CC BY
109
УДК 615.3:616-022:582.28
Е. Ф. Семенова, М. В. Микаелян, Е. В. Преснякова, А. И. Шпичка
ОСОБЕННОСТИ МИКОФЛОРЫ СЕМЯН ЛЕКАРСТВЕННЫХ КУЛЬТУР СРЕДНЕВОЛЖСКОГО РЕГИОНА
Аннотация. Проведенная комплексная микологическая оценка выявила микромицетов следующих родов: Peronospora, Rhizopus, Altemaria, Bi-polaris, Phoma, Fusarium, Sclerotinia, Erysiphe, Penicillium, Аspergillus, Candida. Последние три, вероятнее всего, являются заносными для семян и плодов как вида лекарственного растительного сырья. Представители родов Erysiphe, Peronospora, Sclerotinia являются высокоспециализированными фитопатогенами и не могут служить возбудителями заболеваний человека. Выявленные микромицеты других родов могут быть связаны с заболеваниями человека и выступать в качестве потенциальных этиологических агентов инфекций.
Ключевые слова: фитопатогены, микофлора семян и плодов, лекарственное сырье, этиологические факторы заболеваний человека, возбудители микозов.
Abstract. The complex mycological estimation that was carried out revealed the micromycetes of following genus: Peronospora, Rhizopus, Alternaria, Bipolaris, Phoma, Fusarium, Sclerotinia, Erysiphe, Penicillium, Aspergillus, and Candida. Probably, the three last ones are transitional for seeds and fruits as a kind of medicinal vegetative raw material. The representatives of genus Erysiphe, Peronospora, Sclerotinia are high-specialized phytopathogens and cannot be germs of human diseases. Revealed micromycetes of others genus can represent itself as potentional etiological agents of infections. Keywords: phytopathogens, mycoflora of seeds and fruits, medicinal raw material, etiological factors of human diseases, mycosis germs.
Введение
Лекарственные культуры, как и другие, являются естественной средой обитания микроорганизмов. Микробиоту растений подразделяют на эпифит-ную и фитопатогенную. К эпифитным относят организмы, развивающиеся в норме на поверхности растения и не наносящие ему вреда. Они не проникают внутрь тканей, растут за счет обычных выделений и органических загрязнений поверхности растения, устойчивы к фитонцидам, высушиванию и ультрафиолетовому облучению, препятствуют проникновению фитопатогенных микроорганизмов в растительные ткани [1]. Фитопатогенами являются чужеродные болезнетворные организмы (паразиты), которые развиваются на поверхности или внутри растения, извлекают из его клеток питательные вещества и приводят растение к заболеванию. По определению Ю. А. Чикина (2001), паразитизм - форма межвидовых взаимоотношений двух организмов, принадлежащих к разным видам, носящая антогонистический характер, при которой один организм (паразит) использует другого (хозяина) в качестве сре-
ды обитания (среда первого порядка) и /или источника пищи, возлагая на него регуляцию своих отношений с внешней средой (среда второго порядка) [2].
Облигатные паразиты (биотрофы) составляют 25 % всех фитопатогенов, могут питаться только за счет живого хозяина. Факультативные паразиты (полусапротрофы, некротрофы) способны питаться не только мертвыми тканями ослабленных растений, но и убивать еще живые, но ослабленные близлежащие клетки, выделяя токсины. Полупаразиты (гемибиотрофы, факультативные сапротрофы) ведут паразитический образ жизни, но в определенных условиях могут развиваться и на мертвом органическом субстрате. Фитопатогенные микроорганизмы (возбудители микозов, бактериозов, виро-зов, вироидозов и микоплазмозов) характеризуются специализацией - приуроченностью к определенному питательному субстрату и способностью заражать определенный набор видов макроорганизмов [3].
Особое значение при рассмотрении фитопатогенов в качестве возможных этиологических факторов заболеваний человека имеет эпидемиологическая (экологическая) классификация, т.е. по факторам передачи и источникам инфекции. Различают почвенные (корневые) болезни - распространяются через почву, заражая корни растения, например: возбудители таких заболеваний у шиповников - грибы р. Rosselinia; семенные (матрикально-дочерние) - передаются от материнского растения к дочернему через семена (плоды), например: возбудители - грибы р. Ciboria - через плоды березы; воздушнокапельные (листо-стеблевые) - распространяются через воздушную среду (ветром) с каплями дождя и заражают листья, стебли растений), например: возбудители - грибы р. Sclerotinia; трансмиссивные - передаются организма-ми-переносчиками, например: возбудители «медвяной росы» - грибы р. Claviceps - насекомыми [1-3]. Таким образом, фактором передачи инфекции может служить другой организм или участок окружающей среды, куда возбудитель болезни попадает из источника инфекции (инфицированного растения или его части, контаминированного лекарственного растительного сырья) и откуда он попадает в нового хозяина.
Проведенный фитопатологический и микробиологический мониторинг лекарственных культур в Среднем Поволжье показал, что наиболее распространенными по сравнению с болезнями, вызываемыми другими таксономическими группами микроорганизмов, являются микозы [4]. Поэтому предметом настоящего исследования является микофлора семян лекарственных культур как вида лекарственного сырья, полученного в условиях Средневолжского региона. Актуальность данной темы в современных условиях возрастает в связи с расширением ассортимента и увеличением объемов потребляемых лекарственных препаратов и пищевых биологически активных добавок на основе растительного сырья [5-8]. Лица с иммунной системой, подавленной в результате первичной болезни и (или) ее лечения, становятся значительно более подверженными инвазивным грибковым инфекциям. Подобным же образом большой опасности подвергаются больные без явных нарушений в иммунной системе, госпитализируемые для проведения операций. Оппортунистические инфекции стали основной проблемой для современных вра-чей-практиков и для специалистов по лабораторной диагностике. Возбудители микозов играют заметную роль как возбудители таких инфекций [4, 9]. Возросли не только число и тяжесть грибковых инфекций, но также разнообразие грибов, выявленных в качестве этиологических агентов. Например,
были получены данные о возникновении заболеваний с характерными клиническими проявлениями (кератит, феогифомикоз, синусит, гепатит, перитонит) при инфицировании такими патогенами, как Alternaria alternata, Colletotrichum coccodes, Pythium insidiosum, видами родов Aspergillus, Fusarium и др. [4, 9-11].
Цель исследования: изучение состава патогенной микофлоры семян основных лекарственных культур Средневолжского региона для прогнозирования этиологического потенциала этого вида лекарственного растительного сырья в качестве возможного источника возбудителей микозов.
Материал и методы исследования
Объектом изучения были образцы семян и плодов льна культурного (Linum usitatissium L.), мака (Papaver rhoeas L., Papaver somniferum L.,), рыжика обыкновенного (Camelina sativa L.), горчицы (виды Sinapis L.) и катрана абиссинского (&ambe abyssinica ^chst.), полученные в условиях Пензенской области в 1995-2007 гг. (табл. 1).
Таблица 1
Инфицированность семян и плодов лекарственных культур
Название лекарственной культуры Количество изученных образцов (семян, плодов*) Инфицированность образцов, %
Среднее значение Пределы варьирования
Camelina sativa L. 73 (10950) 18,4 0,0-96,0
Crambe abyssinica НосМ. 1, 28* (100, 2800*) 1,0 23,2* 0,0-2,0 3,5-53,0*
виды Sinapis L. 9 (1350) 64,0 28,0-98,0
виды Papaver L. 23 (3450) 12,9 0,0-98,0
Linum usitatissium L. 25 (3750) 5,7 0,0-75,0
Поверхностную стерилизацию проводили в чашках Петри на основе рекомендованных методов с учетом упрощения, уменьшения трудоемкости процедуры и экономичности с применением 5, 10 % растворов перекиси водорода и экспозицией 10-100 мин [12-14]. Образцы помещали в термостат и инкубировали при температуре 30 ± 2°С в течение двух суток, затем при температуре 24 ± 2°С в течение 5-6 суток. При появлении на плодах и семенах налета готовили нативные препараты и микроскопировали с использованием микроскопа «Микмед-1». Микробиологический анализ и фитопатологическую экспертизу проводили на основе справочной литературы по идентификации патогенов [9, 10, 14, 15]. Выделение в чистую культуру осуществляли на плотных питательных средах: картофельном агаре, кукурузно-сахарозном агаре, агаре Сабуро без бензилпенициллина и с добавлением 1000 мг /1 л среды [9, 12, 14] . Полученные данные статистически обрабатывали [16].
Результаты и обсуждение
Результаты проведенной предварительной оценки эффективности поверхностной обработки плодов и семян различных лекарственных культур свидетельствуют, что в отдельных случаях 5 % раствор перекиси водорода в условиях эксперимента стимулировал рост микроорганизмов. 10 % раствор
перекиси водорода значительно снижал инфицированность семян, что в последующем упростило выделение и дифференциацию микокультур: оптимальный предел инфицированности семенного материала для изоляции основных патогенов составил 10 %. Кроме того, проведенное сравнительное изучение вариантов поверхностной обработки семян и плодов позволило определить оптимальную продолжительность экспозиции растворами перекиси водорода, равную не менее 10, 20, 30 мин соответственно для семян мака, рыжика, льна, горчицы и катрана.
Исходная зараженность микромицетами образцов семян изучаемых лекарственных культур достигала 64,0 % и плодов 23,2 % (в среднем). Уровень инфицированности отдельных образцов колебался в широких пределах: семян льна - от 0,0 до 75,0 %, рыжика - от 0,0 до 96,0 %, горчицы - от 28,0 до 98,0 %, мака - от 0,0 до 98,0 %, катрана - от 0,0 до 2,0 %, плодов катрана - от 3,5 до 53,0 % (табл. 1, рис. 1).
На рис. 1 представлены количественные характеристики микрофлоры инфицированных образцов семян лекарственных культур. Микробиологическая оценка 13-ти образцов рыжика, 11-ти образцов льна и семи образцов мака не выявила видимого роста микроорганизмов, что свидетельствует, вероятнее всего, об отсутствии инфекции в семенах указанных образцов. Частота встречаемости (доля) неинфицированных образцов составила для мака 3,0 %, для рыжика 17,8 %, для льна 44,0 %. При этом все образцы катрана и горчицы были инфицированными. Следует отметить, что высоким уровнем инфицированности характеризовались семена горчицы, низким - семена льна. Чаще всего наблюдалась микоинфекция: белый паутинистый мицелий, практически обнаруживаемый на всех объектах изучения; белый ватообразный и белый пушистый налет - чаще всего на семенах рыжика; белый мучнистый налет -в единичных случаях; черный бархатистый налет, частота встречаемости которого на семенах всех изучаемых культур высокая.
С применением микроскопического и культурального методов были изучены представители микофлоры изучаемых лекарственных растений в ассоциативных и чистых культурах на агаризованных средах, а также на естественных субстратах (семенах и плодах). Идентификацию патогенов проводили на основании выявленных микро- и макроморфологических особенностей, которые представлены ниже.
Alternaría sp. Источник выделения: плоды катрана, семена горчицы, рыжика и льна. Микроморфология: гифы септированные, от светло- до темнокоричневых; конидии золотисто-коричневые, разнообразные по форме (яйцевидные, обратнобулаво- или грушевидные с апикальным носиком или без него, с 3-8 поперечными и 1-2 продольными перегородками. Макроморфология на естественном субстрате: пушистый или шерстистый налет от серого до светло-оливкового цвета; на агаре Сабуро - колонии от зеленого до черного цвета; на картофельном агаре - от бело-серого до оливковокоричневого цвета.
Helminthosporium sp. синоним Bipolaris sp. Источник выделения: плоды катрана, семена горчицы, рыжика, льна и мака. Микроморфология: гифы септированные, коричневые; конидии булавовидные с 3-5 поперечными перегородками, прорастают биполярно. Макроморфология на естественном субстрате: бархатистый налет от бурого до черного цвета; на картофельном агаре - пушистые или шерстистые колонии, вначале белые, впоследствии приобретающие окраску от серой до черной.
количество пораженных плодощ, % количество пораженных сеиян,
образцы
а)
100
90
SO
70
60
50
40
30
20
10
О
hi
1012
Ti
I 'I
П 111
ss 100 Í 90
5 ю §
1—
и! k 6 ■ 6 4 ■ - - -
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29
образцы
1 2 3 4 5 6 7
образцы
Х 70 .й
I 60 М ВО (О
§• 40
0 30
Ей
с 20
W
1 10 =.
§ о
2
42
Ш _2S
1 |
I I
1 1
1 2 3 4 5 6 7 8 9
образцы
б)
95 98
S 80
3 70
и 30
а 20 | Ю
S о
40
I
1
1 10 1 ■ 6 ß 4
1 1 1 1 ■ и ш L L
1 2 3 4 5 6 7
образцы
В) Г) д)
Рис. 1. Инфицированность семян (а, в, г, д) и плодов (б) лекарственных культур Средневолжского региона: а - рыжик посевной Camelina sativa L. (1995-2007), б - катран абиссинский Crambe abyssinica Höchst (2005-2007); в - горчица Sinapis L. (2005-2007); г - мак - Papaver somniferum L., Papaver rhoeas L. (2004-2007); д - лен обыкновенный Linum usitatissium L. (2001-2007)
<v
О/
SÍ
-SÍ
Si
55
Ci
К
SÍ
£
s
к
о
§
О/
к
-Sí
Sí
Erysiphe sp. Источник выделения: плоды катрана. Микроморфология: белые мелкие конидии эллипсоидальной формы. Макроморфология на естественном субстрате: белый мучнистый налет.
Peronospora sp. Источник выделения: плоды катрана. Микроморфология: желтоватый дихотомически разветвленный мицелий с жировыми включениями, впоследствии приобретающий коричневый цвет; конидии овальные. Макроморфология на естественном субстрате: желтовато-бурые пятна, серофиолетовый налет.
Rhizopus sp. Источник выделения: семена мака, рыжика, горчицы, катрана, льна. Микроморфология: мицелий дихотомически разветвлен, с утолщениями. Макроморфология на естественном субстрате: белый паутинистый налет.
Fusarium sp. Источник выделения: семена рыжика, катрана, горчицы, мака и льна. Микроморфология: гифы септированные, споры бесцветные с несколькими поперечными перегородками. Макроморфология на естественном субстрате: белый налет впоследствии с розоватым оттенком; на картофельном агаре колонии ватообразные, вначале белые, впоследствии слабо пигментированные кремовые или с розоватым оттенком.
Sclerotinia sp. Источник выделения: семена мака. Микроморфология: беловатый мицелий с многочисленными склероциями. Макроморфология на естественном субстрате: белый ватообразный налет.
Penicillium sp. Источник выделения: семена рыжика. Микроморфология: мицелий многоклеточный, конидиеносцы имеют вид кисточек. Макроморфология на естественном субстрате: белый налет, приобретающий сизоватозеленую окраску; на агаре Сабуро колонии вначале белые, впоследствии приобретающие серо-зеленую окраску.
Aspergillus sp. Источник выделения: семена мака, рыжика. Микроморфология: гифы септированные, бесцветные. Конидии шарообразные от коричневого до черного цвета. Макроморфология на естественном субстрате: пушистый или ватообразный темнеющий налет; на картофельном агаре колонии пушистые или ватообразные, вначале белые, затем становящиеся черными.
Phoma sp. Источник выделения: плоды катрана, семена рыжика. Микроморфология: гифы септированные, от почти бесцветных до коричневых. Пикниды от шаровидных до грушевидных, тонкостенные, одиночные. Макроморфология на естественном субстрате: светло-серый или кремовый налет; на агаре Сабуро колонии шерстистые или бархатистые бежевые, оливковые или серые.
Candida sp. Источник выделения: плоды катрана. Микроморфология: псевдогифы практически отсутствуют, конидии округлой или овальной формы. Макроморфология на естественном субстрате: белый или светлокремовый налет; на агаре Сабуро колонии белые или кремовые, гладкие или порошащие.
Таким образом, основными патогенами, которые могут передаваться с семенами и плодами лекарственных культур, являются грибы родов Alter-naria, Helminthosporium (Bipolaris), Erysiphe, Peronospora. Возможна также передача Rhizopus sp., Fusarium sp., Sclerotinia sp., Phoma sp. Представителями транзиторной микофлоры, обнаруженными в единичных случаях, являются плесневые грибы родов Penicillium, Аspergillus и дрожжеподобные грибы рода Candida. Сравнительный микологический анализ изучаемых образцов
показал, что относительная частота встречаемости (распространенность по лекарственным культурам) возбудителей фузариоза составила 6,5-46,8 %, альтернариоза - 0,0-55,8 %, гельминтоспориоза - 0,0-95,5% (рис. 2). Максимальная инфицированность фузариями была выявлена у семян рыжика, минимальная - у льна и мака; альтернариями - у плодов катрана и семян мака, соответственно; биполярисами (гельминтоспориями) - у плодов катрана и семян рыжика, мака, льна соответственно.
Camelina
16,3
б)
Papaver
0.0
Camelina
0.0
Linum
0,0
Sinapis
4,5
І
її ЇЇ ЇЇ ШИПИ її І
Д1ІІИІІИ11ІІІ111И
Crambe
95,5
в)
Рис. 2. Частота встречаемости (1995-2007) основных патогенов некоторых лекарственных культур Средневолжского региона (%): а - Fusarium sp.; б - Altemaria sp.; в - Bipolaris sp.
Заключение
Известно, что при использовании инфицированного и контаминиро-ванного растительного сырья микробы попадают в субстанцию и готовую лекарственную форму. Отрицательными последствиями могут быть снижение или полная утрата терапевтической ценности, развитие инфекционных заболеваний, попадание токсических продуктов [6-8, 11].
Проведенная комплексная микологическая оценка с учетом фитопатологического мониторинга выявила следующих микромицетов: Peronospora sp. (класс Oomycetes, порядок Peronosporales); Rhizopus sp. (класс Zygomycetes, порядок Mucorales); Alternaria sp. (класс Ascomycetes, порядок Dothidiales); Bipolaris син. Helminthosporium sp. (класс Ascomycetes, порядок Dothidiales); Phoma sp. (класс Ascomycetes, порядок Dothidiales); Fusarium sp. (класс Ascomycetes, порядок Hypocreales); Sclerotinia sp. (класс Ascomycetes, порядок Helotiales); Erysiphe sp. (класс Ascomycetes, порядок Erysiphales); Penicillium sp. (класс Ascomycetes, порядок Eurotiales); Аspergillus sp. (класс Ascomycetes, порядок Eurotiales); Candida sp. (класс Ascomycetes, порядок Endomycetalis). Последние три, вероятнее всего, являются заносными для семян и плодов как вида лекарственного растительного сырья. Представители родов Erysiphe, Peronospora, Sclerotinia являются высокоспециализированными фитопатогенами и не могут служить возбудителями заболеваний человека. Выявленные мик-ромицеты других родов могут быть связаны с заболеваниями человека и выступать в качестве потенциальных этиологических агентов инфекций. Имеющиеся сведения по отдельным представителям микофлоры изучаемых лекарственных культур свидетельствуют, что альтернарии могут вызывать синуситы, кератомикозы, онихомикозы; биполярисы - феогифомикозы; фузарии - кератиты, перитониты и другие заболевания [4, 9, 10]. При наличии этих нозологических форм определенное значение имеет повышение качества дифференциальной лабораторной диагностики и рациональный выбор антимикотиков, в частности, по спектру действия на идентифицированных возбудителей.
Список литературы
1. По пкова, К. В. Общая фитопатология / К. В. Попкова. - М. : Дрофа, 2005. -445 с.
2. Чикин, Ю. А. Общая фитопатология / Ю. А. Чикин. - Томск : Изд-во ТГУ, 2001. - Ч. 1. - 170 с.
3. Семенкова, И. Г. Фитопатология / И. Г. Семенкова, Э. С. Соколова. - М. :
Академия, 2003. - 480 с.
4. Семенова, Е. Ф. О фитопатогенах как возможных этиологических факторах заболеваний человека / Е. Ф. Семенова [и др.] // Актуальные проблемы современного практического здравоохранения : сборник трудов XVI межрегиональной научно-практической конференции памяти академика Н. Н. Бурденко. - Пенза : Информационно-издательский центр ПензГУ, 2008. - С. 244-245.
5. Бондаренко, В. М. Классификация пробиотических лекарственных препаратов, биологически активных добавок к пище и продуктов функционального питания / В. М. Бондаренко // Клиническое питание. - 2007. - № 3. - С. 9-11.
6. Васнецова, О. А. Медицинское и фармацевтическое товароведение / О. А. Васнецова. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2005. - 608 с.
7. Лекарственное сырье растительного и животного происхождения / под ред. Г. П. Яковлева. - СПб. : Спецлит, 2006. - 845 с.
8. Соколов, С. Я. Фитотерапия и фитофармакология : руководство для врачей / С. Я. Соколов - М. : Медицинское информационное агентство, 2000. - 976 с.
9. Саттон Д. Определитель патогенных и условно патогенных грибов / Д. Саттон,
A. Фотергилл, М. Ринальди. - М. : Мир, 2001. - 486 с
10. Билай, В. И. Справочник. Микроорганизмы - возбудители болезней растений /
B. И. Билай. - Киев : Наукова думка, 1988. - 550 с.
11. Косагиза, Т. В. Эпидемиологические аспекты грибковой аллергии / Т. В. Ко-сагиза, П. А. Прокаева // Актуальные вопросы современной клинической медицины : ХУ Научные чтения памяти академика Н. Н. Бурденко. - Пенза : Информационно-издательский центр ПензГУ, 2006. - С. 145.
12. Билай, В. И. Методы экспериментальной микологии / В. И. Билай. - Киев : Наукова думка, 1973. - 242 с.
13. Маркова, Ю. А. Выделение условно патогенных микроорганизмов из растений / Ю. А. Маркова, А. С. Романенко // Гигиена и санитария. - 2006. - № 1. - С. 58-60.
14. Наумова, Н. А. Анализ семян на грибную и бактериальную инфекцию / Н. А. Наумова. - Л. : Колос, 1970. - 208 с.
15. Илиева, С. Лекарственные культуры / С. Илиева . - София : Земиздат, 1971. -261 с.
16. Платонов, А. Е. Статистический анализ в медицине и биологии / А. Е. Платонов. - М. : РАМН, 2000. - 52 с.
Семенова Елена Федоровна кандидат биологических наук, доцент, кафедра общей и клинической фармакологии, Медицинский институт, Пензенский государственный университет
E-mail: sef7@sura.ru
Микаелян Максим Вадимович студент, Медицинский институт, Пензенский государственный университет
E-mail: mikaeljan89@mail.ru
Преснякова Елена Викторовна
кандидат биологических наук, доцент, кафедра медицинских приборов и оборудования, Медицинский институт, Пензенский государственный университет
E-mail: sgerash@inbox.ru
Шпичка Анастасия Иосифовна
студент, Медицинский институт, Пензенский государственный университет
E-mail: ana-shpichka@yandex.ru
Semenova Elena Fedorovna Candidate of biological sciences, associate professor, sub-department of general and clinical pharmacology, Medical Institute, Penza State University
Mikaelyan Maksim Vadimovich Student, Medical Institute,
Penza State University
Presnyakova Elena Viktorovna Candidate of biological sciences, associate professor, sub-department medical devices and equipment,
Medical Institute, Penza State University
Shpichka Anastasiya Iosifovna Student, Medical Institute, Penza State University
УДК 615.3:616-022:582.28 Семенова, Е. Ф.
Особенности микофлоры семян лекарственных культур Средневолжского региона / Е. Ф. Семенова, М. В. Микаелян, Е. В. Преснякова, А. И. Шпичка // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2010. - № 1 (13). - С. 47-55.
