CC BY
12
Original articles
Оригинальные статьи
Russian Journal of Infection and Immunity = Infektsiya i immunitet Инфекция и иммунитет
2019, vol. 9, no. 3-4, pp. 485-494 2019, Т. 9, № 3-4, с. 485-494
ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО ОТВЕТА НА ГРИППОЗНУЮ ИНФЕКЦИЮ У ЖИВОТНЫХ, ВАКЦИНИРОВАННЫХ УНИВЕРСАЛЬНОЙ ВАКЦИНОЙ
Л.М. Цыбалова1, Л.А. Степанова1, М.А. Шуклина1, А.В. Коротков1, М.В. Зайцева1, В.И. Грищенко1, Р.Ю. Котляров2
1ФГБУНИИ гриппа им. А.А. Смородинцева МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия
2Институт биоинженерии, ФГУ Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук, Москва, Россия
Резюме. Создание кросс-реактивных вакцин, то есть вакцин, направленных на все субтипы вирусов гриппа А человека — это одна из приоритетных задач современной вакцинологии. Такого рода вакцины будут, в первую очередь, востребованы в предпандемический период и, кроме того, могут быть использованы для прай-мирования определенных категорий населении перед вакцинацией традиционными вакцинами из штаммов вирусов, актуальных в соответствующем эпидемическом сезоне. В отличие от традиционных вакцин универсальные не индуцируют стерилизующий иммунитет, но существенно снижают манифестацию инфекции и вероятность развития осложнений. Цель настоящей работы заключалась в оценке особенностей иммунного ответа экспериментальных животных, праймированных кандидатной универсальной вакциной, на последующую сублетальную инфекцию вирусом гриппа. Мышей иммунизировали интраназально ре-комбинантным белком FlgH2-2-4M2e, содержащим консервативные пептиды двух белков вируса гриппа А: эктодомен белка М2 и аминокислотную последовательность 76—130 второй субъединицы гемагглютинина (НА2), генетически связанные с бактериальным белком флагеллином — лигандом Toll-подобных рецепторов пятого типа (TLR5). Мыши контрольной группы получали вместо кандидатной вакцины физраствор. Через 2 недели после иммунизации мыши обеих групп были заражены сублетальной дозой вируса гриппа AH3N2 А/ Aichi/2/68. Через 2 недели после иммунизации и 1 месяц после заражения в сыворотках крови и смывах брон-хоальвеолярных лаважей (БАЛ) были определены уровни иммуноглобулинов G и А. В легких определяли процентное содержание клеток CD4+ и CD4Tem (CD44+CD62L-), секретирующих цитокины TNFa, IFNy, IL-2. На сублетальное заражение вирусом гриппа иммунизированные ранее мыши отвечали незначительной потерей массы тела, по сравнению с мышами контрольной группы, и более выраженной продукцией IgG и ^А в сыворотках крови и в смывах БАЛ как к пептидам, входящим в состав вакцинного препарата (М2е и аа76-130 НА2), так и к цельному вирусу гриппа А/АюЫ/2/68. Количество CD4+ Т-клеток, секретирующих цитокины TNFa и/или IL-2 у иммунизированных мышей, значительно превосходили аналогичные пулы Т-клеток у не-иммунизированных животных после заражения. Это относилось как к общим CD4+, так и к эффекторным Т-клеткам памяти. Именно CD4+ Т-клеткам памяти, по литературным данным, принадлежит ключевая роль в прайм-буст механизме действия вакцин и гетеросубтипоспецифическом иммунном ответе. В настоящем исследовании показан праймирующий эффект рекомбинантной кросс-протективной вакцины.
Ключевые слова: грипп А, рекомбинантная вакцина, экспериментальные животные, иммунный ответ.
Адрес для переписки:
Цыбалова Людмила Марковна
197376, Россия, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, 15/17, ФГБУ НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева МЗ РФ. Тел./факс: 8 (812) 499-15-18. E-mail: [email protected]
Библиографическое описание:
Цыбалова Л.М., Степанова Л.А., Шуклина М.А., Коротков А.В., Зайцева М.В., Грищенко В.И., Котляров Р.Ю. Особенности иммунного ответа на гриппозную инфекцию у животных, вакцинированных универсальной вакциной // Инфекция и иммунитет. 2019. Т. 9, № 3-4. С. 485-494. doi: 10.15789/2220-7619-2019-3-4-485-494
© Цыбалова Л.М. и соавт., 2019
Contacts:
Liudmila M. Tsybalova
197376, Russian Federation, St. Petersburg, Professora Popova str., 15/17, Smorodintsev Research Institute of Influenza. Phone/Fax: +7 (812) 499-15-18. E-mail: [email protected]
Citation:
Tsybalova L.M., Stepanova L.A., Korotkov A.V., Shuklina M.A., Zaitseva M.V., Grishchenko V.l., Kotlyarov R.Yu. Features of immune response against influenza infection in animals vaccinated with recombinant cross-protective vaccine // Russian Journal of Infection and Immunity = Infektsiya i immunitet, 2019, vol. 9, no. 3-4, pp. 485-494. doi: 10.15789/2220-7619-2019-3-4-485-494
DOI: http://dx.doi.org/10.15789/2220-7619-2019-3-4-485-494
FEATURES OF IMMUNE RESPONSE AGAINST INFLUENZA INFECTION IN ANIMALS VACCINATED WITH RECOMBINANT CROSS-PROTECTIVE VACCINE
Tsybalova L.M.a, Stepanova L.A.a, Korotkov A.V.a, Shuklina M.A.a, Zaitseva M.V.a, Grishchenko V.I.a, Kotlyarov R.Yu.b
a Smorodintsev Research Institute of Influenza, Ministry of Health of the Russian Federation, St. Petersburg, Russian Federation bResearch Institute of Bioengineering, FIC «Fundamentals of Biotechnology» RAS, Moscow, Russian Federation
Abstract. Generating cross-reactive vaccines aimed at targeting all human influenza A virus subtypes is among high priority tasks in contemporary vaccinology. Such vaccines will be primarily demanded during pre-pandemic period as well as used to prime some population cohorts prior to vaccination with standard vaccines containing area-relevant epidemic virus. Unlike routine approach universal vaccines do not induce a sterilizing immunity, but significantly ameliorate overt infection and probable complications. Our study was aimed at evaluating characteristics of immune response in experimental animals primed with a candidate universal vaccine challenged with sublethal influenza A virus infection. Mice were immunized intranasally with the recombinant protein FlgH2-2-4M2e containing conservative peptides derived from two influenza A virus proteins: M2 protein ectodomain and 76—130 amino acid sequence from the second hemagglutinin (HA2) subunit genetically linked to bacterial flagellin protein, which is a ligand for Toll-like receptor 5 (TLR5). Control mice received saline. Two weeks after immunization, mice from both groups were infected with a sublethal dose of A/Aichi/2/68 AN3N2 influenza virus strain. Level of immunoglobulins G and A in the blood sera and bronchoalveolar lavages (BAL) were determined two weeks after immunization and 1 month post infection. Percentage of lung CD4+ T and CD4+ Tem (CD44+CD62L-) cells secreting cytokines TNFa, IFNy, IL-2 was determined. Immunized vs. control mice responded to sublethal infection with the influenza virus by insignificant weight loss and more pronounced production of vaccine peptide-specific (M2e and aa76—130 HA2) and pan-influenza A/Aichi/2/68 virus IgG and A in the blood sera and BAL. After challenge the number of CD4+ T cells secreting cytokines TNFa and/or IL-2 in immunized mice significantly exceeded counterpart T cells in unimmunized animals that was true for both CD4+T and CD4+ Tem cells. Memory CD4+ T cells were previously shown to play a key role in the prime-boost event and heterosubtypic immune response. Thus, we were able to demonstrate a priming effect for recombinant cross-protective vaccine used in our experiment.
Key words: influenza A, recombinant vaccine, experimental animals, immune response.
Введение
В последнее десятилетие достигнуты значительные успехи в разработке так называемых «универсальных» вакцин, направленных на все субтипы вирусов гриппа А [4, 9, 20]. Две универсальные вакцины — Multimeric-001 (производство BiondVax) и Flu-v (производство компании SEEK) — зарегистрированы [14], несколько находятся на стадии клинических исследований [20]. Вероятно, подобные вакцины или их улучшенные варианты в ближайшее время прочно войдут в практику вакцинации против гриппа. Основное назначение таких препаратов — вакцинация населения в начальный период распространения пандемического вируса. Этот период характеризуется серьезным отставанием (в несколько месяцев) производства штаммоспеци-фических вакцин из пандемического вируса от начала эпидемий, вызванных этим вирусом.
Особенность универсальных вакцин состоит в том, что в их основе лежат консервативные белки/пептиды, с высокой степенью гомологии для вирусов гриппа А всех субтипов. Такие вакцины, в отличие от традиционных, содержащих поверхностные высоковариабельные вирусные белки, не обладают выраженным вируснейтра-лизующим эффектом, но способны значительно уменьшить манифестацию инфекции и предотвратить осложнения. Для их производства требуется несколько недель, и к началу эпидемии
в стране, вызванной пандемическим вирусом, может быть наработано достаточное количество доз для вакцинации населения. Второе возможное применение таких вакцин — праймирова-ние отдельных контингентов населения перед сезонной вакцинацией. Показано, что иммунизация пожилых людей кросс-реактивной вакциной МиШшепс-001 значительно улучшает иммунный ответ на последующую вакцинацию сезонной вакциной [2].
Вакцины на основе консервативных вирусных белков могут также быть использованы для праймирования маленьких детей. На фоне вакцинации универсальной вакциной заболевания будут протекать в облегченной форме и с полноценным иммунным ответом на все вирусные белки, а не только на поверхностные, как это происходит при вакцинации субъединичными вакцинами.
Цель настоящего исследования состояла в оценке особенностей иммунного ответа экспериментальных животных, праймированных универсальной вакциной, на последующую сублетальную инфекцию вирусом гриппа.
Материалы и методы
Рекомбинантный белок. Ген, кодирующий рекомбинантный белок Р1§-ИЛ2-2-4М2е, был сконструирован специалистами ФИЦ Биотехнологии РАН с использованием стандартных
методов генетической инженерии [24]. Белок Flg-HA2-2-4M2e содержит аминокислотную последовательность флагеллина из Salmonella Typhimurium, к которой на С-конце присоединен фрагмент второй субъединицы гемагглю-тинина — НА(аа76—130), консенсусный для вирусов гриппа А субтипов АН3 и АН7, относящихся ко второй филогенетической группе. Последовательность аа76—130 в нативном гемаг-глютинине входит в состав большой а-спирали и доступна с поверхности молекулы. За ним следуют 4 копии эктодомена белка М2 (М2е) вирусов гриппа А человека в сочетании M2h-M2s-M2h-M2s, где M2h — аминокислотная последовательность пептида М2е, консенсусная для вирусов гриппа А человека субтипов H1N1, H2N2, H3N2; M2s — аминокислотная последовательность М2е пандемического вируса A/H1N1/ pdm09. Последовательности M2h и M2s отличаются друг от друга четырьмя аминокислотами и включение в белковую конструкцию обоих пептидов расширяет спектр защитного действия препарата. Все фрагменты отделены друг от друга глицин-богатыми линкерами. Для конструирования вектора, экспрессирующего рекомби-нантный белок Flg-НА2-2-4М2е, была использована плазмида рQE30, куда клонировали нук-леотидную последовательность, кодирующую гибридный белок.
Экспрессия и очистка рекомбинантных белков. С целью получения штаммов, продуцирующих рекомбинантные белки, клетки E. coli штамма DLT1270 трансформировали плазмидой pQE30/ Flg-HA2-4M2e. Штаммы-продуценты накапливали в среде LB с ампициллином до середины логарифмической фазы роста (ОП600 = 0,4—0,7) при 37°C, затем добавляли IPTG до конечной концентрации 0,1 мМ и культивировали в течение еще 4 ч при 37°C. Клетки обрабатывали лизоцимом, рекомбинантные белки очищали из клеточного лизата с помощью металл-аффинной хроматографии на Ni-сорбенте.
Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПЛАТ) и вестерн-блот. Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в восстанавливающих условиях проводили по методу Лэммли [16]. Электрофорез проводили при 12 мА до достижения фронтом красителя (бромфенолового синего)
нижнего края геля. Гель окрашивали в растворе Кумасси G-250 в течение ночи при качении. После окрашивания гель отмывали в бидистил-лированной воде и документировали при помощи системы ChemiDoc MP System (Bio-Rad, США).
Белки разделяли при помощи электрофореза в полиакриламидном геле и переносили на нит-роцеллюлозную мембрану (Bio-Rad, США). Затем мембрану блокировали в 3% растворе БСА (бычий сывороточный альбумин) в течение ночи при комнатной температуре. Белки определяли окрашиванием мембраны мышиными моноклональ-ными антителами к белку M2 вируса гриппа A (14C2, ab5416: Abcam, Великобритания) в разведении 1:16 000 и кроличьими поликлональными антителами к флагеллину (ab93713, Abcam, Великобритания) в разведении 1:8000. Мембрану инкубировали 1 ч при комнатной температуре с антителами, разведенными в PBS с 0,1% твин 20 (PBS-T) и 3% БСА, затем отмывали в PBS-T. Белок определяли окрашиванием мембраны в течение 1 ч при комнатной температуре козьими антимышиными или антикроличьими IgG, меченными пероксидазой хрена (Abcam, Великобритания), в разведении 1:2000 и последующей инкубацией 5 мин в TMB (тетраметилбензидин) Immunoblot solution (Invitrogen, США).
Лабораторные животные. В исследовании были использованы линейные мыши (самки) ВаШ/c массой 16—18 г (возраст 6—8 недель), полученные из сертифицированного питомника Столбовая ГУ Научный центр биомедицинских технологий РАН. Животных содержали в виварии ФГБУ НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева Минздрава России. Основные правила содержания и ухода соответствовали нормативам, изложенным в ГОСТ 33215-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными». Протокол опыта был утвержден Комиссией по биоэтике Института.
Иммунизация и заражение экспериментальных животных. Мышей иммунизировали интра-назально (и/н) рекомбинантным белком в дозе 10 мкг/0,02 мл трехкратно с интервалом 2 недели (рис. 1). Иммунизацию проводили после ингаляционной анестезии смесью 2—3% изофлюран, 30% О2, 70% N20. Контрольным мышам вводили и/н 0,02мл PBS.
Рисунок 1. Схема проведения эксперимента на мышах
Figure 1. The scheme of the experiment in mice
Для заражения мышей был использован штамм вируса гриппа, адаптированного к мышам, — A/Aichi/2/68 (H3N2). Мышей заражали сублетальной дозой (100 мышиных инфицирующих доз — MID100) вируса гриппа A/Aichi/2/68 на 14 день после последней иммунизации. Вирус вводили интраназально в объеме 50 мкл/мышь после ингаляционной анестезии. В качестве отрицательного контроля в эксперименте использовали мышей, которым вводили PBS. После заражения проводили ежедневное наблюдение за животными в течение 14 суток. Протективное действие рекомбинантного белка оценивали по динамике массы тела. В течение двухнедельного периода ежедневно в одно и то же время измеряли массу тела животных.
Получение сывороток крови и бронхоальвеоляр-ных лаважей (БАЛ). Через 2 недели после третьей иммунизации (42 день исследования) и через месяц после заражения (72 день исследования) производили тотальный забор крови от пяти из десяти мышей каждой группы, соответственно, после их эвтаназии в С02-камере (VetTech Solutions, Великобритания). Полученную кровь инкубировали в течение 30 мин при температуре 37°С. Образцы крови с образовавшимися сгустками помещали на поверхность льда и охлаждали в течение 1 ч, затем центрифугировали в течение 15 мин при 400g. Аликвоты сыворотки крови (по 30 мкл) замораживали и хранили до использования при температуре —20°С. Бронхоальвеолярные смывы получали на 42 день исследования от мышей после эвтаназии путем двукратного промывания трахеи 500 мкл буферного раствора посредством IV катетера (BD Bioscience, США) и хранили до использования также при t = —20°С.
Получение суспензии клеток легких. Мышиные легкие получали через 2 недели после третьей иммунизации и через месяц после сублетального заражения. Легкие удаляли асептически и помещали в пробирки типа «эппендорф» со средой RPMI-1640 содержащей 0,5 мг/мл коллагеназы (Sigma, С2674) и 25 мкг/мл ДНКазы (Sigma, D4263). Легкие гомогенизировали с использованием TissueLyser II, помещали в термошейкер (45 мин, 37°С) и избавлялись от дебриса путем фильтрации (фильтрующие шприцы с диаметром пор 70 мкм, BD Biosciences, США). Эритроциты лизировали ACK буфером (0,15M NH4Cl, 1,0М KHC03, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,2—7,4) альвеолярные макрофаги отмывали полной средой RPMI-1640 с 10% ЭТС, 2 mM L-глютамина, 100 IU/ml пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина. Концентрацию клеток доводили до 5 х 106 кл/мл.
Иммуноферментный анализ. Сыворотки и БАЛ исследовали в ИФА с использованием 96-луночных планшет (Greiner, Германия). Титры антител определяли индивидуально у 5 мышей каждой группы. В качестве твердой фазы использовали синтетический пептид (G-37) —
5 мкг/мл, содержащий последовательности пептида M2e, консенсусного для вирусов гриппа человека (5мкг/мл), синтезированный в «НПО Верта» (Санкт-Петербург) или очищенный вирус A/Aichi/2/68 (H3N2) — 2 мкг/мл. Планшет блокировали фосфатным буферным раствором с 5% ЭТС. Использовали поликлональные овечьи антимышиные IgG и IgA (Abcam, Великобритания), меченые пероксидазой хрена. Для определения субклассов IgG также использовали поликло-нальные меченные пероксидазой хрена овечьи IgG1, IgG2a (Abcam, Великобритания). В качестве субстрата использовали ТМБ (тетраметилбензи-дин) (BD Bioscience). После инкубации в течение 15 мин проводили учет реакции на микропланшетном ридере I-Mark (BioRad) при длине волны 450 нм. За титр принимали наибольшее разведение сыворотки, которое давало оптическую плотность, по крайней мере, в 2 раза большую, чем бланк.
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА). РТГА проводили в соответствии с Методическими рекомендациями «Выделение вирусов гриппа в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация» (М., 2006). Сыворотку, предварительно обработанную RDE (рецептор-деструктирующий энзим) и разведенную PBS, вносили в первый ряд 96-луночного микропланшета с U-образными лунками. Далее готовили ряд последовательных двукратных разведений сыворотки в объеме 50 мкл и добавляли по 50 мкл вируса в стандартной концентрации 4ГАЕ/50 мкл. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре во все лунки вносили по 100 мкл 0,5% взвеси эритроцитов. Через 30 мин проводили учет результатов реакции. Титр антигемагглютинирующих антител выражали как величину, обратную наибольшему разведению сыворотки, при котором наблюдалось торможение агглютинации.
Мультипараметрическая проточная цитоме-трия. Мультипараметрическую проточную ци-тометрию выполняли в соответствии с протоколом BD Pharmingen™. В легких определяли CD4+ Т-лимфоциты, продуцирующие цитокины, после стимуляции одним из вирусных пептидов М2е или НА аа76—130, или вирусом гриппа A/ Aichi/2/68. Клетки стимулировали в течение 6 ч при 37°C в присутствии брефелдина А (1 мкг/мл) (BD Bioscience, США). После отмывания клеток полной средой RPMI, Fc-рецепторы блокировали антителами CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, BD Pharmingen, США), затем инкубировали с Zombie Aqua (Zombie Aqua Fixable Viability Kit, Biolegend, США) для выявления живых клеток. Клетки окрашивали CD3а-FITC, CD4 PerCP, CD62L-PE-Cy7, CD44-APC (BD Pharmingen, США) при температуре +2...+8°C в течение 30 мин. Затем клетки пермеабилизировали в соответствии с Протоколом тест-системы Cytofix/ Cytoperm Plus (BD Bioscience, США) и окраши-
вали TNFa-BV421, IFNy-PE (BD Pharmingen, США), IL-2. Сбор данных (собирали 100 000 живых CD3+ лимфоцитов) выполняли на проточном цитометре BD FACS Canto II (Becton Dickinson, США). Данные анализировали в программном пакете Kaluza, версия 1.5a (Beckman Coulter, США).
Статистическая обработка. Статистическую обработку данных проводили в программе GraphPad Prism v6.0. С учетом положительных результатов проверки данных на нормальность распределения (тест Колмогорова—Смирнова) статистическую значимость различий титров антител и антигенспецифических Т-клеток оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали значимыми при р > 0,05.
Результаты
Подлинность рекомбинатного белка Flg-HA2-2-4M2e была подтверждена методом электрофореза и в Вестерн-блоте. Электрофоре-тическая подвижность белка в ПААГ соответствовала рассчитанной молекулярной массе — 73,9 kDa, а очищенный белок взаимодействовал с моноклональными анти-М2 антителами (14C2) и поликлональными антителами к флагеллину.
Наружный фрагмент М2 белка (М2е) вирусов гриппа А является слабым иммуногеном в силу малого размера (24аа). Поэтому после естественной инфекции или вакцинации антитела (АТ) к этому белку если и определяются, то в незначительных количествах и преимущественно у лиц пожилого возраста [27]. Это подтверждается и в настоящем исследовании низкими уровнями сывороточных IgG и IgA в ответ на сублетальную инфекцию у неиммунизиро-ванных мышей (контрольная группа) (рис. 2, А—Г). У мышей, предварительно иммунизированных рекомбинантным белком (кандидатной вакциной), вирусная инфекция вызывала рост анти-M2e IgG и IgA как в сыворотках крови, так и в БАЛ (рис. 2, А—Г). Антитела в РТГА после иммунизации рекомбинантным белком, содержащим участок стебля гемагглютинина, у мышей не определялись, но на вирусную инфекцию иммунизированные животные отвечали более высокими титрами IgG, направленными к цельному вирусу (рис. 2Е).
Положительным фактом было также то, что у иммунизированных мышей после заражения соотношение субклассов IgG изменилось в сторону увеличения IgG2a (с 1,34% от суммарного значения IgG1 и IgG2а до 12,56%). Доказано, что именно IgG2а играют ключевую роль в антите-лозависимой цитотоксичности АЗЦТ [7, 18], одного из основных механизмов защиты подобного рода вакцин.
Помимо антительного ответа, иммунизация животных рекомбинантным белком Flg-НА2-2-4М2e индуцировала образование CD4+
Т-клеток (рис. 3А). Через две недели после иммунизации у мышей выявлялись М2е- и НА2-специфические Т-клетки, продуцирующие либо один из цитокинов — фактор некроза опухоли —0,08% к М2е, либо два цитокина: фактор некроза опухоли (TNFa) и интерлейкин 2 (1Ь-2) (0,06%) к обоим пептидам. В ответ на стимуляцию цельным вирусом А/Н3№ были выявлены СВ4+ Т-клетки — продуценты TNFa (0,102) и СВ4+ Т-клетки — продуценты TNFa и 1Ь-2 (0,064). Иммунизация приводила также к появлению в легких мышей М2е-специфических СВ4+ эффекторных Т-леток памяти (Тет, СВ44+СВ62Ь) (рис. 3Б), которые секретирова-ли Т№а (0,2%) и Т№а и 1Ь-2 (0,19%). Клетки СВ4+Тет, специфические к НА2, относились преимущественно к двойным продуцентам TNFa+IL-2 (0,18%). На стимуляцию цельным вирусом клетки отвечали, в основном, также продукцией TNFa. Таким образом, после иммунизации увеличилось количество СВ4 Т-клеток как общих, так и эффекторных, продуцирующих фактор некроза опухоли (TNFa) или одновременно TNFa и ^-2 к М2е пептиду, TNFa и ^-2 к пептиду НА2, а также увеличилось количество TNFa-продуцирующих клеток к цельному вирусу.
Особенностями иммунного ответа иммунизированных мышей на вирусное заражение был гораздо более активный СВ4+ Т-клеточный ответ по сравнению с неиммунизированны-ми. В первую очередь это касалось увеличения количества М2е- и НА2-специфических СВ4+ Т-клеток — продуцентов TNFa и TNFa+IL-2 (рис. 4А). Кроме того, появились клетки, продуцирующие одновременно №N7 и TNFa, и клетки тройные продуценты: IFNy+TNFa+IL-2.
Аналогичные результаты были получены и при оценке цитокинпродуцирующих М2е-и НА2-специфических эффекторных клеток памяти СВ4+ Tem в легких. На рисунке 4Б представлены уровни эффекторных СВ4+ ^клеток памяти (Гет, CD44+CD62L-) через 1 месяц после заражения вирусом гриппа. По сравнению с неиммунизированными мышами у иммунизированных после стимуляции пептидами М2е и НА2 многократно увеличилось количество клеток, секретирующих один цитокин TNFa (2,0 и 0,27% соответственно), два цитокина TNFa+IL-2 (1,9 и 0,7%), появились продуценты двух цитокинов IFNy+TNFa (0,3 и 0,1%) и также, как и у неиммунизированных мышей, стимуляция пептидами выявляла клетки памяти, продуцирующие три цитокина: IFNy+TNFa+IL-2.
Эффект более сильного иммунного ответа на инфекцию у мышей, иммунизированных ре-комбинантной кандидатной вакциной, отразился и в клиническом течении инфекции (рис. 5). У иммунизированных животных максимальная потеря веса — основного показателя состояния здоровья — составляла 6% на 7 день после за-
ражения, при этом вес полностью восстановился на 14 день, тогда как неиммунизированные мыши теряли до 14% веса тела (11 день) и к 14 дню наблюдения дефицит веса еще составлял 8%.
Обсуждение
Исследуемый препарат содержал консервативные фрагменты двух белков вируса гриппа А.
Эктодомен белка М2 (М2е) представляет собой последовательность, состоящую из 24 аминокислотных остатка и индуцирующую образование специфических что было показано разными исследователями [7, 9, 25]. Включенная в белок последовательность аа76—130 второй субъединицы гемагглютинина, консенсусная для вирусных субтипов Н3 и Н7 (гомология составляет 63,6%, а с учетом заменяемых аминокислот — 80%), име-
х о>
2 £ о
а. <Б
2 »
3 =
О щ
ш О
Si ®
ш 5
см —
5 с
^ я
■=Г 8
о7
Иммунизация Immunization
Заражение Challenge
Иммунизация Immunization
Заражение Challenge
о я & ®
о и
m о)
% ш
8Н
Иммунизация Заражение Immunization Challenge
*р = 0.0240
*р = 0.0039
Иммунизация Заражение Immunization Challenge
10n o л 12-,
x S? со о ^ c.
8- я S 2 11 -
✓ Й-m / _ О M Л» | с
6- u И // m О) AS СЗ см 10-
4- S CO ~ 9-
2- X с -1-1- s < 8-
Иммунизация Заражение Immunization Challenge
*р = 0.0871
Иммунизация Заражение Immunization Challenge
PBS
Fla-HA2-2-4M2e
Рисунок 2. Уровни антигенспецифических антител (IgG, IgA и антигемагглютининов) в сыворотках крови (А, Б, Д, Е) и бронхоальвеолярных смывах (В, Г) мышей, иммунизированных кандидатной вакциной Flg-НА2-2-4М2е или получивших физраствор, после иммунизации и после сублетального заражения вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2)
Figure 2. Antigen-specific antibodies (IgG, IgA, antihemagglutinins) in sera (A, B, E, F) and bronchoalveolar lavages (C, D) of mice immunized with candidate vaccine Flg-HA2-2-4M2е or PBS after immunization and after challenge with the influenza virus A/Aichi/2/68 (H3N2)
Примечания. Группа 1 (•) — мыши иммунизированы трехкратно рекомбинантным белком Flg-HA2-2-4M2e, и/н, в дозе 10 мкг/мышь; группа 2 (■) — мыши получали трехкратно физ. раствор и/н 10 мкг/мышь. А-Г — различия между контрольной и опытной группой везде статистически достоверны — р < 0,001. *р — указаны различия между уровнем Ig после иммунизации и сублетальной инфекции; **р — указаны различия между иммунизированными и неиммунизированными мышами после сублетальной инфекции.
Notes. Group 1 (•) — mice immunized i/n three times with protein Flg-HA2-2-4M2е at a dose of 10 ^/mouse; group 2 (■) — control (PBS). A-D — the differences between the control and experimental groups are statistically significant everywhere — p < 0.001. *p — statistical differences between the levels of Ig post immunization and post sublethal infection are indicated; **p — statistical differences between the levels of Ig post sublethal infection at immunized and non-immunized mice.
ет как В-клеточные, так и Т-клеточные эпитопы [24]. В качестве белка-носителя для этих целевых пептидов был использован флагеллин — бактериальный белок, обладающий также и адъювант-ными свойствами. Флагеллин является лигандом на антигенпрезентирующих клетках и способен стимулировать CD4+ ^клетки [3, 5, 8].
Иммунизация мышей ожидаемо индуцировала выработку специфических ^О и ^А к М2е пептиду (О37) как в сыворотках крови, так
и в смывах БАЛ, и не сказалась на уровне в сыворотках крови антигемагглютининов и направленных на цельный вирус. Но на сублетальное заражение вирусом А/АюЫ/2/68 (Н3№) иммунизированные особи отвечали не только более активным образованием ^О и ^А к пептиду М2е, но и образованием сывроточных ^О к целому вирусу гриппа.
Основным механизмом действия М2е-спе-цифических антител явлется атителозависи-
Стимуляция М2е
0,4
IFNy - - - + + + +
TNFa - + + - - + +
IL-2 + - + - + - +
Стимуляция НА2
0,4
IFNy - - - + + + +
TNFa - + + - - + +
IL-2 + - + - + - +
Стимуляция A/H3N2
0,4 п
IFNy - - - + + + +
TNFa - + + - - + +
IL-2 + - + - + - +
р < 0,05
р < 0,01
Flg-HA2-2-4M2e
ФБР
Рисунок 3. Продукция цитокинов (IFNy, TNFa, IL-2) антигенспецифическими и вирусспецифическими CD4+ T-клетками (А) и CD4+ эффекторными Т-клетками памяти (Б) легких у мышей после иммунизации рекомбинантным белком
Figure 3. Cytokine production (IFNy, TNFa, IL-2) by antigen-specific and virus-specific CD4+ T cells in mice lung after immunization (A) and challenge (B)
Примечания. По оси абсцисс — субпопуляции цитокин-продуцирующих CD4+ T-клеток, по оси ординат — % CD4+ T-клеток, продуцирующих цитокины. Внутриклеточное окрашивание цитокинов после 6-часовой активации пептидами (М2е или НА2) и вирусом A/Aichi/1/68. Для выявления CD4+ Т-клеток, продуцирующих один, два или три цитокина использовали гейтирование по Boolean. *р < 0,05; **р < 0,01.
Notes. Absciss — subpopulations of cytokine-producing CD4+ T-cells; ordinate — % CD4+ T-cells producing cytokines. Intracellular cytokine staining after 6 hours of activation with peptides (M2e and HA2). To identify mono-, double, and triple cytokine producers of CD4+ T cells, Boolean gating was used. *р < 0.05; **р < 0.01.
мая цитотоксичность (АЗЦТ) и комплемент-зависимый фагоцитоз [10, 15]. Специфические ^О к М2е пептиду опосредуют АЗЦТ через Рс-рецепторы на натуральных киллерах, макрофагах, дендритных клетках и способствуют клиренсу организма от вирусов. Ключевое значение имеют ^ подкласса О2а, которые реагируют, в отличие от ^О1, с тремя типами Рсу клеточных рецепторов (РсуЯ1, РсуЯШ, РсуЯ1У) [10, 19]. Иммуноглобулины подкласса ^О1 связываются только с рецепторами РсуЯШ и через них способствуют поглощению опсонизированных инфицированных клеток макрофагами [13]. Такая функциональная недостаточность ^О1 может компенсироваться их более высокими титрами, по сравнению с ^О2а.
Адаптивнный иммунный ответ обеспечивается не только специфическими но и СЭ8+ и СЭ4+ Т-клетками. В настоящей работе мы исследовали изменение СЭ4+ Т-клеточного ответа иммунизированных и неиммунизирован-ных животных на последующую инфекцию. Антивирусная защита организма, опосредованная СЭ4+ Т клетками, реализуется разными путями [17, 26]: СЭ4+ Т-клетки активируют В и СЭ8+ клетки, способствуют развитию воспаления. СЭ4+ Т-клетки памяти осуществляют функцию противоинфекционной защиты в синергизме с СЭ8+ и В-клетками, но вместе с тем способны защищать от низких доз вируса и независимо от других лимфоцитов и предсуществующих антител. При этом они стимулируют врожден-
Стимуляция М2е
4,0
IFNy - - - + + + +
TNFcc - + + - - + +
IL-2 + - + - + - +
IFNy - - - + + + +
TNFa - + + - - + +
IL-2 + - + - + - +
Стимуляция НА2
1,5
IFNy - - - + + + +
TNFa - + + - - + +
IL-2 + - + - + - +
IFNy - - - + + + +
TNFa - + + - - + +
IL-2 + - + - + - +
* р < 0,05
*р<0,01
Flg-HA2-2-4M2e
;;; фбр
Рисунок 4. Продукция цитокинов антигенспецифическими CD4+ T-клетками общими (A) и эффекторными клетками (Б) памяти в легких через 1 месяц после вирусного заражения
Figure 4. Production of cytokines by antigen-specific CD4+ T-cells with common (A) and effector cells (B) of memory in the lungs 1 month after viral infection
Примечания. По оси абсцисс — субпопуляции цитокин-продуцирующих CD4+ T-клеток, по оси ординат — % CD4+ T-клеток, продуцирующих цитокины. Внутриклеточное окрашивание цитокинов после 6-часовой активации пептидами (М2е и НА2). Для выявления CD4+ Т-клеток, продуцирующих один, два или три цитокина использовали гейтирование по Boolean. *р < 0,05; **р < 0,01.
Notes. Intracellular cytokine staining after 6 hours of activation with peptides (M2e and HA2). To identify mono-, double, and triple cytokine producers of CD4+ T cells, Boolean gating was used.
ный иммунитет [21]. МсЮпйгу К. и другие авторы показали, что в отсутствии В и СВ8+ клеток защита осуществляется СВ4+ Т-клетками памяти и сильно зависит от №N7 [17, 23, 26]. В нашем опыте иммунизация кандидатной вакциной приводила к образованию специфических СВ4+ Т-клеток памяти, как к М2е пептиду, так и к НА2 (аа76—130). Количество Т-клеток — продуцентов TNFa и TNFa+IL-2 после стимуляции каждым из этих пептидов достоверно отличалось от клеток животных контрольной группы. После сублетальной инфекции количество этих клеток у иммунизированных мышей увеличилось в несколько раз по сравнению с контрольными животными. Причем, важно, что наряду с TNFa-и ^-2-продуцирующими клетками, увеличилось количество клеток Ш^-продуцентов. Как показано в клинических исследованиях, именно секреция Т-клетками №N7 имеет первостепенное значение в выздоровлении от инфекции [12, 22].
Предполагается, что экспансия СВ4+ Т-клеток лежит в основе прайм-буст механизма действия вакцин. Кроме того, СВ4+ клетки памяти необходимы для гетеросубтипического иммунного ответа [12, 22]. Вероятно, это один из ведущих механизмов кросс-реактивности вакцин, содержащими в качестве целевых белков консервативные вирусные пептиды. Главным преимуществом таких вакцин является их направленность на большинство субтипов вируса гриппа, что было продемонстрировано ранее [1, 7, 24]. В настоящей работе показано, что подобные вакцины, стимулируя образование анти-М2е и анти-НА2 специ-
105 -,
со
| £ 100
s о ^^ХГ
Б* 85£
80 -|-1-1-1-1-1-1-1
0 2 4 6 8 10 12 14 Дни после зарэжения/Days after challenge —•— Flg-HA2-2-4M2e -О- ФБР
Рисунок 5. Динамика массы тела иммунизированных и неиммунизированных мышей после сублетального заражения вирусом A/Aichi/2/68
Figure 5. Dynamics of the body weight of mice post immunization and post challenge with virus A/Aichi/2/68
фических иммуноглобулинов и CD4+ Т-клеток, в том числе эффекторных клеток памяти, обладают праймирующим эффектом, который реализуется при последующей инфекции.
Благодарности
Авторы выражают благодарность Российскому научному фонду, при поддержке которого проводились данные исследования (Соглашение № 15-14-00043 от 19.05.2015 г.).
Список литературы/References
1. Степанова Л.А., Котляров Р.Ю., Шуклина М.А., Блохина Е.А., Сергеева М.В., Потапчук М.В., Ковалева А.А., Равин Н.В., Цыбалова Л.М. Влияние порядка присоединения фрагментов НА2 и М2е вирусов гриппа A к флагеллину на свойства рекомбинантных белков // Acta Naturae. 2018. Т. 10, № 1 (36). C. 90—100. [Stepanova L.A., Kotlyarov R.Ju., Shuklina M.A., Blohina E.A., Sergeeva M.V., Potapchuk M.V., Kovaleva A.A., Ravin N.V., Tsybalova L.M. Influence of the order of attachment of HA2 and M2e fragments of influenza A viruses to flagellin on the properties of recombinant proteins. Acta Naturae, 2018. vol. 10, no. 1 (36), pp. 90-100. (In Russ.)]
2. Atsmon J., Caraco Y., Ziv-Sefer S., Shaikevich D., Abramov E., Volokhov I., Bruzil S., Haima K.Y., Gottlieb T., Ben-Yedidia T. Priming by a novel universal influenza vaccine (Multimeric-001)-a gateway for improving immune response in the elderly population. Vaccine, 2014, vol. 32, no. 44,pp. 5816-5823. doi: 10.1016/j.vaccine.2014.08.031
3. Bates J.T., Honko A.N., Graff A.H., Kock N., Mizel S.B. Mucosal adjuvant activity of flagellin in aged mice. Mech. Ageing Dev., 2008, vol. 129,pp. 271-281. doi: 10.1016/j.mad.2008.01.009
4. Chen S., Zheng D., Li C., Zhang W., Xu W., Liu X., Fang F., Chen Z. Protection against multiple subtypes of influenza viruses by virus-like particle vaccines based on a hemagglutinin conserved epitope. Biomed. Res. Int., 2015:901817. doi: 10.1155/2015/901817
5. Cuadros C., Lopez-Hernandez F.G., Dominguez A.L., McClelland M., Lustgarten J. Flagellin fusion proteins as adjuvants or vaccines induce specific immune responses. Infect. Immun., 2004, vol. 72, no. 5, pp. 2810-2816.
6. Cunningham A.F., Khan M., Ball J., Toellner K.M., Serre K., Mohr E. Responses to the soluble flagellar protein FliC are Th2, while those to FliC on Salmonella are Th1. Eur. J. Immunol., 2004, vol. 34, pp. 2986-2995.
7. De Filette M., Martens W., Roose K., Deroo T., Vervalle F., Bentahir M., Vandekerckhove J., Fiers W., Saelens X. An influenza A vaccine based on tetrameric ectodomain of matrix protein 2. J. Biol. Chem., 2008, vol. 283 (17), pp. 11382-11387. doi: 10.1074/jbc.M800650200
8. Delaney K.N., Phipps J.P., Johnson J.B., Mizel S.B. A reombinant flagellin-poxvirus fusion protein vaccine elicits complement-dependent protection against respiratory challenge with vaccinia virus in mice. Viral Immunol., 2010, vol. 23, pp. 201-210. doi: 10.1089/vim.2009.0107
9. Deng L., Ibanez L.I., Van den Bossche V., Roose K., Youssef S.A., de Bruin A., Fiers W., Saelens X. Protection against influenza A virus challenge with M2e-displaying filamentous Escherichia coli phages. PLoS One, 2015. doi: 10.1371/journal.pone.0126650
10. El Bakkouri K., Descamps F., De Filette M., Smet A., Festjens E., Birkett A. Universal vaccine based on ectodomain of matrix protein 2 of influenza A: Fc receptors and alveolar macrophages mediate protection. J. Immunol., 2011, vol. 186, pp. 1022-1031. doi: 10.4049/jimmunol.0902147
11. Eliasson D.G., Omokanye A., Schon K., Wenzel U.A., Bernasconi V., Bemark M., Kolpe A., El Bakkouri K., Ysenbaert T., Deng L., Fiers W., Saelens X., Lycke N. M2e tetramer-specific memory CD4 T cells are broadly protective against influenza infection. Mucosal Immunol., 2017, vol. 11, pp. 273—289. doi: 101038/mi.2017.14
12. Epstein S.L., Lo C.Y., Misplon J.A., Lawson C.M., Hendrickson B.A., Max E.E., Subbarao K. Mechanisms of heterosubtypic immunity to lethal influenza A virus infection in fully immunocompetent, T cell-depleted, beta2-microglobulin-deficient, and J chain-deficient mice. J. Immunol., 1997, vol. 158, no. 3, pp. 1222—1230.
13. Hazenbos W.L., Gessner J.E., Hofhuis F.M. Impaired IgG-dependent anaphylaxis and Arthus reaction in Fc gamma RIII (CD16) deficient mice. Immunity, 1996, vol. 5, pp. 181—188.
14. Jegerlehner A. Influenza A vaccine based on the extracellular domain of M2: weak protection mediated via antibody-dependent NK cell activity. J. Immunol., 2004, vol. 172, pp. 5598-5605.
15. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, vol. 227, pp. 680- 685.
16. McKinstry K.K., Strutt T.M., Kuang Yi, Brown D.M., Sell S., Dutton R.W., Swain S.L. Memory CD4+ T cells protect against influenza through multiple synergizing mechanisms. J. Clin. Invest., 2012, vol. 122, no. 8, pp. 2847-2856. doi: 10.1172/JCI63689
17. Mozdzanovska K., Zharikova D., Cudic M., Otvos L., Gerhard W. Roles of adjuvant and route of vaccination in antibody response and protection engendered by a synthetic matrix protein 2-based influenza A virus vaccine in the mouse. Virology J, 2007, vol. 4:118.
18. Nimmerjahn F., Ravetch J.V. Divergent immunoglobulin G subclasses activity through selective Fc receptor binding. Science, 2005, vol. 310, pp. 1510-1512.
19. Scorza B.F., Tsvetnitsky V., Donnelly J.J. Universal influenza vaccines: Shifting to better vaccines. Vaccine, 2016, vol. 34, no. 26, pp. 2926-2933. doi: 10.1016/j.vaccine.2016.03.085
20. Strutt T.M., McKinstry K.K., Dibble J.P., Winchell C., Kuang Y., Curtis J.D., Huston G., Dutton R.W., Swain S.L. Memory CD4+ T cells induce innate responses independently of pathogen. Nat. Med., 2010, vol. 16, no. 5, pp. 558-564. doi: 10.1038/ nm.2142
21. Sun K., Ye J., Perez D.R., Metzger D.W. Seasonal FluMist vaccination induces cross-reactive T cell immunity against H1N1 (2009) influenza and secondary bacterial infections. J. Immunol., 2011, vol. 186, no. 2, pp. 987-993. doi: 10.4049/jimmunol.1002664
22. Swain S.L., McKinstry K.K., Strutt T.M. Expanding roles for CD4(+) T cells in immunity to viruses. Nat. Rev. Immunol., 2012, vol. 12, no. 2, pp. 136-148. doi: 10.1038/nri3152
23. Tsybalova L.M., Stepanova L.A., Shuklina M.A., Mardanova E.S., Kotlyarov R.Y., Potapchuk M.V., Petrov S.A., Blokhina E.A., Ravin N.V. Combination of M2e peptide with stalk HA epitopes of influenza A virus enhances protective properties of recombinant vaccine. PLoS One, 2018, vol. 13, no. 8: e0201429. doi: 10.1371/journal.pone.0201429
24. Zebedee S.L., Lamb R.A. Influenza A virus M2 protein: monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions. J. Virol, 1988, vol. 62, no. 8, pp. 2762-2772.
25. Zens K.D., Farber D.L. Memory CD4 T cells in influenza. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2015, vol. 386, pp. 399-421. doi: 10.1007/82 2014 401
26. Zhong W., Reed C., Blair P.J., Katz J.M., Hancock K. Influenza Serology Working Group. Serum antibody response to matrix protein 2 following natural infection with 2009 pandemic influenza A(H1N1) virus in humans. J. Infect. Dis., 2014, vol. 209, no. 7, pp. 986-994. doi: 10.1093/infdis/jit811
Авторы:
Цыбалова Л.М., д.м.н., руководитель отдела вакцинологии, зав. лабораторией гриппозных вакцин, советник директора ФГБУ НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия;
Степанова Л.А., к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории гриппозных вакцин ФГБУ НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия; Коротков А.В., научный сотрудник лаборатории гриппозных вакцин ФГБУ НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия;
Шуклина М.А., младший научный сотрудник лаборатории гриппозных вакцин ФГБУ НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия;
Зайцева М.В., младший научный сотрудник лаборатории гриппозных вакцин ФГБУ НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия;
Грищенко В.И., младший научный лаборатории гриппозных вакцин ФГБУ НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия;
Котляров Р.Ю., к.б.н., научный сотрудник отдела молекулярной биологии микроорганизмов отдела молекулярной биологии ФГБУ НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия.
Поступила в редакцию 11.08.2018 Отправлена на доработку 21.03.2019 Принята к печати 30.05.2019
Authors:
Tsybalova L.M., PhD, MD (Medicine), Head of the Department of Vaccinology, Head of the Laboratory of Influenza Vaccines, Advisor to the Director, Smorodintsev Research Institute of Influenza, St. Petersburg, Russian Federation; Stepanova L.A., PhD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of Influenza Vaccines, Smorodintsev Research Institute of Influenza, St. Petersburg, Russian Federation;
Korotkov A.V., Researcher, Laboratory of Influenza Vaccines, Smorodintsev Research Institute of Influenza, St. Petersburg, Russian Federation;
Shuklina M.A., Junior Researcher, Laboratory for Influenza Vaccines, Smorodintsev Research Institute of Influenza, St. Petersburg, Russian Federation;
Zaitseva M.V., Junior Researcher, Laboratory of Influenza Vaccines, Smorodintsev Research Institute of Influenza, St. Petersburg, Russian Federation;
Grishchenko V.I., Junior Researcher, Laboratory of Influenza
Vaccines, Smorodintsev Research Institute of Influenza,
St. Petersburg, Russian Federation;
Kotlyarov R.Yu., PhD (Biology), Researcher, Department
of Molecular Biology of Microorganisms, Smorodintsev Research
Institute of Influenza, St. Petersburg, Russian Federation.
Received 11.08.2018 Revision received 21.03.2019 Accepted 30.05.2019
