CC BY
42УДК 582.282.123.4
ОСОБЕННОСТИ ОРГАНИЗАЦИИ КОЛОНИЙ ASPERGILLUS SPP. ПРИ РОСТЕ В ПРИСУТСТВИИ ПОЛИВИНИЛХЛОРИДА
1 Носенко Т.Н. (тьютор), 2Рябинин И.А. (м.н.с., ассистент кафедры)*, 1Фокина М.И. (доцент), 2Васильева Н.В. (директор института, зав. кафедрой), 1Денисюк И.Ю. (профессор)
1Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики (кафедра информационных технологий топливно-энергетического комплекса); 2Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова: НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, кафедра медицинской микробиологии, Санкт-Петербург, Россия
© Коллектив авторов, 2018
Описан эксперимент долгосрочного (50 суток) культивирования Aspergillus spp. на модифицированной жидкой среде Чапека в вариантах с сахарозой и без углеводов с погружением в посевы пластинок поливинилхлорида (ПВХ). Для исследования культуральных особенностей в присутствии ПВХ использовали 20 штаммов аспергиллов из секций Fumigati, Nigri, Flavi, Clavati, Candidi, Terrei, Versicolores, Flavipedes, Usti, Nidulantes и Cremei. Установили, что ПВХ не искажает макроморфологические особенности колоний.
По строению в исследуемых культурах на среде с сахарозой условно можно выделить 6 элементов, относительно однородных по макро- и микроморфологическим признакам: (1) пленчатая или обратно-вогнутая колония на границе питательной среды и воздушной фазы; (2) элементы обрастания в погруженной части стенок пробирки; (3) элементы обрастания на погруженной части пластины ПВХ; (4) краевая сеть гиф в воздушной части посева, исходящая из основной колонии; (5) полоска воздушного мицелия, фиксирующая край ПВХ к стеклу; (6) изолированные отдаленные микроколонии на стекле в воздушной части посева. Указанные элементы строения в статье снабжены снимками общего вида и микроскопического строения. У изолятов наблюдали адаптивные реакции к уменьшению уровня среды в виде образования «двухуровневых» колоний и донных отростков. На среде без сахарозы рост грибов, в целом, прослеживался слабо.
Поверхность стекла оказалась более благоприятной для роста Aspergillus spp., чем поверхность ПВХ. Рост на погруженной части образцов пластика был наиболее интенсивным у штаммов A. fumigatus, A. flavus, A. tamarii, A. oryzae, A. niger, A. terreus, Aspergillus sp. (Terrei), A. candidus, A. sydowii, A. nidulans и A. janus. Изолят A. tamarii в связи с интенсивным формированием у него в опытных посевах субстратного (погруженного) и воздушного мицелия избрали для дальнейшего исследования биодеградации ПВХ.
Ключевые слова: Aspergillus, биодеградация, обрастание, поли-винилхлорид
Контактное лицо: Рябинин Игорь Андреевич, e-mail: [email protected]
FEATURES OF THE ORGANIZATION OF ASPERGILLUS SPP. COLONIES AT GROWTH IN THE PRESENCE OF POLYVINYL CHLORIDE
1Nosenko T.N. (tutor), 2Ryabinin I.A. (junior scientific collaborator, assistant of the department), 1Fokina M.I. (associated professor), 2Vasilyeva N.V. (director of the institute, head of the department), 1Denisyuk I.Y. (professor)
1St. Petersburg National Research University of Information Technologies, Mechanics and Optics (department of IT in the fuel and energy industry); 2North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov: Kashkin Research Institute of Medical Mycology and Department of Medical Microbiology, St. Petersburg, Russia
© Collective of authors, 2018
The experiment of long-term (for 50 days) cultivation of Aspergillus spp. on the modified Czapek liquid medium in variants with sucrose and without carbohydrates with plating of polyvinyl chloride (PVC) plates was described. 20 strains of aspergilli from the sections Fumigati, Nigri, Flavi, Clavati, Candidi, Terrei, Versicolores, Flavipedes, Usti, Nidulantes and Cremei were used to study the cultural characteristics in the presence of PVC. It was established that PVC does not distort the macromorphological features of the colonies.
In the studying cultures on sucrose-containing medium it is possible to conditionally distinguish the six structural elements relatively homogeneous in terms of macro- and micromorphological features: (1) a filmy or back-concave colony on the boundary of the nutrient medium and the air phase; (2) fouling elements in the submerged portion of the test tube walls; (3) fouling elements on the submerged part of the PVC plate; (4) marginal hyphae network in the air part of the inoculation originating from the main colony; (5) a strip of aerial mycelium fixing the edge of PVC to the glass; (6) isolated distant microcolonies on the glass in the air of the inoculation. Described elements were provided with pictures of a general view and microscopic structure in the article. Adaptive reactions to decreasing of medium level in the forms of «two-level» colonies formation and benthic appendages were observed. In the medium without sucrose the growth of fungi, in general, was poorly traced.
The surface of the glass proved to be more favorable for Aspergillus spp. fouling than the surface of PVC. The growth on the submerged portion of the plastic samples was most intense in the strains of A. fumigatus, A. flavus, A. tamarii, A. oryzae, A. niger, A. terreus, Aspergillus sp. (Terrei), A. candidus, A. sydowii, A. nidulans and A. janus. The A. tamarii isolate in connection with the intensive formation of substrate (submerged) and aerial mycelium in experimental inoculations was selected for further investigation of PVC biodegradation.
Key words: Aspergillus, biodégradation, biofouling, polyvinyl chloride
ВВЕДЕНИЕ
Биологическая утилизация поливинилхлорида (ПВХ) является актуальной проблемой медицинской экологии. Сложность ее решения связана с низкой биодоступностью ПВХ, а также большим объемом образующихся отходов из изделий и материалов на основе ПВХ бытового, промышленного и медицинского назначения. Сжигание ПВХ (вне зависимости от режима) приводит к образованию различных оксидов хлора, а также продуктов неполного окисления - хло-рорганических соединений, включая хлорированные бифенилы, диоксины и других токсиканты [1].
Известны некоторые виды микроорганизмов, способные к утилизации ПВХ [2], включая некоторые микроскопические грибы [3, 4]. Тем не менее, метаболический путь, реализующий этот процесс, остаётся
не выясненным. Теоретически, как и другие сходные полимеры на основе замещенных алканов преимущественно линейного строения, конечный этап утилизации должен осуществляться по пути ß-окисления [5, 6]. Наиболее сложным для расшифровки и осуществления является инициальный этап. Для вступления в метаболизм молекула ПВХ должна (1) быть фрагментирована с образованием веществ, способных проникнуть через билипидную мембрану (типа длинноцепочных алифатических спиртов, альдегидов или карбоновых кислот), а также (2) подвергнуться дегалогенированию. Оба процесса не могут происходить без участия ферментов семейства цитохрома р450, при этом нужно учитывать, что начальный этап деградации должен происходить внеклеточно, а белки типа р450 не являются типичными экскретируемыми веществами. Таким образом, согласно выдвинутой гипотезе, необходимо наличие у кандидатных штаммов-биодеструкторов ПВХ высокоинтенсивного процесса биосинтеза белка, который, в свою очередь, сопряжен с необходимостью использовать в условиях окружающей среды минеральный азот (возможно, даже фиксировать газообразный), а также хорошо развитой анти-оксидантной системы для нейтрализации продуктов свободно-радикального процесса, возникающего при работе ферментов типа р450, и гипохлорит-иона (как продукта дегалогенирования).
В определенной степени этим критериям соответствуют представители рода Aspergillus. Для некоторых из них способность утилизировать ПВХ доказали ранее в эксперименте [7, 8]. Не менее важным явлением при утилизации какого-либо твердого субстрата является способность микроорганизмов к его обрастанию.
Цель работы - изучить способность избранных представителей рода Aspergillus к обрастанию модельных образцов ПВХ в условиях минеральной питательной среды.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы Aspergillus spp. предоставлены Российской коллекцией патогенных грибов: A. niger РКПГ F-1448; A. awamori РКПГ F-1444; A. flavus РКПГ F-1375; A. oryzae РКПГ F-1382; A. clavatus РКПГ F-12/275; A. Candidus РКПГ F-123; A. terreus РКПГ F-1123; A. versicolor РКПГ F-1287; A. sydowii РКПГ F-1115; A. wentii РКПГ F-6; A. parasiticus РКПГ F-68. Также использовали оригинальные штаммы A. fumigatus, A. ochraceus, Aspergillus sp. (секции Terrei), A. janus, A. ustus, A. calidoustus, A. tamarii, A. nidulans и Neosartorya hiratsukae, предоставленные НИЛ микологического мониторинга и биологии грибов, а также микробиологической лабораторией отделения лабораторной диагностики микологической клиники СЗГМУ им. И.И. Мечникова. Культуры для посева получали на модифицированном овощном агаре (на основе отвара моркови, свеклы и яблока) с дрожжевым экстрактом (5 г/л). Инкубировали при 20 °С 2 суток, затем при 32 °С 2 суток.
Образцы ПВХ. Образцы из пластинчатого ПВХ (с добавлением полиэтилена) размерами 90х10х0,4 мм стерилизовали путем погружения в раствор 3% перекиси водорода с последующей сушкой в камере ламинарного бокса при УФ-облучении непосредственно перед постановкой опыта.
Питательная среда. Опытную инкубацию про-
водили в модифицированной жидкой среде Чапека с двойной концентрацией KNO3 (вместо NaNO3). Среду использовали в 2-х вариантах: с добавлением 3% сахарозы (1) и без углеводов (2).
Постановка опыта. В биологические пробирки стерильно вносили по 8 мл среды для инкубации из расчета по 1 пробирке с одним вариантом среды на штамм (всего на 40 посевов). После розлива посев проводили путем внесения споровой массы гриба, суспендируя в пробирке материал культуры, представляющий собой вырезанный фрагмент агаровой пластины с колонией размером около 5х5 мм с последующим извлечением. Исключение составили слабоспороносящие штаммы A. clavatus и A. wentii, при инокуляции которыми фрагмент колонии оставляли на поверхности питательной среды. После инокуляции в пробирки вносили подготовленные образцы ПВХ (40 экземпляров). 2 контрольных экземпляра ПВХ в средах с сахарозой и без сахарозы использовали незасеянными в качестве контрольных. Инкубацию осуществляли при 21 °±2 °С 50 суток.
Учет результатов. По окончании инкубации выполнили визуальный учет роста Aspergillus spp. в сравнении на средах с сахарозой и без сахарозы, осуществляли фотосьемку (камера Presto T55, Rekam, Италия) и составляли морфологические описания. Интактные посевы микроскопировали в проходящем свете при малом увеличении (х80), микрофотосъемку проводили той же камерой, смонтированной на штативе.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Результаты представлены в форме морфологических описаний (макроскопических характеристик) роста тест-штаммов, снимки полученных колоний представлены на рисунке 1.
A. janus. На среде с сахарозой штамм образовал колонию в форме перевернутого купола. Складки не определяются, на оборотной стороне, погруженной в среду, виден неправильный сетчатый рисунок из трещин. Погруженная поверхность колонии темновато-кремовая, воздушная поверхность имеет свойственный виду изумрудно-зеленоватый оттенок. Преимущественно на дне колонии образовались капли коричневатого экссудата. Культура частично обрастает образец ПВХ выше уровня расположения основной колонии, наиболее дистально субстратный мицелий становится более разреженным, в воздушном мицелии определяются рыхло расположенные гранулы кремового цвета (конидиальные головки?). Микроколонии гриба также образовались на стенках пробирки, не погруженных в среду. Хлопьевидные микроколонии диф-фузно покрывают образец ПВХ, погруженный в среду, вплоть до дна пробирки. Среда приобрела легкую кре-мово-розоватую окраску. На среде без сахарозы поверхностная пленчатая колония не сформирована, на части образца ПВХ, погруженного в питательную среду, видны нерегулярно расположенные хлопьевидные структуры различного размера.
A. terreus РКПГ F-1123. На среде с сахарозой колония имеет двухуровневую структуру в форме обратного купола, возникшую, по-видимому, вследствие частичного понижения уровня среды до инкубации. Погруженная поверхность колонии относительно ровная, нижний ярус не окрашен, верхний ярус имеет
коричневатую пигментацию в основании. Внутренняя поверхность колонии лимонно-желтая, на дне покрыта большой каплей прозрачного желтоватого экссудата. Гриб слегка обрастает воздушную часть образца ПВХ с одного из краев. На стенках в воздушной части пробирки виден неравномерно расположенный тонкий налет, напоминающий рост гриба. Наблюдали диффузное обрастание стенок пробирки и образца ПВХ, погруженных в толщу питательной среды. Среда приобрела яркий лимонно-желтый оттенок. На среде без сахарозы отмечали кольцевидно расположенные хлопьевидные образования примерно в высоте 0,5 см над уровнем среды (первичный рост?). На погруженной части ПВХ имеются разрозненные хлопьевидные колонии гриба.
A. sydowii РКПГ F-1115. На среде с сахарозой колония имеет вид перевернутого купола, погруженная поверхность гладкая, сферическая, красно-бурая, воздушная поверхность хлопьевидная, беловатая. Края колонии поднимаются на стекло и образец ПВХ примерно на 1 см, один край образца ПВХ подвергся обрастанию на несколько большем протяжении. Видны также удаленные колонии гриба на стенках пробирки высоко в воздушной части. Погруженные в среду стенки пробирки и образец ПВХ обросли мицелием гриба в форме крупнопетлистой сети. Среда приобрела легкий буровато-коричневатый оттенок. На среде без сахарозы рост гриба заметен высоко на стенках пробирки в воздушной части, в форме кольца на 0,5 см над поверхностью среды, а также в виде разрозненных хлопьевидных колоний на стенках пробирки и полоске ПВХ, погруженных в среду.
A. calidoustus. Колония гриба на среде с сахарозой неправильной формы: основная часть колонии пленчатая, в погруженной части серо-буро-зеленоватая, в толщу среды вдается неокрашенный вырост. Воздушная поверхность колонии буро-сероватая, имеет место плотное обрастание стенок пробирки и образца ПВХ на 1 см вверх от воздушной поверхности колонии. Отдельные хлопьевидные, петлистые и сетчатые элементы роста гриба видны и в более удаленной воздушной части посева. Рост гриба на погруженной части ПВХ прослеживается слабо. Среда окрашена в светло-желтый цвет. На среде без сахарозы неотчетливые элементы роста гриба видны преимущественно в воздушной части посева.
A. Candidus РКПГ F-123. На среде с сахарозой колония неправильной формы с вогнутой поверхностью и погруженным в питательную среду отростком. Колония белая. Края колонии, покрывающей питательную среду, почти на 1,5 см обрастают прилежащие стенки пробирки в воздушной части, выше картина обрастания значительно более разреженная. В погруженной части посева отчетливо заметно формирование относительно крупных хлопьевидных колоний гриба преимущественно на поверхности ПВХ, а не на стекле. Окрашивание среды не определяется. На среде без сахарозы видна разреженная сетчатая колония гриба на ПВХ над уровнем питательной среды, а также обрастание погруженной части ПВХ в виде мелких хлопьев. Хлопьевидный осадок заметен на дне пробирки.
A. versicolor РКПГ F-1287. На среде с сахарозой колония обратно-куполообразная, расположена косо. Погруженная в среду поверхность колонии буро-крас-
новатая, гладкая, а воздушная поверхность - беловато-серо-зеленая. На дне колонии покоится крупная капля коричневатого экссудата. Над поверхностью колонии наблюдали обрастание стенок пробирки и образца ПВХ на протяжении 1,5-2 см, постепенно разрежающееся в дистальном направлении. В погруженной части среды рост гриба виден в форме очень мелких хлопьев, равномерно покрывающих поверхность стекла и ПВХ. Среда окрашена в желтовато-красно-коричневатый цвет. На среде без сахарозы видно слабое обрастание стенок пробирки в надводной части, погруженный рост гриба отчетливо не прослеживается.
А. №1№. На среде с сахарозой колония пленкоо-бразная, вогнутая в центре в сторону жидкости. Край колонии буровато-коричневый, имеет слоистую структуру. С нижнего края под колонию ассиметрично прорастает белый пушистый мицелий. Воздушная поверхность колонии грязно-буро-коричневая. В воздушной части мицелий гриба покрывает стенки пробирки и образец ПВХ на 1,2-2 см, постепенно становясь разреженным. Питательная среда окрашена в светло-желтый цвет. На среде без сахарозы заметно образование мицелия в воздушной части посева на стенках пробирки и частично на образце ПВХ в виде разреженной сети, а также с образованием фигуры кольца на уровне исходного объема питательной среды. В погруженной части обрастание ПВХ заметно неотчетливо, на дне -небольшой хлопьевидный осадок.
A. janus A, terreus A. sydowii A. calidoustus A. candidus
A. versicolor A. ustus N. hiratsukae A. nidulans A. ochraceus
Aspergillus sp. A. clavatus A. wentii A. fumigatus A. awamori
A. niger A. tamarii A. oryzae A, flavus A. parasiticus
Рис. 1. Колонии Aspergillus spp. на среде Чапека с сахарозой и погруженными образцами ПВХ.
N. hiratsukae. На среде с сахарозой колония сильноскладчатая, неправильной формы. Окрас колонии белый с буроватыми и зеленоватыми оттенками по краям и в складках (в последнем случае, вероятно, за счёт образования конидиеносцев). Вглубь среды ас-симетрично прорастает мицелий вначале плотной, затем по мере удаления - рыхлой, почти хлопьевидной консистенции. В воздушной части посева заметен слабо развитый мицелий, покрывающий примерно 1 см в высоту от основной колонии края пробирки и ПВХ, видны удаленные звездчатые микроколонии на стенках. В погруженной части посева элементы гриба видны неясно, цвет питательной среды не изменен. На среде без сахарозы видна кольцевидно расположенная сеть мицелия, покрывающая стенки пробирки на протяженности около 0,5 см на уровне исходного объема питательной среды. На дне пробирки виден хлопьевидный осадок, в остальном объеме посева видимых признаков роста гриба не обнаружили.
A. nidulans. На среде с сахарозой колония пленко-образная, края и погруженная сторона темно-буро-красные, а воздушная поверхность бархатистая, беловато-розовая с разновеликими каплями светло-коричневатого экссудата. Над основной колонией вверх распространены нерегулярно распределенные звездчатые красноватые микроколонии, порывающие стенки пробирки, но не образец ПВХ. В погруженной части посева колония образует глубокий (около 1,5 см) сильно складчатый буровато-красный вырост с гладкой поверхностью. В погруженной части колони и образец ПВХ покрыт рисунком из мелких хлопьев, редеющим в направлении от уровня колонии к дну. Цвет питательной среды темно-желтоватый. На среде без сахарозы видно очень узкое кольцо (на стенках пробирки, переходящее также и на ПВХ) из элементов гриба округлой формы (визуально) на уровне исходного объема среды. На дне пробирки - хлопьевидный осадок. Обрастания ПВХ в погруженной части не заметили.
A. ochraceus. На среде с сахарозой колония почти плоская с двумя углублениями по сторонам от образца ПВХ. Воздушная поверхность колонии светло-охристо-желтая, зернистая из-за обильного образования конидиеносцев. Край колонии коричневатый. В воздушной части посева заметны удаленные колонии, несущие крупные конидиеносцы, такие колонии фиксируют образец ПВХ к краю пробирки, но не обрастают его. Вглубь питательной среды вдается вырост протяжённостью около 2,5 см буроватой окраски с нечеткими краями из-за разрастания мицелия. В погруженной части посева видны хлопьевидные обрастания на ПВХ, расположенные преимущественно в приближении к основной колонии. Среда приобрела легкий желтоватый оттенок. На среде без сахарозы на уровне исходного объема жидкости видны разрозненные элементы роста гриба. Различными по форме небольшими хлопьевидными образованиями покрыты стенки пробирки и образец ПВХ в погруженной части.
Aspergillus sp. (Terrei). На среде с сахарозой колония имеет сильновогнутую форму. Воздушная поверхность колонии терракотовая, видны единичные капли желтого экссудата. Край колонии и оборотная сторона несколько неровные, насыщенно-желтые. В образовавшейся под колонией воздушной полости видны хлопьевидные вторичные микроколонии гриба на
стенках пробирки. В погруженной части посева заметно почти равномерное обрастание образца ПВХ в виде разновеликих неправильной формы непрозрачных пятен. Среда окрашена в желтоватый цвет. На среде без сахарозы сеть мицелия расположена в воздушной части посева от уровня начального объема среды и распространена вверх на неопределенном протяжении. Элементы гриба фиксируют образец ПВХ к краю пробирки. В погруженной части с образцом ПВХ связаны немногочисленные, очень рыхлые на вид хлопьевидные микроколонии, на дне пробирки - белый хлопьевидный осадок.
A. clavatus РКПГ Б-9/275. Колония на среде Чапека с сахарозой плоская, косо расположенная по отношению к горизонтальному уровню. Воздушная часть колонии пушистая, беловатая. Погруженная сторона и края колонии кремовые. На реверзуме видны отдельные трещины, а также пушистые выросты мицелия. В воздушной части посева также заметны элементы мицелия на уровне исходного объема питательной среды. Напротив, погруженная часть посева, кроме небольшой рыхлой колонии на дне, элементов гриба не содержит. Среда приобрела желтоватый оттенок. На среде без сахарозы распространение роста из агарового блока с культурой не видно. От исходного уровня жидкости вверх на стенки пробирки и образец ПВХ на протяжении 1,5 см распространилась широкопетлистая сеть мицелия, единичные хлопьевидные колонии на ПВХ и белый осадок - в погруженной части посева.
A. wentii РКПГ Б-б. На среде с сахарозой колония гриба имеет вид пробки (короткого цилиндра). Колония преимущественно белая, с краев кремовая. Воздушная поверхность высокопушистая с образованием буро-коричневых конидиальных головок вблизи стенок пробирки и образца ПВХ. Под колонией, в силу испарения, образовалась воздушная полость, на оборотной стороне под колонию в питательную среду вдается длинный с относительно гладким контуром вырост. Погруженная часть посева не изменена элементами гриба, среда окрашена в желтоватый цвет. На среде без сахарозы роста из агарового блока визуально не наблюдали, рыхло расположенные элементы мицелия видны в воздушной части на образце ПВХ, а в погруженной части на нем, а также на стенках пробирки, заметны единичные хлопьевидные микроколонии.
A. fumigatus. На среде с сахарозой колония неправильной формы, двухъярусная (второй ярус образовался под первым по причине адаптации гриба к понижению уровня жидкости). Воздушная поверхность и края колонии буро-зеленоватые, на верхнем ярусе темнее. Оборотная сторона колонии белесая, измененная в форме глубоким отростком округлых очертаний. Над колонией на протяжении до 1 см видно обрастание ПВХ и стенок пробирки, а в погруженной части ПВХ обрастает грибом в форме мелкохлопьевидного рисунка на всем протяжении. Среда приобрела несколько желтоватый оттенок. На среде без сахарозы элементы гриба видны в виде ограниченного скопления на уровне исходного объема жидкости. Картина роста гриба на погруженной части ПВХ неотчётливая, на дне пробирки - беловатый хлопьевидный осадок.
A. awamori РКПГ Б-1444. На среде с сахарозой колония обратно-куполообразной формы. Воздушная поверхность колонии бархатистая, темно-коричневая,
оборотная сторона также имеет темновато-коричневый шоколадный оттенок. Мицелий гриба распространяется над колонией по ПВХ и стеклу на высоту 0,51 см. На погруженной поверхности ПВХ наблюдали равномерно расположенные мелкие, почти точечные коричневатые хлопьевидные элементы. Питательная среда приобрела желтоватый оттенок. На среде без сахарозы заметен очень слабый рост гриба на уровне исходного объема жидкости, на погруженном образце ПВХ виден неправильный рисунок из темноокрашен-ных элементов гриба, на дне пробирки - коричневатый осадок.
A. niger РКПГ F-1448. На среде с сахарозой колония имеет четкую двухуровневую структуру аналогично со штаммом А. fumigatus Л/БАЛ. Воздушная поверхность колонии на обоих ярусах черная, зернистая от крупных конидиальных головок, оборотная сторона куполообразно выгнутая, несколько складчатая, белая. В воздушной части посева на стекле также видны единичные микроколонии, несущие крупные конидие-носцы. В погруженной части колонии на образце ПВХ наблюдали темноватый тонкий сетчатый рисунок из мицелия гриба. На среде без сахарозы рост гриба над уровнем жидкости прослеживается неясно, вероятно, видимая картина образована массами спор от первичного инокулюма. В погруженной части посева ПВХ равномерно оброс сетчато-хлопьевидными элементами мицелия, расположенными более рыхло, чем на среде с сахарозой. На дне виден бурый осадок.
A. tamarii. На среде с сахарозой колония пробко-видной формы с необычно высоким ватообразным воздушным мицелием. Колония в вертикальном измерении до 3 см. Воздушная часть колонии неоднородной окраски, с белыми, кремовыми, желтоватыми и светло-коричневатыми оттенками. Оборотная сторона колонии бело-кремовая, относительно ровной формы. В погруженной части посева видны тонкие хлопья мицелия, почти равномерно покрывающие ПВХ. Среда приобрела едва заметный желтоватый оттенок. На среде без сахарозы элементы гриба кольцевидно распространяются на уровне начального объема жидкости, а также фиксируют края образца ПВХ к стеклу, а на погруженной части образца также заметны равномерно расположенные мелкие хлопьевидные элементы, на дне пробирки - беловатый осадок.
A. oryzae РКПГ F-1382. На среде с сахарозой колония имеет форму очень глубокого перевернутого купола (кратериформная). Воздушная поверхность колонии темно-травянисто-зеленая, от крупных кониди-альных головок слегка зернистая. В глубине колонии отмечали складчатый рисунок. Оборотная сторона белая, с крупными складками на боковых сторонах и мелкобугристая снизу. Погруженный образец ПВХ покрыт мицелием равномерно в виде тонкого сетча-то-хлопьевидного рисунка. В воздушной части посева также видны единичные микроколонии гриба. Питательная среда приобрела легкий хлопьевидный оттенок. На среде без сахарозы рост гриба в воздушной части посева прослеживается слабо, погруженный фрагмент ПВХ и стенки пробирки несут неясно видимые хлопьевидные микроколонии, на дне - беловатый осадок.
A. flavus РКПГ F-1375. На среде с сахарозой колония пробковидной формы, воздушный мицелий
хорошо развит, но несколько ниже, чем у A. tamarii. Воздушная поверхность колонии тускло-рыжевато-оранжевая, зернистая от конидиальных головок, несколько вогнутая. Края и оборотная сторона колонии бело-кремовые. В образовавшейся под колонией воздушной полости видно распространение роста мицелия в строну жидкости. Образец ПВХ над колонией фиксирован элементами гриба к краям пробирки, в погруженной части на образце ПВХ наблюдали мелкие хлопья. Питательная среда приобрела несколько более темный оттенок в сравнении с незасеянной. На среде без сахарозы в воздушной части посева рост гриба неотчетливый. На погруженном образце ПВХ видны равномерно расположенные хлопьевидные элементы. На дне пробирки образовался беловатый осадок.
A. parasiticus РКПГ F-68. На среде с сахарозой рост напоминает A. flavus РКПГ F-1375. Воздушная поверхность колонии зернистая, тускло-темно-зеленая. Края колонии и погруженная часть беловатые, гладкие, в воздушную полость под основной колонией вдается мешкообразный вырост. На образце ПВХ в питательной среде видны неравномерно расположенные хлопьевидные элементы. Отдельные микроколонии гриба отмечали в воздушной части посева на стенках пробирки. Питательная среда приобрела едва заметный желтоватый оттенок. На среде без сахарозы признаки роста микромицета сомнительные - хлопьевидные структуры видны в погруженной части среды, на дне также образовался мелкодисперсный осадок.
Особенности микроскопической организации Aspergillus spp. при росте в опытных посевах. Приведенное ниже описание составлено при наблюдении над посевами на среде с сахарозой. Край колонии, находящейся на границе питательной среды и воздуха, представлен сетью гиф, образующих «петли» разной величины. У большинства изученных штаммов (кроме плеоморфного A. clavatus) в этой локализации видны признаки спороношения - отчетливо формирующиеся конидиальные головки на более или менее выраженных конидиеносцах (Рис. 2: А). Кроме того, наблюдали также изолированные микроколонии на стекле в удалении от образца ПВХ; в этих колониях у части изо-лятов заметны конидиеносцы, также формируются и микроколонии, состоящие только из вегетативного мицелия (Рис. 2: Б). В воздушной части посева тонкие полоски мицелия, часто с конидиносцами, фиксируют край образца ПВХ к стеклянной стенке (Рис. 2: В). Обрастание воздушной части образца ПВХ вне контакта со стеклом не выявили. В погруженной части посева в культурах, формирующих глубокие выросты и «карманы», иногда отмечали локальные разрастания пушистого мицелия. На пластине ПВХ в погруженной части посева (если у штамма регистрировали рост в этом локусе) образуются микроколонии неправильно-звездчатой формы, нерегулярно расположенные, состоящие из вегетативных гиф (Рис. 2: Г). Обрастание стекла в погруженной части происходит более равномерно, микроколонии здесь обычно меньше в диметре, чем на ПВХ, имеют похожее строение (Рис. 2: Д).
Aspergillus sp. (Terrei) A. flavus A.janus
A. nidulans A. fumigatus A, wentii
A. flavus /\ nidulans A awamori
A.janus A. sydowii A, nidulans
A. flavus a oryzae " awamori
Рис 2. Детали микроскопического строения опытных культур Aspergillus spp. (примеры). Обозначения: ряд А - край основной колонии вблизи прикрепления к стенкам пробирки; ряд Б - микроколонии на стекле в воздушной части посева; ряд В - обрастание в месте прилегания полоски ПВХ к стенке пробирки; ряд Г - рост аспергиллов на погруженной части образца ПВХ; ряд Д - обрастание поверхности стекла в погруженной части посева.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенного наблюдения установлено, что внесение ПВХ в питательную среду не искажает макро- и микроморфологические особенности роста Aspergillus spp. В пользу этого утверждения свидетельствует хорошо выраженная близкая к типовой пигментация колоний, продукция экссудата и диффундирующего пигмента у видов, склонных к этим феноменам. ПВХ, по-видимому, слабо подходит для аспергиллов в качестве самостоятельного источника углерода, что подтверждено исключительно слабым ростом тест-культур на среде без сахарозы. Для видимых здесь рудиментарных структур грибов пластическим материалом, очевидно, служат вещества, запасенные в конидиях. В дальнейшем с целью разработки экономичной питательной среды для деградации ПВХ аспергиллами в крупных масштабах следует заменить сахарозу на какой-либо иной низкомолекулярный источник органического углерода, например, различные побочные продукты органического синтеза или переработки каустобиолитов. В данном случае низкомолекулярный источник углерода выполняет функцию «затравки» для наращивания биомассы гриба-деструктора, а затем в условии дефицита питательных веществ сформированные биопленки, гипотетически, должны приступить к утилизации ПВХ.
По данным эксперимента, поверхность стекла несколько более благоприятна для обрастания, нежели поверхность ПВХ. Это обстоятельство подтверждено значительно более протяженным ростом Aspergillus spp. на стекле в воздушной части посева, чем на ПВХ, а также более густым обрастанием стенок пробирки в
питательной среде. Косвенно этот факт указывает на целесообразность внесения частиц силиката на этапах полимеризации ПВХ для создания композитной минерально-органической массы, более пригодной для обрастания при биодеградации. С целью выяснения различий адгезии и колонизации силикатного стекла и ПВХ имеет определенный интерес исследование тонкого строения микроколоний грибов на этих поверхностях с помощью сканирующей электронной микроскопии. Наиболее интенсивно биомасса грибов формируется на границе питательной среды и воздуха. Снижение уровня питательной среды в посеве (в силу длительной инкубации) привело к формированию адаптивных реакций культур, направленных на улучшение потребления жидкости и питательных веществ: формирование «двухуровневых» колоний (A. fumigatus, A. niger) и глубоких выростов, распространяющихся в направлении дна пробирки (A. wentii, A. ochraceus, A. nidulans). Таким образом, для биодеградации требуется смачивание частиц ПВХ (возможно, мелкодисперсных), а также хорошая аэрация.
На сегментах полосок ПВХ ниже уровня питательной среды наиболее интенсивное обрастание выявили у тест-штаммов видов A. fumigatus, A. flavus, A. tamarii, A. oryzae, A. niger, A. terreus, Aspergillus sp. (Terrei), A. Candidus, A. sydowii, A. nidulans и A. janus. Из перечисленных культур штамм A. tamarii также отличался от остальных сильным развитием воздушного мицелия, охватывающего образец ПВХ. В связи с такими ростовыми характеристиками данный изолят может быть рекомендован в качестве перспективного штамма для дальнейшего исследования взаимодействия с ПВХ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Zhang M., Buekens A., Jiang X., Li. X. Dioxins and polyvinylchloride in combustion and fires. Waste Manag. Res. 2015; Vol. 33 (7): 630-643.
2. Patil R., Bagde U.S. Isolation of polyvinyl chloride degrading bacterial strains from environmental samples using enrichment culture technique. African Journal of Biotechnology. 2012; Vol. 11 (31): 7947-7956.
3. Singh R., Pant D. Polyvinyl chloride degradation by hybrid (chemical and biological) modification. Polymer Degradation and Stability. 2015; 123.
4. Muthukumar A., Veerappapillai S. Biodegradation of plastics - a brief review. Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res. 2015; 31 (2): 204-209.
5. Alshehrei F. Biodegradation of synthetic and natural plastic by microorganisms. Journal of Applied & Environmental Microbiology. 2017; 5 (1): 8-19.
6. Arutchelvi J., Sudhakar M., Arkatkar A. et al. Biodegradation of polyethylene and polypropylene. Indian Journal of Biotechnology. 2008; 7: 9-22.
7. Ali M.I., Ahmed S., Robson G. et al. Isolation and molecular characterization of polyvinyl chloride (PVC) plastic degrading fungal isolates. J. Basic. Microbiol. 2014; 54 (1): 18-27.
8. Калинина И.Г., Гумаргалиева К.З., Семенов С.А. Биокоррозия пластифицированного поливинилхлорида под воздействием микроскопического гриба Aspergillus niger. Коррозия: материалы, защита. 2017; 2: 37-40. [Kalinina I.G., Gumargalieva K.Z., Semenov S.A. Biokorroziya plastifitsirovannogo polivinilhlorida pod vozdeystviem mikroskopicheskogo griba Aspergillus niger. Korroziya: materialyi, zaschita. 2017; 2: 37-40. (In Russ)].
Поступила в редакцию журнала 27.02.2018 г.
Рецензент: И.А. Босак
