CC BY
95
что образцы желчи пригодны для исследования, но, в сравнении с образцами крови, дают менее устойчивые результаты. Следовательно, забор желчи при наличии образца крови от трупа для молекулярно-генетического исследования нецелесообразен. • Ключевые слова: молекулярно-генетиче-ская экспертиза, образцы крови и желчи, электрофорез в пластинах из полиакриламидного геля, капиллярный электрофорез
ВВЕДЕНИЕ
Согласно приказу Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 12 мая 2010 г. № 346н «Об утверждении Порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях Российской Федерации», п. 74.7: «для посмертного исследования категории выде-лительства берут желчь, а при ее отсутствии - мочу или перикардиальную жидкость». В связи с возрастающим количеством молекулярно-генетических исследований определение категории выделительства реакцией абсорбции в количественной модификации, для чего предназначен высушенный образец желчи, в настоящее время практически не проводится. Целью работы является изучение возможности и целесообразности использования образцов желчи при наличии образца крови от этого же трупа для молекулярно-генетического исследования.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследованию подвергались образцы крови и желчи от 20 трупов, высушенные на марле. Выделение ДНК проводили набором реагентов: «Комплект реагентов для выделения ДНК (ExtraPhen)» производства НПФ «АТГ-Биотех», г. Москва. Анализ матричной активности ДНК проводили с помощью полимеразной цепной реакции с использованием системы количественной энзимати-ческой амплификации ДНК Quantifiler* Human DNA Quantification Kit (Applied Biosystems, США), руководствуясь Методическими указаниями № 98/253 «Использование индивидуализирующих систем на основе полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установления родства» (утверждены Минздравом РФ 19.01.1999) и инструкцией фирмы-изготовителя.
Продуктивность полимеразной цепной реакции регистрировали в режиме реального времени с использованием специализированного амплификатора ABI PRISM 7500 Sequence Detection System и программного обеспечения SDS software v. 1.0 (Applied Biosystems, США).
Типирование полиморфных STR-локусов в одной половине препаратов проводили с помощью полиме-разной цепной реакции с использованием энзимати-ческой амплификации 16-локусной панели AmpFlSTR® Identifiler® Plus PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, США), во второй половине - с помощью полимеразной цепной реакции с использованием систем набора реагентов для идентификации личности на основе определения количества тандемных повторов в указанных локусах геномной ДНК человека (НПФ «АТГ-Биотех»), руководствуясь Методическими указаниями № 98/253 «Использование индивидуализирующих систем на основе полиморфизма длины амплифицирован-ных фрагментов (ПДАФ) ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установления родства» (утверждены Минздравом РФ 19.01.1999) и инструкцией фирмы-изготовителя.
Также во всех образцах желчи определяли наличие крови человека с помощью иммунохимического экспресс-теста SERATEC HemDirect (SERATEC GmbH, Германия).
Оценка полученных результатов проводилась с учетом наличия следов крови в образцах желчи, матричной активности ДНК в исследуемых препаратах и картины элек-трофоретического фракционирования.
ВЫВОДЫ
• Во всех исследованных образцах желчи обнаружены следы крови, что не позволяет использовать их для определения категории выделительства методом реакции абсорбции в количественной модификации.
• При оценке матричной активности ДНК в образцах крови и желчи выявлена концентрация ДНК выше установленного порога чувствительности 0,01 нг/мкл, что свидетельствует о приемлемом уровне матричной активности ДНК исследованных образцов, но образцы крови в целом имеют большую концентрацию ДНК.
• Методом капиллярного электрофореза со всеми образцами крови получен полный амплификационный профиль ДНК, при исследовании соответствующих образцов желчи по нескольким локусам получены неустойчивые результаты.
• При детекции методом электрофореза в пластинах по-лиакриламидного геля с препаратами ДНК, выделенными из образцов крови, получен устойчивый результат по всем исследованным локусам, с образцами желчи в большинстве случаев получены слабые и неустойчивые результаты.
• Полученные результаты позволяют сделать вывод о нецелесообразности изъятия образца желчи (при наличии образца крови) при судебно-медицинском исследовании трупа для молекулярно-генетического и серологического исследований.
ОБ ОПТИМАЛЬНОМ СОЧЕТАНИИ СУДЕБНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В РАМКАХ ЕДИНОГО СУДЕБНО-БИОЛОГИЧЕСКОГО ОТДЕЛА БЮРО СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОИ_ЭКСПЕРТИЗЫ_ В. В. Рындин
• Бюро судебно-медицинской экспертизы Московской области (нач. - д.м.н., проф. В. А. Клевно)
• Аннотация: Доклад посвящен взаимодействию судебно-медицинских экспертов двух подразделений судебно-биологического отдела ГБУЗ МО «Бюро СМЭ» при исследовании следов биологического происхождения на вещественных доказательствах. Проанализированы касающиеся судебно-биологической экспертизы положения «Порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях Российской Федерации», утвержденного Приказом Минздравсоцразвития РФ от 12.05.2010 № 346н (зарегистрирован
в Минюсте РФ 10.08.2010), с точки зрения их соответствия современному состоянию молеку-лярно-генетических исследований.
• Ключевые слова: молекулярно-генетиче-ское исследование, судебно-биологическое исследование, серологическое исследование, приказ Минздравсоцразвития РФ от 12.05.2010
№ 346н «Об утверждении Порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях Российской Федерации»
ВВЕДЕНИЕ
Ввиду того что молекулярно-генетическая лаборатория ГБУЗ МО «Бюро СМЭ» является структурным подразделением судебно-биологического отдела и работает в тесной связи с экспертами-биологами, экспертам-генетикам необходимо учитывать действующие нормативные документы, регламентирующие производство судебно-биологических исследований, т.к. большинство генетических экспертиз используют результаты экспертиз судебно-биологических. Генетикам необходимо быть уверенными, что методики, используемые экспертами-биологами, не влияют негативно на результаты генетического исследования. Основным нормативным документом, регулирующим порядок производства судебно-медицинских биологических экспертиз в бюро судебно-медицинской экспертизы, является приказ Минздравсоцразвития РФ от 12.05.2010 № 346н «Об утверждении Порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях Российской Федерации».
При изучении этого «Порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз...» за 2010 год видно, что, помимо относительно мелких и безобидных неточностей, касающихся, например, наличия регистрационных удостоверений на все методики и реактивы, порядка описания вещественных доказательств и расплывчатых, нечетких определений (объем «полноты исследований»), имеются положения, прямым образом влияющие на качество экспертных исследований и, с точки зрения современного состояния экспертных возможностей молекулярно-генетических исследований, нуждающиеся в пересмотре. С учетом того, что молекулярно-генетическая лаборатория судебно-био-логического отдела Бюро СМЭ Московской области проводит все виды молекулярно-генетических исследования, за исключением исследований митохондри-альной ДНК, и имеет самое современное оборудование, позволяющее проводить исследования всех видов биологического материала, требования к уровню работы экспертов-биологов максимальны. Однако устаревшие нормативные документы иногда вступают в противоречие с требованиями практической экспертной деятельности.
Приведу соображения по основным положениям приказа № 346н, нуждающимся в неотложной переработке с целью повышения продуктивности взаимодействия су-дебно-биологического и молекулярно-генетического этапов исследования вещественных доказательств:
• Необходимо ввести фотографирование биологических следов на вещественных доказательствах как обязательный элемент первичного судебно-биологического исследования.
• Необходима также фотофиксация результатов исследований наличия биологических следов с помощью тестов. Современные технологии микроскопирова-ния позволяют прилагать фотографии обнаруженных сперматозоидов, клеточных элементов, волос.
• Целесообразно отказаться от исследования «категории выделительства», так как из-за отсутствия необходимых реактивов данный вид исследования сводится только к исследованию системы АВ0 в выделениях реакцией абсорбции в количественной модификации (КРА). Ре-
зультаты этой реакции зачастую невозможно однозначно интерпретировать.
• Следует категорически отказаться от проведения предварительных реакций на наличие крови (перекись водорода, серная кислота) и на наличие спермы (реакция с картофельным соком, реакция подавления кислой фосфатазы ингибитором). В нашей лаборатории эти реакции уже не используются.
• С учетом возможностей молекулярно-генетической экспертизы (даже в варианте исследования с использованием пластин из полиакриламидного геля) исследования по дифференцированию по системам крови как серологические (MNSs, Рр, Lewis, Rhesus, От), так и электрофоретические (Нр) непродуктивны и должны быть изъяты из применения. В нашем отделе уже 6 лет не проводятся исследования на гаптоглобин и 2 года не проводится дифференцирование по другим системам.
В связи с тем что объем серологических исследований по системе АВ0 остается достаточно большим, в данном приказе должны быть даны критерии оценки целесообразности серологического исследования объектов по этой системе. Может быть, следует не рекомендовать (или даже запретить) проведение серологических исследования пятен малых размеров (до 1x1 см) и слабонасыщенных следов. Должны быть жесткие критерии отбора следов для серологического исследования. Недопустимо, когда в ходе проведения такого рода исследования, зачастую безрезультатного, расходуется как исследуемый материал, так и реактивы. Выработка таких критериев позволит не только сохранить экспертный материал, но и уменьшит нагрузку на экспертов-биологов. В нашем отделе такая проблема сведена к минимуму, т.к. при наличии небольших или малонасыщенных биологических следов выработка правильной тактики их исследования проходит при участии эксперта-генетика. Особенно важно отметить низкое качество реактивов, используемых для установления групповой принадлежности по системе АВ0. Это проявляется в неустойчивости результатов, получаемых в части биологических исследований, что приводит к противоречивым биологическим и генетическим выводам по одним и тем же объектам. Необходимо пересмотреть систему снабжения и, возможно, сертификации этих реактивов. Крайне важный момент, с точки зрения экономии биологического материала, заключается в пересмотре методик для установления групповой принадлежности. Вероятно, целесообразно использовать наиболее экономную из них - реакцию абсорбции - элюции в различных вариантах и отказаться от реакции абсорбции в количественной модификации и реакции покровного стекла.
• Необходимо изъять из перечня реагентов лектины (в частности, бузины для исследования антигена Н); в нашем отделе от них уже отказались.
• Необходимо откорректировать рекомендации предварительных поисков биологических следов при помощи ультрафиолетовых лучей. Известно, что они воздействуют на структуру ДНК, что может привести к инги-биции полимеразной цепной реакции (ПЦР) при моле-кулярно-генетическом исследовании.
• Раздел 81 Порядка, посвященный исследованиям по поводу спорного происхождения детей (установления родства, отцовства, материнства), необходимо исключить полностью, т.к. сейчас это входит исключительно в компетенцию молекулярно-генетической экспертизы.
Кроме перечисленных стратегических вопросов необходима корректировка документа по таким видам исследования, как дифференцирование крови плода, новоро-
жденного и взрослого человека, принадлежность крови беременной женщине, установление менструального характера следов крови, изучение пальцевых отпечатков на пот и исследований следов пота в целом, проведение судебно-цитологической экспертизы.
ВЫВОДЫ
• «Порядок организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях Российской Федерации», утвержденный Приказом Минздравсоцразвития РФ от 12.05.2010 № 346н в части проведения судебно-биологических исследований практически в каждом разделе содержит рекомендации, не соответствующие современному уровню экспертной практики, с точки зрения взаимосвязи судебно-биологических и молекулярно-генетических методов исследования.
• Часть положений этого «Порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз...» содержат рекомендации, которые при их исполнении могут негативно влиять на качество молекулярно-генетических исследований.
• Данный документ нуждается в неотложной детальной переработке с учетом современного состояния экспертизы биологических следов на вещественных доказательствах.
■ ОПЫТ РАБОТЫ С ГИСТОЛОГИЧЕСКИМ И КОСТНЫМ МАТЕ-РИАЛОМ В МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ ГБУЗ МО «БЮРО СМЭ»
Т. А. Смагина
• Бюро судебно-медицинской экспертизы Московской области (нач. - д.м.н., проф. В. А. Клевно)
• Аннотация: доклад посвящен молекуляр-но-генетическому исследованию костного
и гистологического материала, поступающего в молекулярно-генетическую лабораторию ГБУЗ МО «Бюро СМЭ» по постановлениям Главного следственного управления Следственного комитета Российской Федерации по Московской области для идентификации личности и установления родства. Проведен анализ объема, характера исследований, полученных результатов, с учетом особенностей представленного материала, методов выделения ДНК.
• Ключевые слова: молекулярно-генетиче-ское исследование, костный материал, гистологический материал, выделение ДНК
ВВЕДЕНИЕ
Внедрение в экспертную практику новых высокотехнологичных решений повышает информативность молекулярно-генетического исследования и обеспечивает существенное увеличение доказательного значения получаемых результатов. В связи с этим возрастает количество и сложность предоставляемых объектов для проведения экспертизы с помощью методов мо-лекулярно-генетической индивидуализации человека с целью судебно-медицинской идентификации (отождествления) личности и установления спорного происхождения детей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследованию подвергались образцы костного материала (фрагменты ребер, трубчатых костей, черепа,
позвонки, зубы) и гистологического материала (парафиновые блоки, гистологические препараты). Выделение ДНК из костного материала, предварительно измельченного на гомогенизаторе Precellys Evolution (Bertin Technologies, Франция), проводили двумя способами: буфером PrepFiler BTATM Lysis Buffer (Applied Biosystems, США) с добавлением DTT и протеиназы К с применением сорбентных технологий на роботизированной станции AutoMate Express DNA Extraction System (Applied Biosystems, США) с использованием специализированного набора реагентов PrepFiler Express Forensic DNA Extraction Kit* (Applied Biosystems, США) и с применением технологии очистки геномной ДНК за счет избирательного связывания ДНК с мембраной на основе силики с помощью прибора QIAcube фирмы QIAGEN с использованием набора QlAamp DNA Investigator Kit. Выделение ДНК из гистологического материала (после предварительной стадии депарафинизации с использованием ксилола) проводили на роботизированной станции AutoMate Express DNA Extraction System (Applied Biosystems, США) с использованием специализированного набора реагентов PrepFiler Express Forensic DNA Extraction Kit* (Applied Biosystems, США).
Анализ матричной активности препаратов ДНК проводили с помощью полимеразной цепной реакции с использованием системы количественной эн-зиматической амплификации ДНК Quantifiler® Duo DNA Quantification Kit (Applied Biosystems, США), руководствуясь Методическими указаниями № 98/253 «Использование индивидуализирующих систем на основе полиморфизма длины амплифицирован-ных фрагментов (ПДАФ) ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установления родства» (утверждены Минздравом РФ 19.01.1999) и инструкцией фирмы-изготовителя. Продуктивность полимеразной цепной реакции регистрировали в режиме реального времени с использованием специализированного амплификатора ABI PRISM 7500 Sequence Detection System и программного обеспечения SDS software v. 1.0 (Applied Biosystems, США).
Типирование полиморфных STR-локусов проводили с помощью полимеразной цепной реакции с использованием энзиматической амплификации 16-локусной панели AmpFlSTR® Identifiler® Plus PCR Amplification Kit, 24-локус-ной панели GlobalFiler™ PCR Amplification Kit, 25-локус-ной системы AmpF/STR* Yfiler™ Plus PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, США), руководствуясь Методическими указаниями № 98/253 «Использование индивидуализирующих систем на основе полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установления родства» (утверждены Минздравом РФ 19.01.1999) и инструкциями фирмы-изготовителя. Продукты полимеразной цепной реакции фракционировали электрофоретически с использованием системы капиллярного электрофореза ABI PRISM 3500 (Applied Biosystems, США).
Полученные электрофореграммы анализировали с использованием штатного программного обеспечения GeneMapper ID-X (Applied Biosystems, США) и устанавливали индивидуальные генотипические комбинации аллельных вариантов (профили ПДАФ) типируемых STR-локусов, а также устанавливали индивидуальные ал-лельные варианты полиморфных локусов Y-хромосомы исследуемых объектов.
Оценка полученных результатов проводилась с учетом матричной активности ДНК в исследуемых объектах и картины электрофоретического фракционирования.
