Особенности биотестирования изолятов с целью их экотоксикологической оценки Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

АСТРАХАНСКИЙ ВЕСТНИК ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ

№ 4 (26) 2013. с. 170-172.

УДК [579.264]: [576.32/36]

ОСОБЕННОСТИ БИОТЕСТИРОВАНИЯ ИЗОЛЯТОВ С ЦЕЛЬЮ ИХ ЭКОТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ

Татьяна Сергеевна Гридина tania-p@list.ru

Федеральное Государственное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования «Астраханский государственный технический

университет»,

Россия, 414000, г. Астрахань ул. Татищева 16, тел. (8512) 614159

биотестирование, изолят, крысы, кровь, фунгицидные, фитостимулирующие, семена.

В данной статье проведены данные по биотестированию изолята выделенного с поверхности томата сорта «Королевский» на семенах растений и лабораторных крысах. Данные фитотаксичности на семенах растений; общего количества лейкоцитов, процентного соотношения между популяциями лейкоцитов, фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа крови крыс показал, что данная суспензия изолята безвредна, что позволяет использовать ее в качестве основы для биопрепарата.

FEATURES OF BIOTESTING ISOLATES TO THEIR ECOTOXICOLOGICAL

EVALUATION

Tatiana Sergeevna Gridina Federal State Educational Institution of Higher Professional Education «Astrakhan State

Technical University,

Russia, 414000, Astrakhan, Tatishcheva street, 16, tel. (8512) 614159

tania-p@list.ru

biological testing, isolate, rats, blood, fungicidal, phytostimulating, seeds.

In this article gives dates on biotesting isolates selected from the surface of tomato varieties «Royal» on plan t seed and laboratory rats. Dates of the phytotoxicity on the seeds ofplants; the total number of cells, the percentage ratio between populations of leukocytes, the phagocytic index, and the phagocytic number of rats blood showed that this suspension of the isolate is harmless, that allows it to use as the basis for a biological product.

Заболевания растений являются одним из факторов, серьезно ограничивающих продуктивность сельского хозяйства во всем мире. Ущерб, причиняемый фитопатогенными микроорганизмами составляетот 15 до 20 % общей продуктивности мирового растениеводства.

В настоящее время химические пестициды являются наиболее востребованным инструментом в защите растений. Безопасных средств защиты особой активностью обладают микробные препараты, основу которых составляют бактерии, ассоциированные с растениями, являющиеся составной частью иммунной системы растения. Данные микроорганизмы представляют собой ассоциации, обладающие фунгицидными, фитостимулирующими и антогонистическими свойствами. Поэтому изучение ассоциаций микроорганизмов, обладающих выше перечисленными свойствами, является актуальным [4]. При этом применяемые биопрепараты должны быть безопасны для организмов разного уровня организации.

Биотестирование - определение токсичности пробы (воды, почвы, суспензии и т.д.) для данного организма в лабораторном эксперименте. В основе данного метода исследования лежит биологическое моделирование. Каждая модель является формой отражения действительности.

При биотестировании происходит перенос знаний с простой системы (смоделированной экосистемы в лабораторном опыте) на более сложную (экосистему в реальных условиях). Подопытные организмы в рамках одного эксперимента должны быть визуально одинаковыми [3].

При определении степени токсичности исследуемой суспензии методами биотестирования большое значение имеет чувствительность к токсикантам подопытных организмов. Наиболее корректный результат достигается при использовании нескольких тест -объектов из разных систематических групп. В нормативных документах [2] рекомендовано использовать минимум два тест-организма.

Целью данной работы явилось биотестирование изолятов, выделенных с поверхности растений обладающими антагонистическими и фунгицидными свойствами. Объектов исследования явился изолят томата сорта «Королеский».

Изолят выделялся с поверхности томата сорта «Королевский» методом смыва на томатный и картофельный агар [1,5,6]. Он представляет собой грамотрицательные короткие толстые палочки. Обладает выраженными фунгицидными, антагонистическими и фитостимулирующими совойствами [4].

Для возможного использования выделенного изолята в качестве основы биопрепарата для защиты и стимуляции сельскохозяйственных растений изучалась его токсичность для различных тест-объектов (семена растений и лабораторные крысы).

В ходе проведенных исследований использовали суспензию изолята с концентрацией клеток 109 КОЕ/мл смыва. Для определения токсичности суспензии для растений подсчитывалось количество проросших семян после обработки их изучаемыми изолятами.

В таблице 1 представлены данные по фитотоксичности суспензии исследованных изолятов в виде процентного прорастания семян по отношению к контролю.

Таблица 1

______________________________________Прорастание семян, %_____________________________

Вариант Изолят

Контроль 97,5±2,1

Опыт 94±2,7

Анализ полученных результатов показал, что суспензия изучаемого изолята не токсична.

Исследование выполнено на 44 самцах белых беспородных крыс средней массой 220 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и пище. Животные были разделены на следующие группы: 1 группа - контроль (животные, получавшие

физиологический раствор); 2 группа - животные, получающие суспензию изолята. Суспензии вводили внутрижелудочно в дозе 1 мл в течение 7 дней.

Декапитацию животных проводили после предварительной наркотизации диэтиловым эфиром.

Оценка иммунотропной активности проводилась на основе определения общего количества лейкоцитов, процентного соотношения между популяциями лейкоцитов, фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа.

В качестве источника нейтрофилов использована гепаринизированная кровь крыс. После центрифугирования 0,5 мл крови (1500 об/мин, 5 мин), к осадку крови добавляли 1 мл 1% раствора желатина, приготовленного на среде 199. Через 30 мин инкубации при t=37°С производили забор надосадочного слоя, состоящего из клеток белой крови, к которому добавляли 2 -3 мл среды 199 и центрифугировали (1500 об/мин, 10 мин). Надосадочную жидкость сливали, а к осадку добавляли 0,5 мл среды 199. Полученную взвесь лейкоцитов использовали для постановки реакции фагоцитоза. В качестве тест-объекта использовали меланово-формальдегидные латексы размером 1,5-2 мкм («МинМедБиопром», Россия). Латекс предварительно трехкратно отмывали физраствором (3000 об/мин, 20 мин) и ресуспендировали в среде 199. Число латексных частиц доводили средой 199 до 75 тыс./мкл. В центрифужной пробирке смешивали 0,1 мл клеточной суспензии и 0,1 мл взвеси частиц латекса. После инкубации смеси ^=37°С, 30 мин), сделанные

мазки фиксировали в этаноле и окрашивали по Романовскому-Гимзе. О фагоцитарной активности нейтрофилов судили по следующим показателям: фагоцитарный индекс или % фагоцитоза (количество нейтрофилов с латексом из 100); фагоцитарное число (кол-во частиц латекса/100).

Статистическую обработку данных проводили с использованием ^критерия Стьюдента. Достоверно значимыми считали изменения при р<0,05.

Таблица 1

Влияние на фагоцитарную активность нейтрофилов

Контроль Изолят

Фагоцитарный индекс 0,79±0,018 0,81±0,012

Фагоцитарное число 8,49±0,256 8,56±0,150

Условные обозначения: * - достоверность различий между опытными и контрольной группами.

Введение суспензии изолята не изменяло фагоцитарную активность нейтрофилов в сравнении с контрольными животными. И фагоцитарный индекс и фагоцитарное число оставались на уровне контрольных значений.

Таблица 2

Влияние на лейкоцитарную формулу

Контроль Суспензия 1

Нейтрофилы 38,4±4,47 33,1±1,47

Лимфоциты 45,0±3,10 47,7±1,02

Эозинофилы 6,4±0,67 6,9±0,57

Моноциты 10,0±1,88 12,3±1,51

Введение суспензии изолята значительно не изменяло лейкоцитарную формулу белой крови.

Таким образом, можно заключить, что данный изолят безопасен для растений и животных, что позволяет использовать его в качестве основы создания биопрепарата для защиты сельскохозяйственных растений от заболеваний и стимуляции их развития.

Литература

1. Дзержинская, И.С. Питательные среды для выделения и культивирования микроорганизмов [Текст] : учебное пособие / - Астрахань : Изд-во АГТУ, 2008. - 348 с.

2. Критерии отнесения отходов к классам опасности для окружающей природной среды[Текст] // Приказ МПР РФ № 511 от 15.06.2001. - 13 с.

3. Маячкина Н.В.. Особенности биотестирования почв с целью их экотоксикологической оценки [Текст] / Н.В. Маячкина, М.В. Чугунова // М.: Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2009, № 1, с. 84-93.

4. Пономарева, Т.С. [Текст] Микроорганизмы ассоциированные с растениями сем Пасленовых (на примере томата сорта «Королевский» / Естественные науки АГУ. - 2012.

5. Практикум по микробиологии [Текст] : учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / А. И. Нетрусов, М. А.

Егорова, Л. М. Захарчук и др. ; под ред. А. И. Нетрусова. - М. : Академия, 2005.

6. Теппер, Е. З. Практикум по микробиологии [Текст]: Учебники и учеб. пособия для высш. учеб. заведений /

под ред. В. К. Шильниковой. - 5-е изд., перераб. и доп. - М. : Дрофа, 2004.

7. Дзержинская, И.С., Коряжкина М.Ф. Исследования фунгицидной активности представителей рода Bacillus [Текст] / Естественные науки АГУ. - 2009.