CC BY
36
ЖВАЧНЫЕ
УДк «а«™* 669 Особенности индукции
ферментов молока у коров с разной реакцией на туберкулиновые пробы
В.А. Блинов, Ю.В. Платонова, Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова» (г. Саратов)
Сокращения: АЛТ — аланинаминотрансфераза; АСТ — аспартатаминотрансфераза; Гр — группа; КАМ — комплексный аллерген из атипичных микобактерий ЛДГ — лактат-дегидрогеназа; МТ — масса тела; ЩФ — щелочная фосфа-таза
Введение
Лактосинтаза, ЩФ, ксантиноксидаза, лизоцим и ряд других ферментов образуются de novo в клетках молочной железы и переходят в молоко во время секреции. Некоторые ферменты (протеиназа, каталаза, рибонуклеаза, альдолаза и др.) поступают в молоко из крови животного [1]. Определение активности указанных ферментов важно для контроля санитарно-гигиенического состояния молока, эффективности его переработки при производстве кисломолочных продуктов, сыров, а также характеристики их пищевой ценности. Особую значимость это приобретает при использовании молока от коров, положительно реагирующих на туберкулин, но не имеющих явных клинических признаков заболевания. Такое молоко применяют в пищу после пастеризации или перерабатывают в топленое масло и плавленые сыры [2].
В доступной литературе мало данных о влиянии на активность ферментов молока коров режима кормления, возраста, породы, стадии лактации и патологических процессов [4]. Кроме того, в этих исследованиях не применяли индукционный метод [3], позволяющий более четко судить о сдвигах активности ферментов после воздействия на организм экзогенных субстратных или гормональных факторов.
Цель настоящего исследования состояла в изучении активности ряда ферментов молока и степени их индукции у коров с различной реакцией на туберкулиновую пробу.
Материалы и методы
Работу выполняли в одном из хозяйств Саратовской области и в научной лаборатории кафедры биотехнологии, органической и биологической химии Саратовского ГАУ. При постановке диагноза учитывали результаты эпизоотологических исследований, туберкулиновой пробы и патологоанатомиче-ского вскрытия животных. Для выявления животных, инфицированных атипичными микобактериями, аллергический тест
проводили с КАМ.
48 коров черно-пестрой породы разделили на четыре Гр. Животные Гр I (контроль) не реагировали на туберкулин и КАМ. Коровы Гр II в большей степени реагировали на КАМ, чем на туберкулин. Животные Гр III и IV реагировали только на туберкулин или на оба аллергена соответственно.
Отбор проб молока проводили во время утренней дойки. В них определяли активность ферментов АСТ, АЛТ, ЛДГ, ЩФ, каталазы и пероксидазы.
В предварительных опытах, проведенных на здоровых кроликах, установили, что адекватным индуктором ЩФ является фосфатный буферный раствор с рН 6,8...7,2 (Диахим-Буфер-Г, Россия), ЛДГ — молочная кислота (Вектон, Россия), транс-аминаз — глицерин (Лаверна, Германия), ЛДГ и трансаминаз — гидрокортизон ацетат (Гедеон-Рихтер, Венгрия). С учетом полученных данных коровам перорально вводили фосфатный буферный раствор (2,5 мл/кг МТ), молочную кислоту (0,6 мл/ кг МТ, предварительно разбавив ее 40 %-й раствор водой в соотношении 1 : 3) или глицерин (2 г/кг МТ). Гидрокортизон ацетат (2,2 мг/кг МТ) инъецировали в предлопаточную область внутримышечно. Указанные индукторы активности ферментов применяли животным натощак, а пробы молока для анализов брали через 3, 6 и 24 ч.
Результаты исследований
Изменение активности ферментов молока у коров с разной реакцией на туберкулиновые пробы до сих пор не привлекло должного внимания исследователей. Исходя из этого сначала определили активность указанных ферментов в молоке животных всех опытных групп (таблица).
Как следует из таблицы, активность ферментов молока у больных туберкулезом коров претерпевает существенные изменения. Так, в молоке коров Гр III и IV статистически достоверно (р < 0,02) по сравнению с контрольной Гр I была повышена активность АСТ, АЛТ и ЛДГ. В то же время активность ЩФ и пероксидазы в их молоке была на 24,3.48,8 % (р < 0,02) ниже, чем в норме.
Пероральное введение фосфатного буферного раствора не вело к статистически достоверному изменению (р > 0,5) активности всех исследованных ферментов молока коров.
Активность ферментов молока у коров с разной реакцией на аллергические пробы
Активность ферментов Группы животных
I (Т- КАМ-) II (ТКАМ* ) III (Т* КАМ) IV (Т+ КАМ* )
АСТ, мккат/л 0,030 ± 0,003 0,028 ± 0,006 0,042 ± 0,003 0,042 ± 0,004
АЛТ, мккат/л 0,027 ± 0,003 0,025 ± 0,003 0,032 ± 0,002 0,034 ± 0,001
ЛДГ, мккат/л 0,49 ± 0,02 0,49 ± 0,03 0,63 ± 0,03 0,67 ± 0,05
ЩФ, нмоль/л 152,9 ± 9,0 150,1 ± 12,0 115,8 ± 5,1 111,2 ± 8,4
Каталаза, (каталазное число, мг) 0,48 ± 0,04 0,48 ± 0,07 0,52 ± 0,05 0,53 ± 0,08
Пероксидаза (% активности) 45,9 ± 2,8 45,5 ± 1,2 27,3 ± 2,7 23,5 ± 4,4
Обозначения. Т+ и Т- — положительная и отрицательная реакции на туберкулин соответственно; КАМ++ КАМ- — положительная и отрицательная реакции на КАМ соответственно; мккат — микрокатал.
РВЖ СХЖ №4-2008
23
ЖВАЧНЫЕ
В молоке коров контрольной Гр через 6 ч после введения молочной кислоты активность ЛДГ увеличилась на 52,2 % (р < 0,02), а у животных Гр II — на 45,8 % (р < 0,05) по сравнению с исходным уровнем. В молоке коров Гр III и IV активность ЛДГ совершенно не изменилась. Вероятно, ЛДГ в молочной железе таких животных не образуется, а поступает в молоко из крови. Полученные данные позволяют считать, что больные туберкулезом коровы в 3,7...5 раз слабее секре-тируют данный фермент в молоко, чем здоровые животные. Интересно, что под влиянием молочной кислоты в молоке коров также повышалась активность АЛТ. Это было особенно выражено у больных животных. Так, у коров Гр III она оказалась на 59,4 % (р < 0,05) больше, чем натощак, а у животных Гр IV это различие составило 62,2 % (р < 0,05). Активность других ферментов молока у коров под действием лактата практически не менялась.
Глицериновая нагрузка у коров контрольной Гр способствовала повышению активности АСТ в молоке через 3 ч в 2,5 раза (р < 0,02), а через 6 ч — в 2 раза (р < 0,05). Еще большую активность АСТ мы наблюдали в Гр II. У них под влиянием глицерина через 3 ч активность АСТ увеличилась в 2,7 раза (р < 0,05), а через 6 ч — в 3 раза (р < 0,02). Вместе с тем у животных Гр III активность АСТ в молоке повысилась только через 6 ч, причем всего на 47 % (р < 0,05). У коров Гр IV, реагирующих на туберкулин и КАМ, индукции АСТ не происходило. Что касается АЛТ, то большую, чем в норме, активность этого фермента мы зафиксировали после перорального однократного введения глицерина лишь у коров Гр I и II. У животных Гр IV, реагировавших на оба аллергена, глицерин не индуцировал повышения активности АЛТ в молоке.
Изменения активности ферментов молока под влиянием гидрокортизона у обследованных коров проявлялись следующим образом. У контрольных животных активность АСТ молока увеличилась к шестому часу эксперимента в 2 раза (р < 0,02), а у коров Гр II — на 59,4 % (р < 0,05). У коров остальных опытных Гр активность этого фермента в молоке не изменялась. Похожую картину наблюдали в отношении АЛТ и ЛДГ молока. Под влиянием гидрокортизона активность АЛТ статистически достоверно увеличилась в 2 раза (р < 0,05), через 6 ч после начала опыта только у коров Гр II. В то же время животные с выраженной реакцией на туберкулин (Гр III и IV) вновь проявили резистентность к индукции АЛТ гидрокортизоном. Что касается ЛДГ, то активность этого фермента в молоке возросла к шестому часу эксперимента после нагрузки гидрокортизоном как у контрольных коров, так и у животных Гр II на 54,2 % (р < 0,01) и на 47,9 % (р < 0,02) со-
ответственно. У коров Гр III и IV активность этого фермента не изменилась под действием гидрокортизона. Таким образом, этот глюкокортикоид проявил себя как мощный индуктор трансаминаз и ЛДГ у коров Гр I и II, но животные Гр III и IV оказались толерантными к такому его действию.
Заключение
У коров, реагирующих на туберкулин или на туберкулин и КАМ, развивается дисбаланс ферментов молока, проявляющийся значительным повышением активности АСТ, АЛТ и ЛДГ, при существенном снижении активности ЩФ и перок-сидазы.
В индукционных опытах установили, что у контрольной Гр коров и животных, реагирующих преимущественно на КАМ, лактат отчетливо повышает активность ЛДГ в молоке. У больных туберкулезом животных лактат не индуцировал повышения активности ЛДГ, но вызвал увеличение активности АЛТ. Под влиянием глицерина у животных, реагирующих только на туберкулин, активность АСТ и АЛТ в молоке повышалась в более поздние сроки, чем у животных первых двух групп, а у коров, реагирующих на туберкулин и КАМ, индукция трансаминаз вообще отсутствовала. Инъекция гидрокортизона животным Гр III и IV в отличие от коров контрольной группы, не стимулировала повышения в молоке активности АСТ, АЛТ и ЛДГ.
Таким образом, впервые показано, что у коров с выраженной реакцией на туберкулин или на туберкулин и КАМ развивается повышенная резистентность ферментов молока к индуцирующему действию экзогенных субстратных и гормональных стимулов. Полученные данные раскрывают ранее неизвестные особенности секреции ферментов молока у коров с подозрением на туберкулез. Возможно, в будущем ими можно будет пользоваться в качестве дополнительных диагностических критериев этой болезни.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Горбатова К.К. Биохимия молока и молочных продуктов. - СПб.: ГИОРД, 2004.
2. Кассич Ю.А., Хоменко В.И., Позднякова. Эффективная пастеризация молока — важный фактор борьбы с туберкулезом: Ветеринарные проблемы промышленного животноводства. - Белая Церковь, 1985.
3. Ленинджер А. Основы биохимии: Учебное пособие. - М.: Мир, 1985.
4. Рогожин В.В. Биохимия молока и молочных продуктов. - М.: Гиорд, 2006.
V.A. Blinov, U.V. Platonova. Peculiarities of induction milk enzymes in cows with different reaction to tuberculin skin test
СЕКРЕТЫ МАСТЕРСТВА
УДК 619:619.2:612.015: 616.9
Окрашивание кислотоустойчивых бактерий
Б.П. Экви, РВЖ СХЖ
Сокращения: ГП — гистопрепарат(ы); М — мазок
Из-за наличия в составе клеточной стенки большого количества липидов кислотоустойчивые бактерии (в т.ч. многие микобактерии) плохо окрашиваются обычными анилиновыми красителями, но прочно удерживают карболовые красители. Этот принцип лежит в основе метода окраски Циля-Нильсена, проводимого в следующей последовательности:
1. Фиксация М на воздухе или метиловым спиртом.
2. Окрашивание раствором карболового фуксина Циля при 4-кратном подогревании над пламенем до образования паров — 2...5 мин.
3. Промывание водой.
4. Обесцвечивание 3%-м раствором соляной кислоты, приготовленным на 96%-м этиловом спирте — 3...5 с.
5. Промывание водой с последующим ополаскиванием 96%-м этиловым спиртом — 1...2 раза.
6. Контрастное окрашивание метиленовым синим — 3...5 мин.
7. Промывание водой, высушивание и микроскопирование.
В итоге туберкулезные микобактерии окрашиваются в рубиново-красный цвет, а кислото- и спирто-устойчивые сапрофиты становятся синими.
Флюоресцентное окрашивание облегчает обнаружение кислотоустойчивых бактерий как в М, так и в ГП.
В 1938 г П.К.Х. Хагеман предложил с этой целью окрашивать ГП аурамином. Основные этапы данного метода —
