CC BY
30
удК619:576.852.2:616. 982.2
возможности повышения эффективности культурального метода для выделения миКОБАКТЕрий туберкулеза
Н.А. сВИРИдЕНКо, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
Н.с. БоГАНЕЦ, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник
Л.Т. АППЕЛЬГАНЦ, научный сотрудник Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных, ул. Лермонтова, 93, омск, 644001, Россия E-mail: svir2007@mail.ru
резюме. При бактериологической диагностике туберкулеза для посева биологического материала используют разнообразные питательные среды, в том числе жидкие. для стимуляции роста микобактерий изучена возможность использования озонированного физиологического раствора с разной концентрацией озона при культивировании микобактерий M.bovis шт. 14 и вакцинного штамма БЦЖ на жидких питательных средах (Школьниковой, Сотона, ВКЛ). Суспензию для посева готовили в разведении 1:10-5 в объеме 1 мл озонированного физиологического раствора с разной концентрацией озона (0,1; 0,25; 0,5; 1,0 мг/л). Стимулирующим эффектом обладает озонированный физиологический раствор с концентрацией озона 0,25 и 0,5 мг/л. Его использование ускоряет и повышает интенсивность роста микобактерий, увеличивает накопление бактериальной массы. В опытных пробирках рост культуры M.bovis шт. 14 на жидких питательных средах с концентрацией озона 0,25 и 0,5 мг/л регистрировали на 5-7 сут. в виде умеренно развитой пленки с гладкой поверхностью, цвета слоновой кости. В контроле визуально наличие видимой пленки отмечали на 7-10 сут. Изучение характера роста лиофилизирован-ной культуры штамма БЦЖ на жидких питательных средах ВКЛ и Сотона с применением озонированного раствора с концентрацией озона 0,25 мг/л показало, что на обеих средах начало роста отмечали после второго пассажа в виде нежных отдельных колоний на поверхности среды. Колонии сухие, цвета слоновой кости. Обильное накопление бактериальной массы на среде Сотона наблюдали на 30 сут. Влияние озона в концентрации 0,25 и 0,5 мг/л на скорость и интенсивность роста культур микобактерий (M. bovis шт. 14) на жидких питательных средах, заключалось в сокращении сроков появления роста культур в 1,6 раза. Использование озонированного физиологического раствора в концентрации 0,25 мг/л способствует увеличению интенсивности роста и накоплению бактериальной массы вакцинного штамма БЦЖ при культивировании на жидких питательных средах Сотона и ВКЛ в 1,2 раза.
Ключевые слова: бактериологическая диагностика, мико-бактерии, вакцинный штамм БЦЖ, озон, жидкие питательные среды.
Для цитирования: Свириденко Н.А., Боганец Н.С., Аппель-ганц Л.Т. Возможности повышения эффективности культурального метода для выделения микобактерий туберкулеза // Достижения науки и техники АПК. 2015. Т.29. №4. С. 51-52.
Диагностика туберкулеза - важное звено системы мероприятий по борьбе с этим заболеванием. Посев на
специальные питательные среды - весьма надежный и достоверный метод, позволяющий не только получать чистую культуру микобактерий, но и проводить их идентификацию [1].
Для посева диагностического материала используют разнообразные питательные среды, среди которых можно выделить 3 основные группы: плотные на яичной основе; плотные или полужидкие на агаровой основе; жидкие синтетические и полусинтетические. Микобактерии туберкулеза обладают избирательной потребностью в питательных веществах, в связи с этим для повышения результативности культурального метода рекомендуется проводить посев диагностического материала одновременно на 2-3 питательные среды разного состава.
В повседневной работе микробиологической лаборатории, наряду с плотными питательными средами, используют и жидкие, например, для нейтрализации рН посевного материала, при изучении лекарственной чувствительности микобактерий и др. Многие исследователи считают, что в жидких питательных средах создаются оптимальные условия для роста микобактерий туберкулеза [2, 3].
Наиболее широко распространенные и хорошо зарекомендовавшие себя в России жидкие питательные среды - среда Школьниковой, ВКЛ, Сотона.
Цель наших исследований - определить возможность использования озонированного физиологического раствора при культивировании микобактерий на жидких питательных средах для сокращения сроков выделения микобактерий и накопления бактериальной массы.
Для ее достижения были поставлены следующие задачи:
изучить влияние разных концентраций озонированного физиологического раствора на интенсивность роста микобактерий M.bovis штамм 14 на жидких питательных средах (Школьниковой, Сотона).
изучить влияние разных концентраций озонированного физиологического раствора на интенсивность роста микобактерий культуры вакцинного штамма БЦЖ на жидких питательных средах (ВКЛ, Сотона).
Условия, материалы и методы. Работа выполнена в лаборатории эпизоотологии и мер борьбы с туберкулезом Всероссийского научно-исследовательского института туберкулеза и бруцеллеза животных. В опытах использовали суспензию культуры вакцинного штамма БЦЖ и M.bovis шт. 14.
Таблица 1. рост M.bovis на жидких питательных средах
Концентрация озона мг/л Среда
Школьниковой Сотона
интенсивность развития пленки, сутки
появление, сут. I характер роста 1 появление, сут. I характер роста
0,1 9-12 тонкая, гладкая 9-12 тонкая, гладкая
0,25 5-7 умеренно развитая 5-6 умеренно развитая
0,5 5-6 умеренно развитая 5-6 умеренно развитая
1,0 10-13 тонкая, гладкая 10-13 тонкая, гладкая
контроль 7-10 тонкая, гладкая 7-10 тонкая, гладкая
Достижения науки и техники АПК. 2015. Т. 29. № 4
51
Таблица 2. рост штамма БцЖ на жидких питательных средах с применением озона с концентрацией 0,25 мг/л
Среда
Показатель ВКЛ Сотона
опыт контроль опыт контроль
Толщина пленки, мм Масса, г 7 7,8 5 6,5 10 8,35 7 6,95
Для посева ее готовили в разведении 1:10-5 в объеме 1 мл озонированного физиологического раствора с разной концентрацией озона (0,1;0,25;0,5;1,0 мг/л озона). Затем суспензию вносили в колбы с жидкой питательной средой для культивирования и помещали в термостат при t +37,5° С. Контролем служили посевы без озона. Результаты роста микобактерий оценивали по толщине бактериальной пленки (мм) и по массе (г).
результаты и обсуждение. В опытных пробирках при культивировании M.bovis шт. 14 с применением озонированного физиологического раствора с концентрацией озона 0,25 и 0,5 мг/л рост регистрировали на 5-7 сут. в виде умеренно развитой пленки с гладкой поверхностью цвета слоновой кости. В контроле визуально наличие видимой пленки отмечали на 7-10 сут. При концентрации озона 0,1 и 1,0 мг/л рост культуры регистрировали на 9-13 сут. в виде тонкой гладкой пленки (табл. 1).
Исследованиями установлено, что культуры микобактерий M.bovis шт.14, полученные с использованием озонированного физиологического раствора, во второй генерации сохраняют тинкториальные, культурально-морфологические, биохимические и патогенные свойства. Для них характерна устойчивость к 5%-ному хлориду натрия, они не образуют пигмент на свету и в темноте, не растут на среде Левенштейна-Йенсена при температурах 22 и 45 °С, проявляют рост при температуре 37-38 °С, вирулентны для лабораторных животных.
На среде ВКЛ начало роста лиофилизированной культуры штамма БЦЖ отмечали после второго пассажа на 9 сут. в виде нежных отдельных колоний на поверхности среды. Колонии мелкие, сухие, цвета слоновой кости. Толщина пленки на поверхности среды в виде морщинистой, плотной, бледно-розового цвета массы составляла в варианте с 0,25 мг/л озона 7 мм. Обильное накопление бактериальной массы отмечали на 30 сут. - в среднем 7,8 г с одной колбы, что на 1,3 г больше, чем в контроле. В процессе культивировании отмечали наличие осадка в виде легких кос и жгутов (табл. 2).
На среде Сотона начало роста колоний БЦЖ в экспериментальном варианте отмечали на 9 сут. в виде хлопьев светло-серого цвета. На 15 сут. культивирования пленка увеличивалась до 10 мм. На 30 сут. бактериальная масса в одной колбе в среднем составляла 8,35 г, что на 1,4 г больше, чем в контроле. Все среды оставались прозрачными до конца наблюдения (3 мес.).
выводы. При использовании озона в концентрации 0,25; 0,5 мг/л, установлено сокращение сроков появления роста культур микобактерий (M.bovis шт. 14) на жидких питательных средах в 1,6 раза.
Использование озонированного (0,25 мг/л) физиологического раствора способствует увеличению интенсивности роста и накоплению бактериальной массы вакцинного штамма БЦЖ при культивировании на жидких питательных средах Сотона и ВКЛ в 1,2 раза.
Литература.
1. Боганец Н.С. Эффективность питательных сред в диагностике туберкулеза // Ветеринария. 2006. № 3. С. 28-30.
2. Голышевская В.И., Фадеева Н.И. Совершенствование методов микробиологической диагностики туберкулеза // Сб. науч. тр. ЦНИИ туберкулеза. 1987. Т. 45. С. 77-82.
3. Субботина С.Г. Идентификация микобактерий по характеру роста на парафиновых дисках и жидкой питательной среде //Сб. науч. тр. Воронежского СХИ. - Воронеж: Изд-во ВСХИ, 1990. - С. 35-38.
POSSIBILITIES TO IMPROVE THE EFFICIENCY OF CuLTuRAL METHODS FOR ISOLATION OF MYCOBACTERIuM TuBERCuLOSIS
N.A. Sviridenko, N.S. Boganets, L.T. Appelgants
All-Russian Research Institute of brucellosis and tuberculosis of animals, Lermontov str., 93, Omsk, 644001, Russia Summary. Various nutrient media, including liquid ones, are used for plating of biological material at bacteriological diagnosis of tuberculosis. The tests on usage of ozonized saline with different concentration of ozone for cultivation of mycobacteria M. bovis strain 14 and vaccine strain of BCG in liquid nutrient media (Shkolnikova, Soton, VKL) for stimulation of growth of mycobacteria were carried out. The suspension for plating was prepared at a dilution of 1:10E-5 in 1 ml of ozonized saline with different concentrations of ozone. There were tested four ozone concentrations (0.1; 0.25; 0.5; 1.0 mg/l). Ozonized saline solutions with ozone concentration 0.25 and 0.5 mg /l have stimulating effect; they accelerate and increase the rate of growth of mycobacteria, augment the accumulation of bacterial mass. In test tubes we registered the growth of culture M. bovis strain 14 in liquid nutrient media with ozone concentration 0.25 and 0.5 mg/l on 5...7 day as moderately developed film with a smooth surface and ivory color. In the control we visually noted the presence of visible film on 7.10 days. The examination of growth of lyophilized culture of BCG strain in liquid VKL and Soton nutrient media with ozonized solution with ozone concentration 0.25 mg/l revealed that on both medium the beginning of growth was observed after the second passage on 14 day as soft separate colonies on the surface of the media. Colonies were dry, ivory color. The abundant accumulation of bacterial mass at the Soton's medium was noted on 30 day. The influence of ozone at concentrations 0.25 and 0.5 mg/l on the rate and intensity of growth of mycobacterium cultures (M. bovis strain 14) consisted in the reduction of time for culture growth appearance by 1.6 times. Ozonized saline at concentration 0.25 mg/l contributes to intensification of growth and accumulation of bacterial mass of vaccine strain of BCG during cultivation on liquid Soton and VKL nutrient media by 1.2 times.
Keywords: bacteriological diagnostics, mycobacteria, vaccine strain of BCG, ozone, liquid nutrient media.
Author Details: N.A. Sviridenko, Cand. Sc. (Biol.), Senior Researcher (e-mail: svir2007@mail.ru); N.S. Boganets, Cand. Sc. (Vet.), Senior Researcher; L.T. Appelgants, Researcher
For citation: Sviridenko N.A., Boganets N.S., Appelgants L.T. Possibilities to improve the efficiency of cultural methods for isolation of mycobacterium tuberculosis. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2015. T.29. №4. pp. 51-52 (In Russ)
52
Достижения науки и техники АПК. 2015. Т 29. № 4
