CC BY
22УДК619:616-078:57.083.13:579.873.21:636.22/.28
способ предпосевной обработки биологического материала при туберкулезе
Н.В.Калашник - аспирант лаборатории изучения туберкулеза.
ННЦ «Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины», Харьков (Украина, г.Харьков, 61023, ул. Пушкинская, 83, e-mail: nick.v.kalashnik@gmail.com, тел. +38 (050) 6818185).
Диагноз на туберкулез сельскохозяйственных животных считается установленным при обнаружении в органах и тканях характерных для туберкулеза изменений или при выделении чистых культур возбудителей M.bovis, M.tuberculosis, M.avium. При отборе биоматериала от убитых с диагностической целью животных зачастую происходит его загрязнение банальной микрофлорой, что затрудняет выделение культур микобактерий и их высе-ваемость на питательных средах. Используемые для предпосевной обработки химические вещества частично подавляют сопутствующую микрофлору, что также приводит к замедлению роста культур микобактерий. Целью работы было разработать более информативный способ предпосевной обработки биоматериала от животных при культуральном исследовании на туберкулез. Материалы и методы. Изучили чувствительность культуры M.fortuitum к действию 0,5-1% азотной кислоты, 1-3% трихлоруксусной кислоты с экспозицией 30, 60, 180 минут, а также 5, 8, 10% щавелевой кислоты с экспозицией 30, 60 минут. Пробы биоматериала отбирали от реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота, морских свинок, кроликов, кур и исследовали культуральным методом на туберкулез. Предпосевную обработку свежеотобранного биологического материала проводили с применением растворов 0,5, 1, 1,5% азотной, 1% трихлоруксусной кислот с экспозицией 30, 60 минут, 5% щавелевой кислоты - 30 мин в сравнении со стандартным методом А.П.Аликаевой. Результаты исследований. Лучшие показатели первичного роста, интенсивности роста колоний микобактерий отмечали при действии на культуру атипичных микобактерий M.fortuitum 0,5% раствора азотной кислоты. При обработке биоматериала 1% раствором азотной кислоты, 5% - щавелевой, 1% - трихлоруксусной, и 3-5% раствором серной кислоты рост колоний микобактерий в пробирках на питательной среде отмечали в 87,5%, 72,5%, 75%, 70% случаев соответственно. Вместе с этим в посевах отмечали и рост секундарной микрофлоры при обработке проб биоматериала только 0,5% раствором азотной кислоты - 5-25%, щавелевой - 7,5%, трихлоруксусной - 7,5-12,5% и раствором серной кислоты - 5-33%. Заключение. По результатам проведенных исследований было установлено, что способ предпосевной обработки биоматериала с использованием 1% раствора азотной кислоты при экспозиции 30 мин является более информативным, позволяет на 5-10 сут раньше выделять культуры микобактерий из биологического материала от разных видов животных, препятствует росту секундарной микрофлоры на питательной среде и может быть использован в ветеринарных лабораториях при культуральном исследовании на туберкулез.
клюЧЕВЫЕ слоВА: туберкулез, Mycobacterium bovis, бактериологическая диагностика, культу-ральный метод, способ предпосевной обработки, биологический материал.
Туберкулез (ТиЬегсШоБ^) - инфекционное, хронически протекающее заболевание животных и людей, характеризующееся образованием специфических гранулем (туберкулов) в органах и тканях и является одним из ведущих причин смертности среди людей во всем мире [1,2]. Также это заболевание приводит к большим экономическим потерям в отрасли животноводства [3,4,5].
Географически заболеваемость людей значительно выше в Восточной Азии, причем на Индию и Китай приходится почти 40% случаев возникновения туберкулеза [2].
Заболеваемость крупного рогатого скота туберкулезом в разные годы зарегистрирована на всех континентах земного шара. Однако, пораженность скота М.Ьоук в разных странах была неодинаковой [6, 7, 8, 9].
Благодаря применению различных методов диагностики и профилактики, поголовье крупного рогатого скота в большинстве стран Европы оздоровлено от этой инфекции. Несмотря на достигнутые успехи в
борьбе с этим заболеванием, в оздоровленных от туберкулеза странах отмечают рецидивы, а также спорадические случаи возникновения этой инфекции в благополучных хозяйствах [6, 7].
Вместе с тем, за последние 10 лет среди сельскохозяйственных животных в хозяйствах Украины ежегодно регистрируют случаи возникновения туберкулеза, которые обусловлены М.Ьоук [10].
В большинстве оздоровленных от туберкулеза стран Европы контроль благополучия стад крупного рогатого скота проводят аллергическим методом с применением внутрикожной туберкулиновой пробы, а в некоторых - по результатам послеубойного осмотра туш убитых животных [1, 11]. На основании проведенных исследований определяют эпизоотологический статус животноводческих ферм по туберкулезу.
Диагноз на туберкулез у животных считают установленным при обнаружении в органах и тканях характерных для туберкулеза изменений. При этом также необходимо отметить, что сроки развития специфи-
ческих туберкулезных гранулем в организме инфицированных животных зависят от биологических свойств самого возбудителя, формы, стадии и локализации инфекционного процесса, а также иммунной резистентности макроорганизма [12,13,14].
При отсутствии туберкулезных гранулем, от убитых с диагностической целью животных отбирают пробы биоматериала для бактериологического исследования с целью выделения чистой культуры возбудителя. Эффективность культурального метода зависит от качества отобранного для исследования биоматериала, способа предпосевной обработки, количества жизнеспособных микобактериальных клеток в нем. Однако, при отборе проб биоматериала для культурального исследования происходит его контаминация секундарной микрофлорой, что влияет на достоверность полученных результатов и имеет существенное значение для постановки заключительного диагноза.
В медицинской практике для предпосевной обработки проб мокроты в разные годы использовали растворы двух- и трехзамещенного фосфорнокислого натрия, 4% раствор гидроксида натрия, ^аце-тил^-цистеин-гидроксид натрия, 0,5-1% раствор этония. Использование данных растворов для декон-таминации проб биоматериала от животных не нашло широкого применения в ветеринарной практике по причине пророста посевов сопутствующей микрофлорой [15,16,17,18].
При использовании для предпосевной обработки патологического материала от животных 0,5-1% раствора этония, а также 5% раствора щавелевой, серной кислоты в посевах отмечали рост на питательной среде посторонней микрофлоры в 4,5-29% и 11,6-22,5% случаев соответственно [15,18].
Приведенные данные свидетельствуют о необходимости поиска альтернативного способа предпосевной обработки биоматериала от животных, который обеспечит стерильность посевов и будет более эффективным при проведении культурального исследования.
Целью данной работы явилось изыскание более информативного способа предпосевной обработки биоматериала от животных при исследовании на туберкулез.
Материалы и методы. Для проведения исследований определяли чувствительность культуры атипичных микобактерий вида M.fortuitum к действию азотной, щавелевой, трихлоруксусной кислот в определенных концентрациях, при установленных экспозициях во времени.
Пробы биологического материала отбирали от разных видов животных (крупный рогатый скот, морские свинки, кролики, куры), транспортировали в лабораторию изучения туберкулеза ННЦ «ИЭКВМ»
в свежем виде и исследовали культуральным методом на туберкулез.
Перед посевом биологического материала на питательную среду проводили предпосевную его обработку. Для этого из каждого образца биологического материала (лимфатические узлы, кусочки печени, селезенки, легких) вырезали участки с признаками гиперемии и гиперплазии размером 0,3-0,5 см3 в условиях стерильного бактериологического бокса. Общий вес каждой отдельно исследуемой пробы составлял 20,0-30,0 граммов. После этого кусочки каждой пробы исследуемого материала отдельно помещали в стерильные фарфоровые ступки, измельчали и вносили растворы кислот: 3, 5% серной кислоты на 20, 30 минут, 0,5, 1, 1,5% азотной кислоты на 30, 60 минут, 5% щавелевой кислоты на 30 мин, 1% трихлоруксус-ной кислоты на 30, 60 минут. Ступки накрывали стерильной пергаментной бумагой и оставляли на вышеуказанный срок экспозиции.
После этого растворы кислот сливали в колбу, а кусочки тканей промывали два раза стерильным физиологическим раствором с интервалом 10-15 минут. После второго промывания физиологический раствор сливали, а кусочки тканей растирали со стерильным стеклом или кварцевым песком до получения гомогенной массы.
К тканевому гомогенизату добавляли 20,0-25,0 см3 стерильного физиологического раствора, смешивали стерильной стеклянной палочкой. Полученную суспензию высевали на питательную среду для индикации и культивирования микобактерий. Пробирки с посевами располагали в термостате при температуре 370С на 2-3 сут в скошенном положении. После этого ватно-марлевые пробки парафинировали, а пробирки размещали в бактериологические штативы и культивировали в термостате при температуре 370С. Учет роста колоний на питательной среде проводили через 5-7 сут на протяжении 90 дней. При этом учитывали сроки появления первичного роста колоний, их консистенцию, тинкториальные свойства.
Для контроля опытов предпосевную обработку биологического материала проводили 5% раствором серной кислоты по методу А.П.Аликаевой.
Результаты исследований. При определении чувствительности культуры M.fortuitum к действию различных концентраций кислот в определенных экспозициях было установлено, что культура атипичных микобактерий вида M.fortuitum устойчива к испытуемым концентрациям растворов действующих веществ в большинстве случаев. Результаты исследований по определению чувствительности атипичных микобактерий M.fortuitum к действию растворов кислот приведены в таблице 1.
Таблица 1
Чувствительность культуры M.fortuitum к действию кислот
Кислоты Концентрация раствора,% Экспозиция, мин. Рост колоний микобактерий (через дней)
2 3 4 5 6 7 10 14 15 20
HNO3 0,5 30 + + + + + + + + + +
60 - + + + + + + + + +
1 30 - + + + + + + + + +
60 - + + + + + + + + +
180 - - - + + + + + + +
CChCOOH 1 30 - + + + + + + + + +
60 - - - + + + + + + +
3 60 - - - - - - - - - -
180 - - - - - - - - - -
(COOH)2 5 30 - + + + + + + + + +
60 - + + + + + + + + +
8 30 - + + + + + + + + +
60 - - - + + + + + + +
10 30 - - - + + + + + + +
60 - - - - - + + + + +
Контроль + + + + + + + + + +
Примечание. «-» - отсутствие роста колоний; «+» - наличие роста колоний.
Приведенные в таблице 1 данные свидетельствуют о том, что при действии 0,5% раствора азотной кислоты в экспозиции 30 мин видимый рост колоний культуры МЛогШит на питательной среде отмечали на 2 сут после посева, при экспозиции 60 мин - на 3 сут культивирования. Под действием 1% раствора азотной кислоты с экспозицией 30 и 60 мин рост первичных колоний микобактерий отмечали на 3 сут, а при экспозиции 180 мин - на 5 сутки.
При использовании 1% раствора трихлоруксусной кислоты в экспозиции 30 мин рост колоний появлялся на 3 сут, в экспозиции 60 мин - на 5 сут культивирования. Раствор 3% трихлоруксусной кислоты при экспозиции 60 и 180 мин (1; 3 ч) полностью угнетал рост МЛогШит на питательной среде.
Рост колоний микобактерий также отмечали при действии 5% раствора щавелевой кислоты с экспозицией 30 и 60 мин, 8% раствора щавелевой кислоты -30 мин на 3 сут культивирования. В дальнейшем, при обработке культуры микобактерий 8%, 10% раствором щавелевой кислоты в экспозиции 30, 60 мин рост колоний отмечали на 5 сутки. Однако раствор 10% щавелевой кислоты при 60 мин экспозиции угнетал рост микобактерий. Первичный рост колоний в этом случае наблюдали только на 7 сутки.
Интенсивность роста микобактерий пропорционально увеличивалась до 20 дня культивирования и составляла в количественном отношении от 20 до 50 коло-
ний в каждой пробирке. Культура M.fortuitum, на которую не действовали химическими соединениями (чистый контроль) выростала на 2 день культивирования.
После этого было проведено культуральное исследование по предпосевной обработке проб биоматериала от реагирующего на туберкулин КРС из благополучных по туберкулезу хозяйств разных областей Украины. В эксперименте применили 0,5% раствор азотной кислоты, 1% раствор трихлоруксусной кислоты в экспозиции 30, 60 минут. В качестве контроля обработку биоматериала проводили по методу А.П.А-ликаевой с использованием 3% раствора серной кислоты при экспозиции 20 минут. Результаты культу-рального исследования представлены в таблице 2.
Приведенные в таблице 2 данные свидетельствуют о том, что при применении 0,5% раствора азотной кислоты в экспозиции 30-60 минут было выделено 5 культур микобактерий. При применении 1% раствора трихлоруксусной кислоты в экспозиции 30 минут было выделено 3 культуры, а в экспозиции 60 минут — 2 культуры микобактерий. При обработке биоматериала по методу А.П.Аликаевой с применением 3% раствора H2SO4 выделено 3 культуры микобактерий. Наибольший рост посторонней микрофлоры (12,5%) на питательной среде наблюдали при обработке проб 3% раствором серной кислоты.
В дальнейшем было проведено культуральное исследование 15 проб биоматериала от КРС, реагировав-
Таблица 2
Результаты культурального исследования проб биологического материала от кРс на туберкулез с применением азотной, трихлоруксусной, серной кислот
Исследовано проб Кислоты Концентрация раствора, % Экспозиция, мин Высеяно пробирок, шт. Рост колоний в пробирках, шт. % Выделено культур % Микроскопия Пророст, %
8 ИМ03 0,5 30 40 34 85 5 62,5 + 7,5
0,5 60 40 37 92,5 5 62,5 + 5,0
8 СС!зС00И 1 30 40 32 80 3 37,5 + 12,5
1 60 40 30 75 2 25 + 7,5
8 ^04 3 20 40 34 85 3 37,5 + 12,5
шего на туберкулин из благополучных по туберкулезу хозяйств, 5 зоопарковых кур, а также 12 морских свинок и 4 кроликов, зараженных культурой М.Ьожшт. УаНее. Предпосевную обработку биоматериала проводили
с использованием 0,5%, 1%, 1,5% растворов азотной кислоты при экспозиции 30 мин в сравнении с методом А.П.Аликаевой с применением 3% раствора И2Б04. Результаты этих исследований приведены в таблице 3.
Таблица 3
Результаты культурального исследования проб биоматериала от разных видов животных с применением
азотной кислоты
Пробы от животных Количество проб Изолировано культур Рост посторонней микрофлоры
нм°3 ^04 н^3 ^04
0,5% 1% 1,5% 3% 0,5% 1% 1,5% 3%
КРС 15 9 13 8 9 3 - - 4
Куры 5 2 5 3 3 2 - - 4
Морские свинки 12 9 12 8 8 2 - - 2
Кролики 4 2 3 2 2 2 - - 2
Всего 36 22 33 21 22 9 - - 12
% 61,1 91,6 58,3 61,1 25 33,3
Из материалов, приведенных в таблице 3 видно, что при обработке 15 проб биоматериала от КРС, 5 проб от кур, 12 проб от морских свинок и 4 проб от кроликов 0,5% раствором азотной кислоты было изолировано 22 культуры микобактерий и в 25% случаев отмечали рост посторонней микрофлоры. При использовании 1% раствора азотной кислоты при экспозиции 30 минут из проб биоматериала было выделено 33 культуры микобактерий, а с применением 1,5% раствора данного химического вещества в той же экспозиции рост колоний микобактерий наблюдали в 21 случае. Рост банальной микрофлоры отсутствовал. При этом отмечали, что 1,5% раствор азотной кислоты снижает интенсивность роста эпизоотических культур микобактерий на питательной среде.
При обработке патологического материала 3% раствором серной кислоты рост микобактерий на питательной среде отмечали в 22 пробирках (изолировано 22 культуры), что на 11 культур меньше чем с использо-
ванием 1% раствора азотной кислоты. Причем в 33,3% исследуемых проб отмечали рост сопутствующей микрофлоры. Применение 1% раствора азотной кислоты при экспозиции 30 минут для предпосевной обработки проб биоматериала позволило повысить выделяемость культур микобактерий на 30,5%. При этом была обеспечена стерильность посевов на питательной среде для индикации и культивирования микобактерий.
Кроме этого, культуральным методом были исследованы пробы биоматериала от 8 морских свинок, зараженных культурой м.ьоук шт.Уанее. Предпосевную обработку биоматериала проводили с использованием растворов 1% азотной, 5% щавелевой кислоты. Наряду с вышеперечисленными кислотами, для уменьшения пророста посевов на питательных средах при обработке биоматериала также использовали 5% раствор серной кислоты.
Результаты этих исследований приведены в таблице 4.
Таблица 4
Результаты культурального исследования биоматериала на туберкулез от морских свинок
Кислоты Исследовано проб Концентрация % Экспозиция (мин.) Количество пробирок Рост колоний (через дней) Рост колоний в пробирках Пророст
10 15 20 30 40 пробирок %
HNO3 8 1 30 80 - - ++ # # 70 87,5 -
(COOH)2 8 5 30 80 - - + +++ # 58 72,5 6
H2SO4 8 5 30 80 - - - ++ # 56 70 4
Примечание. «-» - отсутствие роста; «+» -рост 5-10 колоний; «++» - рост 10-20 колоний; «+++» - рост 20-50 колоний; «#»- рост более 50 колоний на поверхности питательной среды.
Из материалов таблицы 4 видно, что при использовании 1% раствора азотной кислоты в экспозиции 30 минут первичный рост колоний микобактерий на питательной среде наблюдали на 20 сутки. При обработке 5% щавелевой кислотой на протяжении 30 минут единичные колонии вырастали на 20 сут, а при применении 5% раствора серной кислоты в экспозиции 30 мин — на 30 сут культивирования.
Сплошной рост колоний во всех случаях был зафиксирован на 39-42 сутки. Если учитывать общее количество пробирок, в которых был отмечен рост, то при обработке азотной кислотой наличие роста было установлено в 70-ти пробирках, с применением щавелевой кислоты — в 58 пробирках, при обработке серной кислотой — в 56-ти пробирках, что составляло 87,5%, 72,5% и 70% соответственно.
Рост посторонней микрофлоры при обработке биоматериала 5% раствором серной кислоты
Литература
наблюдали в 4-х пробирках (5%), а при обработке 5% щавелевой кислотой — в 6-ти пробирках (7,5%). Рост посторонней микрофлоры на питательной среде отсутствовал во всех пробирках с применением 1% раствора азотной кислоты в установленной экспозиции.
Заключение. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что использование способа предпосевной обработки проб биоматериала с применением 1% раствора азотной кислоты при экспозиции 30 мин является более информативным, позволяет на 5-10 сут раньше и на 17,5-30,5 % больше выделить культур микобактерий из патологического материала от животных. Разработанный способ обеспечивает стерильность посевов от пророста секун-дарной микрофлорой и может быть использован в ветеринарной практике при культуральном исследовании на туберкулез.
1. OIE report. Bovine tuberculosis [Электронныйресурс]. 2014. С. 16. URL: http://www.oie.int/fileadmin/Home/ eng/Health_standards/tahm/2.04.07_BOVINE_TB.pdf (дата обращения: 26.11.2015).
2. WHO. Global Tuberculosis Report 2015. - 20-th edition. - France: World Health Organization, 2015. - 102 р.
3. Prevalence and direct economic losses from bovine tuberculosis in makurdi, Nigeria / E.F.Ejeh [et al.] // Vet. Med. Int. - 2014. - Vol. 2014. - Р. 6-10.
4. Butler, A. Economic impact assessment of Bovine Tuberculosis in the South West of England / A.Butler, M.Lobley, M.Winter // CRPR Research Report Centre for Rural Policy Research University of Exeter. - 2010. - № 30. - Р. 57-59.
5. Cousins, D.V. Mycobacterium bovis infection and control in domestic livestock / D.V.Cousins // Rev Sci Tech. -2001. - Vol. 20, № 1. - P. 71-85.
6. Eurosurveillance editorial team. The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2009 // European communicable disease bulletin. - 2011. - Vol. 9, № 3. - P. 378-380.
7. Eurosurveillance editorial team. The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2013 // Euro surveillance: European communicable disease bulletin. European Food Safety Authority. - 2015. - Vol. 13, № 1. - P. 162-165.
8. Prevalence of Bovine Tuberculosis in Abattoirs of the Littoral and Western Highland Regions of Cameroon: A Cause for Public Health Concern / J.Awah-Ndukum [et al.] // Vet. Med. Int. - 2010. - Vol. 2010. - P. 8-11.
9. OIE. OIE World Animal Health Information System [Электронныйресурс] // Weekly Animal Disease sevice global report. 2015. URL: http://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Reviewreport/Review/viewsummary?fupser=&dothis= &reportid=17998 (дата обращения: 07.12.2015).
10. Горжеев, В. Етзоотолопчний мошторинг та удосконалення системи боротьби з туберкульозом велико! рогато!худоби у господарствах УкраТни: дис. ... канд. вет. наук / В.Горжеев. - Харьков, 2005. - 126 л.
11. Good, M. Perspectives on the History of Bovine TB and the Role of Tuberculin in Bovine TB Eradication / M.Good,
A.Duignan // Vet. Med. Int. - 2011. - Vol. 2011. - P. 1-11.
12. Burrows, W. Burrows Textbook of microbiology / W.Burrows, B.A.Freeman. - Philadelphia and London: W.B.Saunders Company, 1985. - 1038 р.
13. Pathogenesis of Mycobacterium bovis infection in cattle / S.D.Neill [et al.] // Vet. Microbiol. - 1994. - Vol. 40, № 1-2. - P. 41-52.
14. Tuberculosis / edited by M.M.Madkour. - Berlin: Springer Berlin Heidelberg, 2004. - 930 р.
15. Косенко, В. Влияние обработки патологического материала на высеваемость микобактерий туберкулёза / В.Косенко, А.Кадочкин, Н.Тажгалиев // Ветеринария. - 1984. - № 5. - С. 67-68.
16. A national audit of the laboratory diagnosis of tuberculosis and other mycobacterial diseases within the United Kingdom / F.Drobniewski [et al.] // J. Clin. Pathol. - 1999. - Vol. 52, № 5. - P. 334-337.
17. Ratnam, S. Simplified acetylcysteine-alkali digestion-decontamination procedure for isolation of mycobacteria from clinical specimens / S.Ratnam, F.A.Stead, M.Howes // J. Clin. Microbiol. - 1987. - Vol. 25, № 8. - P. 1428-1432.
18. Метод предпосевной обработки биоматериала для выделения микобактерий / Р.А.Нуратинов [и др.] // Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2006. - № 9. - С. 48-50.
19. Аликаева, А.П. Упрощенный метод выделения и выращивания чистых культур туберкулезных бацилл из патологического материала / А.П.Аликаева // Советская ветеринария. - 1940. - № 11 - С. 12.
PRETREATMENT OF BIOLOGICAL MATERIAL FOR TUBERCULOSIS TESTS
Kalashnyk N.V. - postgraduate fellow.
NSC "Institute of Experimental and Clinical Veterinary Medicine", Kharkiv (e-mail: nick.v.kalashnik@gmail.com, тел. +38 (050) 6818185).
Abstract. Livestock tuberculosis is considered as the registered only after detection of tuberculosis-specific changes in organs and tissues or after isolation of M.bovis, M.tuberculosis, M.avium pure cultures. At collection of biological material from slaughtered animals for diagnostic purposes a contamination with secondary microflora often takes place and, therefore, mycobacteria isolation and its cultivation on nutrient media is often complicated. The chemical agents used for pretreatment partially inhibit the accompanying microflora which results in lower rate growth of mycobacteria cultures. The aim was to develop a more informative method of pretreatment of biological material from animals for cultural tests for tuberculosis. Materials and methods: the sensitivity of M. fortuitum culture to the effect 0.5-1.0% nitric acid, and 1-3% trichloroacetic acid with exposure of 30, 60, 180 minutes, and also 5-,8-,10% oxalic acid, with exposure time of 30, 60 minutes was studied. The biomaterial samples were collected from tuberculin-positive guinea pigs, rabbits, chickens and were examined using cultural test on TB. Pretreatment of freshly collected biological material was performed using 0.5, 1, 1.5% nitric acid solution, 1% trichloroacetic acid solution with an exposure time of 30 and 60 minutes and using solution of 5% oxalic acid for 30 minutes exposure time in comparison with the standard method by A.P. Alikaeva. Results: the effect of 0.5% nitric acid solution on atypical mycobacterial culture showed the best parameters on primary growth and the growth rate of the colonies. The pretreatment of biomaterial using 1% nitric acid solution, 5% oxalic acid solution, 1%trichloroacetic solution and 3-5% sulfuric acid solution resulted in the growth rate of mycobacterial colonies on nutrient medium in test tubes in 87.5%, 72.5%, 75%, 70% cases accordingly. Along with the mycobacteria colony growth a secondary microflora was also registered: at treatment of biological samples using 0.5% solution of nitric acid the secondary microflora growth rate was 5-25%, oxalic acid - 7.5%, trichloroacetic acid - 7.5-12.5% and a sulfuric acid solution - 5-33% accordingly. Conclusion: the research results showed that the biomaterial pretreatment using 1%nitric acid solution with exposure time of 30 minutes was the most informative. This method allows earlier mycobacteria isolation from a biological material from different animal species for 5-10 days earlier and inhibits the growth of secondary microflora on the nutrient medium. This method can be used for cultural examination on tuberculosis in veterinary laboratories.
Keywords: tuberculosis, Mycobacterium bovis, bacteriological diagnostics, cultural method, pretreatment method, biological material.
References
1. OIE report. Bovine tuberculosis [Electronic resource]. 2014. P. 16. URL:http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/ Health_standards/tahm/2.04.07_B0VINE_TB.pdf (accessed: 26.11.2015).
2. WHO. Global Tuberculosis Report 2015. World Health Organization, 2015.
3. Prevalence and direct economic losses from bovine tuberculosis in makurdi, Nigeria / E.F.Ejeh [et al.] // Vet. Med. Int. - 2014. - Vol. 2014. - Р. 6-10.
4. Butler, A. Economic impact assessment of Bovine Tuberculosis in the South West of England / A.Butler, M.Lobley, M.Winter// CRPR Research Report Centre for Rural Policy Research University of Exeter. - 2010. - № 30. - Р. 57-59.
5. Cousins, D.V. Mycobacterium bovis infection and control in domestic livestock / D.V.Cousins // Rev Sci Tech. -2001. - Vol. 20, № 1. - P. 71-85.
6. Eurosurveillance editorial team. The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2009 // European communicable disease bulletin. - 2011. - Vol. 9, № 3. - P. 378-380.
7. Eurosurveillance editorial team. The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2013 // Euro surveillance: European communicable disease bulletin. European Food Safety Authority. - 2015. - Vol. 13, № 1. - P. 162-165.
8. Prevalence of Bovine Tuberculosis in Abattoirs of the Littoral and Western Highland Regions of Cameroon: A Cause for Public Health Concern / J.Awah-Ndukum [et al.] // Vet. Med. Int. - 2010. - Vol. 2010. - P. 8-11.
9. OIE. OIE World Animal Health Information System [Electronic resource] // Weekly Animal Disease sevice global report. 2015. URL: http://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Reviewreport/Review/viewsummary?fupser=&dothis= &reportid=17998 (accessed: 07.12.2015).
10. Horzheyev, V. Epizootolohichnyy monitorynh ta udoskonalennya systemy borot'by z tuberkul'ozom velykoyi rohatoyi khudoby u hospodarstvakh Ukrayiny [Epizootological monitoring and improvement of system to controlcattle tuberculosis in farms of Ukraine]: dissetation thesis for Candidate of vet.sci. / V. Horzheyev. - Kharkiv, 2005. - 126 p.
11. Good, M. Perspectives on the History of Bovine TB and the Role of Tuberculin in Bovine TB Eradication / M.Good, A.Duignan // Vet. Med. Int. - 2011. - Vol. 2011. - P. 1-11.
12. Burrows, W. Burrows Textbook of microbiology / W.Burrows, B.A.Freeman. - Philadelphia and London: W.B.Saunders Company, 1985. - 1038 р.
13. Pathogenesis of Mycobacterium bovis infection in cattle / S.D.Neill [et al.] // Vet. Microbiol. - 1994. - Vol. 40, №1-2. - P. 41-52.
14. Tuberculosis / edited by M.M.Madkour. - Berlin: Springer Berlin Heidelberg, 2004. - 930 р.
15. Kosenko, V. Vliyaniye obrabotki patologicheskogo materiala na vysevayemost mikobakteriy tuberkuleza [The effect of pathological material treatment on the isolation rate of Mycobacterium tuberculosis] / V.Kosenko, A.Kadochkin, N.Tazhgaliyev // Veterinariya. - 1984. - Vol. 5. - P. 67-68.
16. A national audit of the laboratory diagnosis of tuberculosis and other mycobacterial diseases within the United Kingdom / F.Drobniewski [et al.] // J.Clin. Pathol. - 1999. - Vol. 52, № 5. - P. 334-337.
17. Ratnam, S. Simplified acetylcysteine-alkali digestion-decontamination procedure for isolation of mycobacteria from clinical specimens / S.Ratnam, F.A.Stead, M.Howes // J. Clin. Microbiol. - 1987. - Vol. 25, № 8. - P. 1428-1432.
18. Nuratinov, R. A.Metod predposevnoy obrabotki biomateriala dlya vydeleniya mikobakteriy [Pretreatment method of biological material for indication of mycobacteria] / R.A.Nuratdinov [et al.] // Problemy tuberkulyoza i bolezney lyegkih - Problems of tuberculosis and lung disease. - 2006. - Vol. 9. - P. 48-50.
19. Alikayeva, A.P. Uproschenniy metod vydeleniya i vyraschivaniya chistyh kultur tuberkulyoznyh batsill iz patologicheskogo materiala [A simplified method of isolation and cultivation of tuberculosis bacilla pure cultures from pathological material] / A.P.Alikayeva // Sovetskaya veterinariya - 1940. - Vol. 11 - P. 12.
УДК 619: 616. 992. 211: 636
УНИВЕРСАЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ МИКОБАКТЕРИОПОДОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
1М.О.Баратов - кандидат ветеринарных наук, зав. лабораторией; 2А.Х.Найманов - доктор ветеринарных наук, профессор, завлабораторией; 1М.И.Нажалов - научный сотрудник;
1Э.А.Вердиева - научный сотрудник.
1ФГБНУ«Прикаспийский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт», г.Махачкала (367000, РД, г. Махачкала, ул. Дахадаева, 88;е-та11:а1ата500@гатЫвг.ги).
2ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко», г.Москва (109428, Россия, г.Москва, Рязанский проспект, д. 24,
тел. +7(495) 995-88-67).
При бактериологической идентификации культур, выделенных от реагирующих на туберкулин животных, приходится пользоваться разными средами, что создает определенные трудности в работе. Цель исследования - создание полноценной питательной среды для выращивания углеводородокисляющих микроорганизмов. Материалы и методы. Среды для изолирования коринебактерий (нитритный агар по Виноградскому, среда Сотона, кровяной агар, кровяно-теллуритовый агар, среда Клауберг II, сывороточный агар, среда Бучина),
