CC BY
49
doi: 10.24411/0235-2451-2021-10509 УДК619:616.982.2
Особенности индикации микобактерий с использованием озона в современной лабораторной практике
Н. А. ДЕНГИС, А. Н. НОВИКОВ, Н. С. БОГАНЕЦ
Омский аграрный научный центр, ул. Королева, 26, Омск, 644027, Российская Федерация
Резюме. Исследования проводили с целью повышения результативности и достоверности культурального метода диагностики туберкулеза с использованием озона. Работу выполняли в Омском аграрном научном центре. В экспериментах использовали биоматериал от крупного рогатого скота, реагирующего на протеин-пурифиед-дериват-туберкулин (ППД-туберкулин), из благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах Омской, Тюменской, Свердловской областей. Проведено комплексное исследование 68 образцов биоматериала. При посеве на питательные среды использовали метод, ранее апробированный на музейных культурах. Для этого физиологический раствор насыщали озоном до концентрации 0,25 мг/л путем прямого барбатирования озоно-кислородной смесью на синтезаторе озона А-С-ПЭКСФ-5-04-ОЗОН. Контролем служили посевы с использованием стандартного физиологического раствора. Параллельно с культуральным методом биологический материал исследовали путем постановки биологической пробы на морских свинках. Вирулентные и патогенные свойства культур, выращенных на среде с озоном и без идентичны, то есть озон не оказывает на них влияния. При подкожном заражении морских свинок микобактериями туберкулеза, полученными с использованием озона, у всех животных на 5.. .6 сутки в месте введения развивался воспалительный инфильтрат, переходящий в дальнейшем в абсцесс. На 6... 10 сутки увеличивались регионарные лимфатические узлы, достигавшие к 30 суткам размеров горошины. При патологоанатомическом исследовании средний индекс пораженности внутренних органов по Тогуновой составил 28,1±1,2. Положительная биологическая проба с использованием озонированного физиологического раствора на модели морских свинок согласуется с результатами культурального метода, средний показатель высеваемости микобактерий туберкулеза из биоматериала от экспериментально зараженных морских свинок in vivo был достоверно выше, чем в контроле, в 3,5 раза.
Ключевые слова: микобактерии туберкулеза, атипичные микобактерии, скорость и интенсивность роста, озон, биологическая проба. Сведения об авторах: Н. А. Денгис, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник (e-mail: svir2007@mail.ru); А. Н. Новиков, кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник; Н. С. Боганец, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник Для цитирования: Денгис Н. А., Новиков А. Н., Боганец Н. С. Особенности индикации микобактерий с использованием озона в современной лабораторной практике // Достижения науки и техники АПК. 2021. Т 35. №5. С. 55-58. doi: 10.24411/0235-2451-2021-10509
Features of the indication of mycobacteria using ozone in modern laboratory practice
N. A. Dengis, A. N. Novikov, N. S. Boganets
Omsk Agrarian Scientific Center, ul. Koroleva, 26, Omsk, 644027, Russian Federation
Abstract. The study aimed to increase the efficiency and reliability of the cultural method for diagnosing tuberculosis using ozone. The work was performed at the Omsk Agricultural Scientific Center. In the experiments, we used biomaterial from cattle reacting to tuberculin purified protein derivative (PPD) from the tuberculosis-free and tuberculosis-infected farms in the Omsk, Tyumen, and Sverdlovsk regions. We conducted a comprehensive study of 68 samples of biomaterial. When sowing on nutrient media, we used a method previously tested on archival cultures. For this, saline solution was saturated with ozone to a concentration of 0.25 mg/L by direct bubbling with an ozone-oxygen mixture on an A-C-G0KSF-5-04-0Z0N ozone synthesizer. The platings with a standard saline solution served as a control. In parallel with the culture method, the biological material was examined by applying a biological sample to guinea pigs. The virulent and pathogenic properties of cultures grown in an environment with and without ozone were identical, that is, ozone did not affect them. The guinea pigs subcutaneously infected with mycobacterium tuberculosis obtained with the use of ozone developed an inflammatory infiltrate at the injection site on the 5th or 6th day; this infiltrate then turned into an abscess. The regional lymph nodes increased in the period from the 6th to the 10th day reaching the size of a pea by the 30th day. In postmortem examination, the average index of damage to internal organs according to Togunova was 28.1±1.2. A positive biological test using ozonized saline on a model of guinea pigs was consistent with the results of the culture method. The average inoculation rate of tuberculosis mycobacteria from biomaterials from experimentally in vivo infected guinea pigs was significantly higher than in the control - by 3.5 times.
Keywords: Mycobacterium tuberculosis; atypical mycobacteria; growth rate and intensity; ozone; biological test.
Author Details: N. A. Dengis, Cand. Sc. (Biol.), senior research fellow (e-mail: svir2007@mail.ru); A. N. Novikov, Cand. Sc. (Vet.), leading research fellow; N. S. Boganets, Cand. Sc. (Vet.), senior research fellow.
For citation: Dengis NA, Novikov AN, Boganets NS. [Features of the indication of mycobacteria using ozone in modern laboratory practice] Dosti-zheniya nauki i tekhniki APK. 2021;35(5):55-8. Russian. doi: 10.24411/0235-2451-2021-10509.
Одна из наиболее сложных и экономически значимых проблем в инфекционной патологии животных - туберкулез. В начале XXI в. эпизоотическая обстановка по этому заболеванию в некоторых странах мира, в том числе в России, несмотря на тенденцию к улучшению, в целом остается напряженной. Анализ литературных данных свидетельствует, что интерес к атипичным микобактериям вполне оправдан, их способность вызывать сенсибилизацию организма человека и животных существенно затрудняет диагностику туберкулеза и может вызывать развитие патологического процесса, осложняя дифференциальную диагностикутуберкулеза. Основным критерием постановки диагноза на туберкулез считается выделение возбудителя, поэтому вопросы его индикации и идентификации при ми-кобактериозах относятся к особенно важными [1, 2, 3].
В последние годы появилась острая необходимость в разработке новых, более эффективных и надежных комплексных систем борьбы с туберкулезом крупного рогатого
скота, в том числе с использованием профилактических средств, так как добиться положительных результатов иным путем в условиях промышленного ведения отрасли, при высокой концентрации поголовья на крупных фермах и комплексах, практически невозможно. Известно, что одна из самых больших проблем в диагностике туберкулеза -«неспецифические» или «парааллергические» реакции на туберкулин. По данным официальной статистики на сегодняшний день в благополучных хозяйствах выявляют в 5,4 раза больше животных, реагирующих на протеин-пурифиед-дериват-туберкулин (ППД-туберкулин), чем в неблагополучных [4].
Бактериологическая диагностика туберкулеза представляет собой многофункциональную последовательность взаимосвязанного комплекса элементов, который включает отбор проб биоматериала, его консервирования и хранение, предварительную обработку, культивирование на питательных средах, определение видовой принадлеж-
ности изолированных культур микобактерий, постановку биологической пробы на лабораторных животных. Ошибка или сбой на любом этапе исследований могут привести к искажению результатов всей диагностики [5].
Часто в неблагополучных по туберкулезу стадах крупного рогатого скота даже после проведения комплексной диагностики остается некоторое количество больных особей. Имеются данные (хотя и разрозненные) о возможности дополнительного выявления больных туберкулезом животных с использованием серодиагностических методов. Однако основными методами первичной диагностики заболевания остаются патологоанатомический и бактериологический, которые позволяют не только получать чистую культурумикобактерий, но и проводить их идентификацию, определять вирулентность, биологические и биохимические свойства [6].
Работа по повышению информативности диагностики туберкулеза идет в разных направлениях, к числу которых относится оптимизация состава питательных сред. Предпринимались попытки использовать для стимуляции роста биологических агентов таких компонентов, как радиоактивный фосфор Р32 в виде двузамещенного фосфорнокислого натрия, сыворотка крови крупного рогатого скота, глицерин в различных концентрациях, цинк, жженая магнезия, пер-фодекалин, глюкоза и др. [7].
В научной литературе описаны свойства озонированных растворов, которые находят все больше применение в медицине и ветеринарии. Действие озона на микроорганизмы проявляется в зависимости от дозы и экспозиции. Так, его добавление в небольших количествах (до 0,005 мг/л) в жидкие питательные среды на основе мясо-пептонного бульона и кислотного гидролизата казеина приводит к стимуляции роста бактериальных культур (иерсиний, сальмонелл, листерий, холерного вибриона). Повышение концентрации вызывает отмирание популяций бактерий. Имеются данные о бактерицидном и бактериостатическом действии растворенного озона на различные штаммы микобактерий туберкулеза, которое также зависит от его дозы и времени обработки (Масленникова О.В., Конторщикова К.Н., Шахов Б.Е. Руководство по озонотерапии/4-е издание. Н.-Новгород. Исток, 2015.346с.).
При использовании озонированного физиологического раствора, приготовленного прямым барбатированием озоно-кислородной смесью на синтезаторе озона А-с-ГОКСф-5-04-ОЗОН, с концентрацией озона 0,25.. .0,5 мг/л происходит существенное (р<0,001) ускорение появление первичного роста и увеличение интенсивности накопления бактериальной массы на плотных питательных средах. Первичный рост на такой среде регистрировали на 5.7 сутки, интенсивный - на10.. .12 сутки, тогда как в контрольныхпро-бирках - только на 10.15 и 21.23 сутки соответственно. При этом скорость и интенсивность роста микобактерий туберкулеза на разных питательных средах возрастала в 1,8.2,0 раза [8, 9].
Цель исследования - повысить результативность и достоверность культурального метода диагностики туберкулеза путем использования озонированного физиологического раствора, а также изучить возможность его применения при посеве биоматериала от крупного рогатого скота и постановке биологической пробы на морских свинках.
Условия, материалы и методы. Работу проводили в лаборатории эпизоотологии и мер борьбы с туберкулезом ФГБНУ «Омский аграрный научный центр». В опытах использовали биоматериал от реагирующего на ППД-туберкулин крупного рогатого скота из благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйств Омской, Тюменской и Свердловской областей. Отбор проб осуществляли при
контрольном убое в условиях мясокомбината, в исследованиях использовали биоматериал от животных без туберкулезных изменений и с характерными поражениями в органах и лимфатических узлах. Проведено комплексное исследование 68 образцов биоматериала.
Биологический материал обрабатывали по методу Аликаевой (Наставление по диагностике туберкулеза животных. М.: Отдел оперативной полиграфии ФГУП «ВО Минсельхоза России», 2004.64с.). Каждую пробу высевали в 10 пробирок опытных и контрольных проб. При этом использовали метод, ранее апробированный на культурах биоресурсной коллекции, который предусматривает насыщение физиологического раствора озоном, путем прямого барбатирования озоно-кислородной смесью на синтезаторе озона А-С-ГОКСФ-5-04-ОЗОН до необходимой концентрации.
В экспериментальном варианте для приготовления суспензии микобактерий использовали физиологический раствор, содержащий озон в концентрации 0,25 мг/л, для стимуляции роста микобактерий. В контроле применяли стандартный физиологический раствор.
Пробирки с посевами помещали в наклонном положении в термостат при температуре 37.38 °С и инкубировали в течение 30 суток. Регистрацию начала и интенсивности роста микобактерий туберкулеза проводили ежедневно. При отсутствии роста микобактерий пробирки продолжали инкубировать и вели наблюдение в течение 3 месяцев.
В случае наличия у изолированных культур микобактерий кислотоустойчивости исследовали их культуральные свойства. Изучение проводили на первой генерации после пересева первичного роста (то есть на субкультурах) на среду Левенштейна-Йенсена. Для этого из исследуемых культур готовили суспензию густотой 2.3 мг/мл, которую засевали в объеме 0,2 мл на 8 пробирок. Посевы инкубировали в термостатах при разных температурных режимах (22, 37, 45, 52 С°). Рост учитывали через 3, 5, 7, 14 дней и далее в течение 3 месяцев. Культуры считали быстрорастущими, если рост микобактерий (колоний) появлялся до 7-го дня инкубации при 37 С°, остальные относили к медленнорастущим.
Одновременно у субкультур определяли характер роста и проводили пробу на фотохромогенез. Для этого из суспензий, приготовленных для определения скорости роста, осуществляли дополнительные посевы на 3 пробирки с плотной средой Левенштейна-Йенсена.
Для дифференциации микобактерий туберкулеза, изолированных из биоматериала от крупного рогатого скота, использовали тесты, позволяющие выявить у них устойчивость к салицилату и хлориду натрия. С этой целью взвесь микобактерий, приготовленную из каждого изучаемого штамма густотой 2 мг/мл в объеме 0,2 мл, засевали на 8 пробирок со средой, содержащей салицилат натрия в концентрации 0,05 и 0,1 %, на 2 пробирки со средой, в состав которой входили 5 % хлорида натрия и на 2 пробирки без добавления препаратов (контроль).
Для определения патогенности и вирулентности выделенных культур проводили заражение лабораторных животных. Для постановки биологической пробы использовали морских свинок линии Агути в возрасте 4 месяцев, массой 350.400 г, по 3 свинки на одно исследование. Суспензию биоматериала от крупного рогатого скота из хозяйств с различной эпизоотической ситуацией, вводили в дозе 1 мг/л подкожно с внутренней поверхности бедра.
Методика применения озона при постановке биологической пробы заключалась в двукратном на 10 и 20 сутки после заражения, введении животным опытных групп озонированного физиологического раствора с концентрацией
Таблица 1. Показатели индикации культур ми-кобактерий из биоматериала от крупного рогатого скота с использованием озона
Хозяйство Число проб Рост к ультур
озон контроль
число культур ти-пич-ные ати-пич-ные число культур ти-пич-ные ати-пич-ные
1 20 5 1 4 4 1 3 2 20 3 2 1 2 1 1 3 18 5 4 1 4 2 2 4 10 3-32-2 всего 68 16 7 9 12 4 8
2 мг/л, внутрибрюшинно в объеме 3 мл. Через 30 суток проводили контрольный убой двух морских свинок, при обнаружении характерных для туберкулеза поражений, диагноз на туберкулез считали установленным и дальнейшее исследование прекращали. Если туберкулезные изменения в органах не обнаруживали, проводили отбор проб биоматериала с последующим посевом на плотные питательные среды. Через 90 суток, после заражения, проводили убой третьей морской свинки и патологоана-томически устанавливали диагноз.
Результаты и обсуждение. В посевах из 68 проб биоматериала с использованием озонированного физиологического раствора было выделено 16 культур микобактерий, из них 7 по фенотипическим признакам были отнесены к патогенной группе. В 9 пробах выделены атипичные мико-бактерии, по своим свойствам относящиеся к III и IV группе (5 и 4 культуры соответственно) по классификации Раньона (табл. 1), в том числе 6 быстрорастущих. В контроле выделено 12 культур, 4 из них отнесены к патогенной группе, еще 8 - к III и IV группе (2 и 6 культур соответственно) по классификации Раньона, в том числе 6 быстрорастущих.
В наших исследованиях в контроле (без применения озона) из двух изолированных медленнорастущих культур, одна была скорохромагенной, одна - нефотохромагенной, из шести быстрорастущих культур - три образовывали пигмент как на свету, так и в темноте. В том числе у трех
беспегментных культур отмечали медленный и умеренный рост только при 37 С°. Две культуры росли в виде единичных, гладких, выпуклых колоний в S-форме и одна в виде шероховатых сухих колоний в R-форме, цвета слоновой кости. Четыре культуры были отнесены к M. bovis (табл. 2).
Микобактерии, отнесенные к быстрорастущим, росли в виде мелких, средних или крупных единичных колоний, округлых, гладких, слизистых или крошковатых по консистенции, морщинистых с неровными краями с ярко выраженной пигментацией или без нее, то есть характер роста определялся видом микобактерий.
При изучении культуральных свойств микобактерии изолированных с применением озона три медленнорастущие культуры давали рост при разных температурных режимах. Так, две медленнорастущих нефотохромогенные росли при 22, 37, 45 С°; одна скотохромогенная - при 22 и 37 С°. У двух нефотохромогенных медленнорастущих культур при старении появлялась желтая окраска, которая исчезала при пересеве на свежие среды (см. табл. 2).
В целом применение озона позволило дополнительно изолировать и отнести к M. bovis три культуры, к атипичным микобактериям - одну культуру.
Исследования показали, что вирулентные и патогенные свойства культур, выращенных на среде с озоном и без идентичны, то есть можно утверждать, что озон не меняет патогенных и вирулентных свойств исследуемых культур. При подкожном заражении морских свинок микобактериями туберкулеза, полученными с использованием озона, у всех животных на 5.6 сутки в месте инъекции развивался воспалительный инфильтрат, переходящий в дальнейшем в абсцесс. На 6. 10 сутки увеличивались регионарные лимфатические узлы, которые к 30 суткам достигали размеров горошины. При патологоанатомическом исследовании средний индекс пораженности внутренних органов по Тогуновой составил 28,1±1,2. Кроме того, в процессе заболевания у морских свинок отмечали снижение массы тела.
По результатам биологической пробы, проводившейся с использованием озонированного физиологического рас-
Таблица 2. Культуральные свойства микобактерий
Микобак- Рост культур
Наименование терии медленнорастущие быстрорастущие
туберку- скотохро- нефотохро- скотохромо- нефотохро-
леза могенные могенные генные могенные
Выделенные традиционным способом (без озона
Число культур 4 1 1 3 3
Скорость роста, сутки 18...30 8...16 8...16 3... 5 3...5
Отношение к свету, нет нет желто- нет
пигмент пигмента оранжевый пигмента оранжевый пигмента
Рост при температуре, °С:
22 - + + + +
37 + + + + +
45 - - + -/+ -/+
52 - - - - -
Рост на среде Левенштейна-Йенсена с + + + +
0,05 и 0,1 % салицилатом натрия
с 5 % хлоридом натрия - - - + +/-
Выделенные с использованием озона
Число культур 7 1 2 3 3
Скорость роста, сутки 18...27 8...16 8...16 3... 5 3...5
Отношение к свету, пигмент нет нет желто- нет
пигмента оранжевый пигмента оранжевый пигмента
Рост при температуре, °С:
22 - + + + +
37 + + + + +
45 - - + -/+ -/+
52 - - - - -
Рост на среде Левенштейна-Йенсена с
0,05 и 0,1 % салицилатом натрия - + + + +
С 5 % хлоридом натрия - - - + +/-
Таблица 3. Высеваемость микобактерий туберкулеза на среде Левенштейна-Йенсена из биоматериала от морских свинок с применением озона (М±т)
Проба Рост колоний на питательных средах
опыт | контроль
1 59,00±1,76*** 16,00±2,60
2 48,20±2,23*** 13,70±1,40
3 56,20±2,67*** 16,50±2,60
4 60,20±3,12*** 17,00±1,30
5 55,80±2,18*** 15,40±2,00
Среднее 55,90±2,40*** 15,72±2,00
***различия с контролем достоверны при р<0,001
твора средний показатель высеваемости микобактерий туберкулеза из биоматериала от экспериментально зараженных морских свинок in vivo был достоверно выше, чем в контроле, в 3,5 раза (табл. 3).
Рост колоний культуры микобактерий, полученных от морских свинок опытных групп, по культурально-
Таблица 4. Результаты исследований проб биоматериала от крупного рогатого скота реагирующего на ППД-туберкулин с применением озониро-
ванного < >изиологического раствора
Содержание озона, мг/л Число проб Изолировано культур Сроки появления первичного роста, сутки Выделено проб, %
0,25 40 9 19,2±1,80 22,5 контроль 40 4 24,25±4,46 10,0
морфологическим свойствам не отличался от роста колоний из биоматериала от животных в контроле.
Изучение 40 проб (из числа ранее упомянутых 68 проб) биологического материала от крупного рогатого скота, реагировавшего на ППД-туберкулин, из хозяйств Омской области с различной эпизоотической ситуацией параллельно двумя методами (общепринятым и с использованием озона) показало, что в вариантах с озонированным раствором при бактериологических исследованиях удалось выделить в 2,25 раза больше культур микобактерий различных видов, чем при общепринятом методе (табл. 4). По результатам биологической пробы на морских свинок при использовании озонированного физиологического раствора было выявлено 9 случаев положительной реакции, против 4 в контроле.
Выводы. В практике бактериальных исследований с использованием культурального метода диагностики туберкулеза при посеве биологического материала от животных целесообразно применение озонированного физиологического раствора с концентрацией озона 0,25 мг/л, которое позволяет получать большее количество культур микобактерий из биологического материала.
Положительная биологическая проба с использованием озонированного физиологического раствора на модели морских свинок согласуется с результатами культурального метода, средний показатель высеваемости микобактерий туберкулеза из биоматериала от экспериментально зараженных морских свинок in vivo был достоверно выше, чем в контроле, в 3,5 раза.
Литература.
1. Brucellosis and leucosis in cattle: A cost description of eradication programmes in the region of Lazio, Italy / A. Caminiti, F. Pelone, S. Battisti, et al. // Transbound. Emerg. Dis. 2017. Vol. 64. P. 1493-1504. doi 10.1111/tbed.12540.
2. Farmer and veterinarian attitudes towards the bovine tuberculosis eradication programme in Spain: What is going on in the field? / G. Ciaravino, P. Ibarra, E. Casal, et al. // Front. Vet. Sci. 2017. Vol. 4. Article 202. URL: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/ fvets.2017.00202/full (дата обращения: 25.02.2021). doi: 10.3389/fvets.2017.00202.
3. Allen A. R, Skuce R. A, Byrne A. W. Bovine tuberculosis in Britain and Ireland - a perfect storm? The confluence of potential ecological and epidemiological impediments to controlling a chronic infectious disease // Front. Vet. Sci. 2018. Vol. 5. Article 109. URL: https-J/www. frontiersin.org/artjcles/10.3389/fvets.2018.00109/full (дата обращения: 10.02.2021). doi: 10.3389/fvets.2018.00109.
4. Vlasenko V., Pleshakova V., Gichev Yu. Influence of anti-tuberculosis drug KIM-M2 on morphology of lymph nodes, spleen, liver and lungs of guinea pigs infected with M. bovis //International scientific and practical conference "Digital agriculture - development strategy" (ISPC 2019). 2019. Vol. 167. P. 183-187. doi: 10.2991/ispc-19.2019.41.
5. Найманов А. Х., Калмыков В. М., Калмыкова М. С. Воспроизведение туберкулеза на лабораторных животных (биологическая проба) // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2018. № 5. С. 24-30.
6. Баратов О. М. К совершенствованию диагностики туберкулеза крупного рогатого скота // Ветеринария сегодня. 2020. № 4 (35). С. 261-265.
7. Оценка комплекса микробиологических и молекулярно-генетических методов исследований для диагностики туберкулеза / Э. В. Севастьянова, В. А. Пузанов, Т. Г. Смирнова и др. //Туберкулез и болезни легких. 2015. № 1. С. 35-41.
8. Свириденко Н. А., Боганец Н. С., Аппельганц Л. Т. Возможности повышения эффективности культурального метода для выделения микобактерий туберкулеза //Достижения науки и техники АПК. 2015. Т. 29. № 4. С. 51-52.
9. Способ культивирования микобактерий туберкулеза / Н. С. Боганец, Н. А. Свириденко, М. А. Бажин и др. // Патент на изобретение RU2376365C1, 20.12.2009.
References
1. Caminiti A, Pelone F, Battisti S, et al. Brucellosis and leucosis in cattle: A cost description of eradication programmes in the region of Lazio, Italy. Transbound. Emerg. Dis. 2017;64:1493-504. doi 10.1111/tbed.12540.
2. Ciaravino G, Ibarra P, Casal E, et al. Farmer and veterinarian attitudes towards the bovine tuberculosis eradication programme in Spain: What is going on in the field? Front. Vet. Sci [Internet]. 2017 [cited 2021 Feb 25];4: Article 202. Available from: https://www.frontiersin.org/ articles/10.3389/fvets.2017.00202/full. doi: 10.3389/fvets.2017.00202.
3. Allen AR, Skuce RA, Byrne AW. Bovine tuberculosis in Britain and Ireland - a perfect storm? The confluence of potential ecological and epidemiological impediments to controlling a chronic infectious disease. Front. Vet. Sci [Internet]. 2018 [cited 2021 Feb 10];5: Article 109. Available from: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2018.00109/full. doi: 10.3389/fvets.2018.00109.
4. Vlasenko V, Pleshakova V, Gichev Yu. Influence of anti-tuberculosis drug KIM-M2 on morphology of lymph nodes, spleen, liver and lungs of guinea pigs infected with M. bovis. In: International scientific and practical conference "Digital agriculture - development strategy" (ISPC 2019). 2019;167:183-7. doi: 10.2991/ispc-19.2019.41.
5. Naimanov AKh, Kalmykov VM, Kalmykova MS. [Reproduction of tuberculosis in laboratory animals (biological sample)]. Veterinariya, zootekhniya i biotekhnologiya. 2018;(5):24-30. Russian.
6. Baratov OM. [To improve the diagnosis of tuberculosis in cattle]. Veterinariya segodnya. 2020;(4):261-5. Russian.
7. Sevast'yanova EV, Puzanov VA, Smirnova TG, et al. [Assessment of a complex of microbiological and molecular genetic research methods for the diagnosis of tuberculosis]. Tuberkulez i bolezni legkikh. 2015;(1):35-41. Russian.
8. Sviridenko NA, Boganets NS, Appel'gants LT. [Possibilities of increasing the efficiency of the culture method for the isolation of Mycobacterium tuberculosis]. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2015;29(4):51-2. Russian.
9. Boganets NS, Sviridenko NA, Bazhin MA, et al., inventors. Sposob kultivirovaniya mikobakterii tuberkuleza [Method for cultivating mycobacterium tuberculosis]. Russian Federation patent RU2376365C1. 2009 Dec 20. Russian.
