водоемах, во влажной земле. Уже через полгода нахождения костей в таких условиях ДНК, как правило, полностью деградировала. Компактное вещество становилось серым или черным в результате гнилостных процессов, такие участки были непригодны для генетического исследования. В случаях хранения костной ткани в сухих прохладных условиях удавалось получить хорошие результаты даже спустя 10 лет после наступления смерти. Термические изменения костных останков, находившиеся в стадии черного, серого и белого обугливания, неизбежно приводили к частичному или полному разрушению органического материала. Такие объекты с большой долей вероятности непригодны для исследования ни одним из обычно применяющихся методов молекулярно-генетического анализа [3]. В связи с этим, взятие на генетическое исследование костных останков, находившихся в стадии черного, серого или белого обугливания, нецелесообразно.
В практике также встречались случаи предоставления на генетическое исследование ребер, по губчатому веществу которых в судебно-биологиче-ском отделении определяют групповую принадлежность крови трупа. Исследование таких объектов в 100% случаев приводило к отрицательным результатам, поскольку данные объекты не содержали ДНК надлежащего качества и количества [3] и поэтому были непригодны для генетического исследования. Таким образом, ребра, а также другие кости с преобладанием губчатого вещества не рекомендуется изымать для генетического исследования.
2. Зубы. Генетическое исследование зубов проводилось в случаях обнаружения скелетированного черепа, а также отсутствия трубчатых костей или невозможности их транспортировки и хранения. При
Вятский медицинский вестник, № 1(57), 2018
надлежащем качестве зубов, как правило, генетическое исследование в большинстве случаев давало лучшие результаты, чем при исследовании костных останков, что, вероятно, связано с тем, что ДНК в корнях зубов не подвержена воздействию неблагоприятных физических и химических факторов. Однако в нашей практике исследовались зубы трупов, давность смерти которых не превышала одного года, поэтому вопрос о более длительных сроках пригодности ДНК зубов в зависимости от давности смерти и условий хранения трупа требует отдельного изучения. Необходимо отбирать зубы, имеющие наибольшее количество корней, так как именно в корнях находятся сосуды и нервы, содержащие ДНК. Желательно направлять не менее двух больших коренных или трех малых коренных зубов. Одиночные резцы нежелательно использовать для генетических исследований ввиду наличия только одного корня и, кроме того, резцы необходимы для криминалистического исследования по прижизненным фотографиям. Однако при отсутствии коренных зубов исследование корней нескольких (3-4) однокоренных зубов (резцов, клыков) также позволяло получать хорошие результаты. Рекомендуется выбирать зубы без пломб, так как в запломбированных каналах корней зубов отсутствует ДНК. Зубы необходимо промывать проточной водой, высушивать и упаковывать в бумажный пакет. Хранить зубы до генетического исследования можно при комнатной температуре не более одного месяца, для более продолжительного хранения лучше использовать бытовой холодильник с температурой от +4°С до -18°С.
3. Мышечная ткань. Как правило, фрагменты скелетных мышц исследовались в случае малого количества крови при значительной фрагментации тела при взрывных и авиационных травмах. Для генетического исследования необходимо изымать фрагмент глубоких слоев мышцы красного цвета из крупных мышц конечностей или ягодичной мышцы размерами не менее 0,5 х 0,5 см. Мышцу помещают в стерильную пробирку вместе с вырезкой стерильной марли в 2-4 слоя. На марле может остаться отпечаток крови, который после высыхания оставляют для повторных или дополнительных исследований. Изъятую мышцу необходимо хранить в морозильной камере холодильника при температуре -18°С до момента исследования либо доставлять сразу в молекулярно-генетическое отделение. При комнатной температуре ДНК в мышце разрушается в течение 8-12 часов.
В нашей практике встретились случаи направления на исследование мягких тканей (мышц, кожи) в 10% нейтральном формалине, которые хранились при комнатной температуре в течение месяца, при этом были получены качественные препараты ДНК. Однако материал мягких тканей, который хранился в 10% нейтральном формалине год, оказался непригоден вследствие деградации ДНК, поэтому рекомендуемые сроки исследования такого материала - не более 1 года.
4. Волосы. Волосы предоставляли на исследование в случаях отсутствия у правоохранительных органов иных биологических образцов, что было обусловлено отсутствием подозреваемого или потерпевшего на момент назначения исследования, отказом граждан дать образцы, а также желанием провести анонимное исследование в частном порядке.
При этом волосы зачастую не содержали луковицу или были представлены единичные выпавшие волосы с луковицами, в которых практически отсутствовали влагалищные оболочки (высохшие луковицы). ДНК надлежащего качества и достаточного количества содержится во влагалищных оболочках луковиц волос, при этом они наиболее выражены в вырванных волосах и практически отсутствуют в выпавших волосах. Наилучшие результаты типирования волос были получены при одномоментном исследовании не менее 5 луковиц вырванных волос. В связи с этим для генетического исследования рекомендуется предоставлять волосы с любой области головы или тела, не менее 20 волос с луковицами большего размера (чем толще волос, тем больше луковица), помещать их в бумажный пакет. Отдельных условий хранения волос с луковицами до генетического исследования не требуется, поскольку в высушенных луковицах волос ДНК сохраняется десятилетиями.
5. Парафиновые блоки. Парафиновые блоки -это материал, который хранится в архиве гистологического отделения до 3-х лет и поэтому представляет собой особую ценность в случаях захоронения трупа и при отсутствии другого биологического материала. Исследование парафиновых блоков назначалось как по уголовным делам в качестве образцов, так и по гражданским делам. Результаты исследования парафиновых блоков зависели от качества исходного биологического объекта, который помещался в парафиновую среду. Так, например, встречались случаи, когда органы и ткани находились в стадии выраженных гнилостных изменений, поэтому ДНК в таких тканях была разрушена уже до изготовления блоков. В остальных случаях, когда ткани и органы находились в удовлетворительном состоянии, исследование парафиновых блоков всегда давало положительные результаты. Для исследования желательно предоставлять все имеющиеся блоки, так как эксперт генетического отделения, не имея информации о том, какая из тканей находится в лучшем состоянии, использует одновременно фрагменты нескольких тканей для получения гарантированного результата. Парафиновые блоки могут храниться в бумажных пакетах как в условиях комнатной температуры, так и в холодильной камере, стоит избегать попадания на блоки прямого солнечного света и температуры плавления парафина (более +45°С).
6. Плодный материал. В нашей практике встречались исследования материала плода при расследовании уголовных дел в случаях убийства беременной женщины, прерывания беременности в результате изнасилования, а также при назначении экспертиз по гражданским делам в случаях претензий к медперсоналу родильного отделения. Исследовались следующие плодные объекты: абортивный материал, амнио-тическая жидкость, плодная часть плаценты.
Забор абортивного материала следует производить на сроке не ранее 7-8 недель беременности, его рекомендуется доставлять на исследование в жидком, а не в высушенном виде, в стерильной пробирке или флаконе с крышкой в течение первых суток после аборта, если нет условий для более длительного хранения. Если доставка в течение первых суток невозможна, то в целях снижения активности ферментов, разрушающих ДНК, абортивный материал необходимо поместить в морозильную камеру при температуре -18°С на срок не более 4 недель, а затем доставить
в термоконтейнере с хладоэлементами. Для более длительного хранения абортивного материала его следует поместить в морозильную камеру при температуре -60-80°С. Доставка абортивного материала в высушенном виде (на фрагментах марли) на сроках до 12 недель нежелательна, так как при таких условиях не представляется возможным отделить следы эмбриона от материнских следов. Это может повлечь получение смешанного генотипа матери и ребенка и ложных результатов исследования.
Для генетического исследования плаценты определяют ее плодную поверхность, покрытую амнионом, берут фрагмент амниона размерами 0,5 х 0,5 см в стерильную пластиковую пробирку. Условия транспортировки и хранения аналогичны условиям транспортировки и хранения абортивного материала.
Амниотическую жидкость рекомендуется забирать в количестве не менее 100 мкл. Забор амниотиче-ской жидкости из плодного яйца следует производить с помощью стерильного шприца, затем помещать ее в стерильную пробирку и транспортировать в термоконтейнере с хладоэлементами. Хранить материал в жидком виде до начала генетического исследования следует при температуре -18°С не более 4 недель, для более длительного хранения материал следует поместить в морозильную камеру при температуре -60-80°С либо высушить на стерильной марле.
7. Кровь. Образцы крови трупа - это биологический объект, который чаще всего представляют на генетическую экспертизу по уголовным делам. Кровь рекомендуется забирать из полостей сердца или из бедренных вен, при этом избегать попадания в нее жировой ткани, которая может в дальнейшем ухудшить качество препаратов ДНК. Кровь берут на стерильный марлевый тампон, сложенный в 2-4 слоя, который пропитывают кровью на участке диаметром 2,0-4,0 см. Далее тампон высушивают на листе чистой бумаги при комнатной температуре в чистом помещении морга. Высушиваемые образцы нельзя помещать вблизи нагревательных приборов и подвергать прямому воздействию солнечных лучей и загрязнению. Тампоны с высушенными образцами крови могут храниться при комнатной температуре десятилетиями, поэтому единственным условием хранения является сухой воздух в помещении, так как во влажной среде произойдет деградация ДНК. Образцы жидкой крови для генетических исследований брать не рекомендуется, так как ДНК в жидкой крови разрушается в течение 8-12 часов.
Обсуждение результатов
Проведенный анализ позволил установить следующие оптимальные объекты для проведения генетических исследований, содержащие ДНК надлежащего качества:
1. Целые трубчатые кости (бедренная, плечевая и большеберцовая), отмытые от загрязнений под проточной водой, очищенные от мягких тканей, высушенные и упакованные в бумажный сверток.
2. Большие коренные (не менее двух) или малые коренные зубы (не менее трех) без пломбировочного материала, промытые проточной водой, высушенные и упакованные в бумажный пакет.
3. Фрагменты глубоких слоев мышцы красного цвета из крупных мышц конечностей или ягодичной мышцы размером не менее 0,5 х 0,5 см, помещенные в стерильную пробирку вместе с вырезкой стерильной марли в 2-4 слоя.
4. Не менее 20 вырванных волос с луковицами из любой области головы или тела, помещенные в бумажный пакет.
5. Парафиновые блоки из нескольких органов или тканей, помещенные в бумажный пакет.
6. Плодный материал, отобранный надлежащим образом в стерильную пробирку или флакон с крышкой (высушенный - в случае с амниотической жидкостью) и доставленный в термоконтейнере с последующим хранением в условиях холодильной камеры.
7. Высушенные образцы крови трупа из камер сердца или бедренных вен в бумажных пакетах.
Указанные практические рекомендации могут быть использованы судебно-медицинскими экспертами отделов экспертизы трупов при изъятии биологического материала для проведения генетических исследований с целью получения достоверных и гарантированных результатов.
Список литературы
1. Иванов П.Л. Молекулярно-генетическая индивидуализация человека и идентификация личности в судебно-медицинской экспертизе // Руководство по судебной медицине. Москва: Медицина, 2001. С. 491-529.
2. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития РФ № 346н от 12 мая 2010 г. «Об утверждении порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях Российской Федерации» (Зарегистрировано в Минюсте РФ 10.08.2010 № 18111). Киров, 2011:44.
3. Методические указания Министерства здравоохранения РФ от 19.01.1999 № 98/253 «Использование индивидуализирующих систем на основе полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установления родства». М, 1999.
References
1. Ivanov P.L. Molekulyarno-geneticheskaya individualizatsiya cheloveka i identifikatsiya lichnosti v sudebno-meditsinskoy ekspertize. Rukovodstvo po sudebnoy meditsine. Moscow: Medicine, 2001:491-529 (in Russ).
2. Prikaz Ministerstva zdravoohraneniya i sotsial'nogo razvitiya RF № 346n ot 12 maya 2010 g. «Ob utverzhdenii poryadka organizatsii i proizvodstva sudebno-meditsinskih ekspertiz v gosudarstvennyh sudebno-ekspertnyh uchrezhdeniyah Rossiyskoy Federatsii» (Zaregistrirovano v Minyuste RF 10.08.2010 № 18111). Kirov, 2011:44 (in Russ).
3. Metodicheskie ukazaniya Ministerstva zdravoohraneniya RF ot 19.01.1999 № 98/253 «Ispol'zovanie individualiziruyushhih sistem na osnove polimorfizma dliny amplifitsirovannyh fragmentov (PDAF) DNK v sudebno-meditsinskoy ekspertize identifikatsii lichnosti i ustanovleniya rodstva». Moscow, 1999 (in Russ).
