CC BY
163
УДК 663.1
Особенности биосинтеза белка одноклеточными организмами
и способы его регуляции
А. А. Кудряшева, научный консультант ООН, д-р техн., биол., мед. наук, профессор, академик
А.А. Тихомиров, д-р экон. наук, профессор, академик, сотрудник ООН
Одноклеточные организмы характеризуются уникальными возможностями в области биосинтеза клеточного протеина, пригодного для пищевых и кормовых целей. Они могут служить неисчерпаемыми протеиновыми и аминокислотными ресурсами. Одним из важнейших их достоинств является высокая скорость образования протеина, содержащего все незаменимые аминокислоты. При этом одноклеточные организмы обладают высокой эффективностью преобразования азотистых питательных веществ в отличие от животных. Не менее важным является и то обстоятельство, что их клетки не содержат антибиотиков, гормонов роста, профилактических вакцин и ряда других нежелательных веществ для организма человека. Мясо некоторых животных может содержать паразитические формы живых организмов, в том числе и болезнетворные организмы. Тогда как белковая биомасса одноклеточных организмов не представляет такой потенциальной опасности.
Одноклеточные организмы среди живых существ не имеют себе равных по скорости образования белка. Их биомасса способна увеличиваться в геометрической прогрессии и удваиваться лишь за несколько часов. У животных это происходит в течение месяцев или нескольких лет в зависимости от их вида и размера. Благодаря большому содержанию белка и отсутствию балластных веществ сами клетки являются пригодными для пищевых и кормовых целей. Содержание в них биологически активных веществ значительно больше,
чем у растений и животных. Как правило, урожай растений и убойные животные состоят из съедобных и несъедобных частей. Их соотношение определяется особенностями сырья растительного происхождения и видами убойных животных. У одноклеточных организмов вся биомасса может применяться для пищевых и кормовых целей или для переработки без необходимости удаления балластных частей. В природе известно много микроорганизмов, не являющихся прямыми конкурентами в питании человека. Они способны использовать для размножения и роста разнообразные субстраты, не имеющие пищевой и кормовой ценности. Одноклеточные организмы могут питаться и вторичными пищевыми ресурсами, образующимися в процессе уборки, хранения, переработки и реализации плодоовощного сырья, лекарственных и технических культур.
Это способствует эффективной утилизации растительных ресурсов и поддержанию экологического равновесия в природе за счет исключения активного распространения фитопатогенных микроорганизмов.
Сравнительный анализ показывает, что одноклеточные и многоклеточные организмы значительно различаются по скорости образования и выходу протеиновой биомассы в процессе ее получения. Например, растения с одного гектара дают в среднем следующее количество сырого протеина (кг): озимая пшеница - 550, конские бобы - 960, горох - 860, соя -880, люцерна - 2000 (сухая биомасса).
Французскими исследователями (Растительный белок, М., 1991) по-
казано, что по содержанию лизина значительно выделяются следующие растения (кг/га): люцерна - 82,0; конские бобы - 67,2; горох - 58,3; соя - 57,2; рапс - 26,0; пшеница с повышенным содержанием белка -25,5.
В процессе изучения растительного сырья выявлены источники, обладающие большим количеством серосодержащих аминокислот. К их числу могут быть отнесены (кг/га): рапс -24, конские бобы - 25, соя - 28,6; пшеница (Talent Courtol) с повышенным содержанием белка - 37,3; люцерна - 52,0.
Исследования, проведенные учеными, показали, что люцерна и конские бобы дают максимальный выход сырого протеина с высоким содержанием лизина и серосодержащих аминокислот. Эти свойства делают их предпочтительными по сравнению с другими сельскохозяйственными культурами.
По сравнению с растительным белком выход протеиновой продукции животноводства с одного гектара значительно ему уступает. Так, при использовании обычных пастбищ для крупного рогатого скота выход белка составляет лишь 30 кг, а при выпасе его на кормовых лугах -60 кг. С равноценной площади земли молоко коровье позволяет увеличить выход белка до 115 кг, а куриные яйца -до 80 кг белка с 1 га.
В отличие от животных и растений, в процессе получения протеина одноклеточных организмов не требуются большие площади земли, длительные сроки получения белковых ресурсов и значительные трудовые затраты. Например, 30 кг пищевого протеина они образуют за 24 ч, в расчете на 1 м3 питательной среды. При этом возможно создание экологически безопасных условий, исключающих попадание вредных веществ в протеиновые ресурсы.
Высокая скорость образования протеинов в одноклеточных организмах и огромная эффективность преобразования питательных субстратов позволяет широко их использовать для продовольственных, медицинских, сельскохозяйственных и многих других целей. В этом отношении одноклеточные организмы обладают неоспоримыми преимуществами. По биологической ценности такой протеин сходен с длительно получаемыми белками животного происхождения. Продолжительность образования протеина у одноклеточных характеризуется часами, тогда
как у растении - неделями, а у животных - месяцами и годами в зависимости от их вида и размера.
Одноклеточные организмы характеризуются большоИ скоростью процесса размножения. Через каждые 15-20 мин могут появляться прокари-отные клетки, которые размножаются простым делением. ТакоИ быстрый темп размножения позволяет за сутки получать огромное количество белковой биомассы.
Дрожжи способны размножаться вегетативным способом, при помощи спор, образующихся бесполым и половым путем, а некоторые виды это делают и при помощи простого деления. У них процесс почкования связан с образованием в виде бугорка нового зародыша, называемого почкой. Часть содержимого материнской клетки переходит в формирующуюся и растущую молодую клетку. Этот процесс длится всего лишь около 2 ч. Одна клетка дрожжей может образовывать несколько почек одновременно, которые после завершения формирования и роста способны сами размножаться и способствовать быстрому увеличению биомассы. Таким образом, через каждые 2 ч количество клеток способно увеличиваться в два раза, т. е. их биомасса удваивается за относительно короткий срок. В то же время обладатели ценного белка животного происхождения требуют значительно больше времени для накопления биомассы. Например, для получения цыпленка необходимо ждать 21 день для появления его из яйца на белый свет со средней массой не более 50 г. Один килограмм биомассы цыпленок набирает только через 3-4 мес. До рождения теленка проходит несколько месяцев. Плодовитость коровы стабильная и не превышает одной особи в год. Половозрелый возраст крупного рогатого скота наступает через несколько лет. Средний вес рожденного теленка составляет 30 кг. Для увеличения его биомассы до 300-360 кг требуется не менее года. Таким образом, для получения белка животного происхождения требуется довольно длительный период времени, тогда как протеины одноклеточных организмов могут быть получены за несколько часов. Удвоение их биомассы требует лишь 8-10 ч.
К настоящему времени созданы научные и индустриальные основы для получения биомассы одноклеточных организмов, содержащей полноценные протеины. Для эффек-
тивного синтеза белка разработаны технологические параметры и питательные среды с учетом особенностей и физиологических потребностей промышленных организмов. В биотехнологической практике используют приемы и подходы, сходные с выращиванием растений и животных. Для одноклеточных организмов создают благоприятные условия окружающей среды и сбалансированное питание в соответствии с требующимися для них ингредиентами. Если сравнивать степень изученности особенностей питания некоторых из них и человека, то одноклеточные организмы находятся в значительно лучшем положении, чем люди.
С точки зрения питательных аспектов довольно хорошо изучены хлебопекарные дрожжи, являющиеся важнейшими представителями одноклеточных организмов. На их примере рассмотрим промышленные процессы регуляции и ускорения биосинтеза белка. К настоящему времени накоплен большой научно-практический материал об особенностях их питания, культивирования, роста и размножения. На скорость образования ими белковых молекул оказывают большое влияние многочисленные факторы. Благодаря их изученности они успешно регулируются или полностью могут быть устранены в случае необходимости. Тогда как при получении пищевых протеинов многоклеточных организмов это не всегда возможно по многим причинам экологического, метеорологического, климатического и другого характера.
Особенности биосинтеза белка одноклеточными организмами изучены в значительно большей степени, чем животными и растениями. Это объясняется тем, что, например, дрожжи ученые давно используют в качестве биологических моделей, которые подвергают прямым и косвенным негативным и экстремальным воздействиям. В таких экспериментах четко проявляется реакция организма на внешние воздействия и особенности синтеза белка клетками.
В процессе изучения хлебопекарных дрожжей показано, что в результате синтеза белка клетки увеличиваются до определенного размера, после чего начинается процесс их размножения. Одна дрожжевая клетка сахаромицетов способна образовывать в среднем до 40 дочерних организмов. Время, в течение которого вырастает новая молодая клетка и начинает почковаться, при-
нято называть продолжительностью генерации. Этот показатель косвенно характеризует скорость образования протеина. Об этом процессе можно судить и по величине коэффициента часового прироста биомассы дрожжей. Он показывает, во сколько раз происходит ее увеличение в течение одного часа или большего промежутка времени в зависимости от условий культивирования микроорганизмов. Для синтеза белка дрожжевые клетки нуждаются в азотистом питании. Наиболее легко они усваивают аминокислоты, амиды, аммонийные соединения и некоторые продукты распада белков. В качестве неорганических форм азота дрожжи используют аммиачные соли молочной, уксусной, яблочной, янтарной и других кислот, а также сернокислый и фосфорнокислый аммоний. Аммиак считают ближайшим предшественником органического азота.
Для синтеза собственных аминокислот дрожжи потребляют аммиачный азот, отделенный от аминокислот, аммонийных соединений или других азотистых веществ, содержащихся в питательной среде. В процессе обмена веществ они ассимилируют азотсодержащие соединения и удваивают как аммиачный, так и азот органических веществ. Эта их способность использовать две формы азота имеет большое практическое значение для крупномасштабного синтеза белка в промышленных условиях. Их большим преимуществом является и то, что клетки дрожжей способны самостоятельно синтезировать все аминокислоты, входящие в состав белковой молекулы.
Особенности биосинтеза белка хлебопекарными дрожжами относительно хорошо изучены, что обеспечивает исключение грубейших ошибок в производственных условиях (Коновалов С. А., 1980).
Как известно, рост и размножение дрожжей непосредственно зависят от скорости и эффективности синтеза белка их клетками. На эти взаимосвязанные процессы большое влияние оказывают химические вещества, усиливающие или ингибирующие физиологические функции этих одноклеточных организмов. Их рост, размножение, а следовательно и синтез белка сильно задерживаются при содержании в среде 0,0025% сернистого ангидрида; 0,002% фторида натрия; 0,0005% нитритов; щавелевой кислоты - 0,001%, муравьиной - 0,0085%, уксусной - 0,02% и масляной кислоты 0,005%. Даже
небольшие концентрации солей некоторых тяжелых металлов вызывают гибель дрожжей. Например, клетки погибают при содержании в среде 0, 005% меди, 0,0005% мышьяка и 0,000001% серебра. Губительны для них и нитриты в концентрации более 0, 004%. Формалин в количестве 0,001 % приостанавливает рост дрожжей, а при содержании его в среде в пределах до 0,09 % происходит нарушение нормальной жизнедеятельности клеток (Семиха-това Н. М., 1980).
Скорость и эффективность синтеза белка значительно замедляется у дрожжей при недостатке и несбалансированном соотношении питательных веществ в среде, при несоответствии оптимуму температуры, рН среды, концентрации раствора, интенсивности аэрации и в присутствии химических веществ, ингибирующих ферментативные процессы (антибиотики, ядохимикаты, соли тяжелых металлов и др.).
Благодаря негативным ответным реакциям на вредные химические вещества представляется возможным получать биопродукцию без избыточного содержания веществ, опасных для здоровья человека.
По расчетным данным молекула белка, содержащая около 150 аминокислот, синтезируется одноклеточными организмами за 1,5 мин (Коновалов С. А., 1980).
Уникальная способность одноклеточных организмов синтезировать белок быстрее растений и животных позволяет в больших количествах и за более короткий срок получать пищевые и кормовые протеины. В них сейчас остро нуждаются многие жители нашей планеты, сельскохозяйственные и домашние животные, которые не могут синтезировать незаменимые аминокислоты.
Как и у других организмов, белок является одним из наиболее важных функциональных компонентов одноклеточных существ. В их клетках его синтез связан непосредственно с генетическим аппаратом и факторами внешней среды. В процессе образования белка метаболиты клетки могут действовать на определенный участок ДНК (ген) как индукторы, или как ре-прессоры. Индуктор или репрессор влияет на последующий синтез матричной РНК, передающей в рибосомы информацию для синтеза белка. Для его создания одноклеточные организмы используют углерод, кислород, азот и водород в сочетании с рядом минеральных элементов.
На первом этапе образуются низкомолекулярные предшественники, из которых происходят внутриклеточные белки.
Согласно современным представлениям процесс синтеза белка делят на четыре стадии. На первой стадии происходит активация аминокислот в протоплазме. В процессе активации аминокислоты соединяются с АТФ при помощи фермента. При этом для каждой аминокислоты существует свой определенный активирующий фермент:
[аминокислота + АТФ + фермент] ^ [аминокислота + АТФ] ^ [активированная аминокислота + АТФ + + фермент]
В дальнейшем активированная аминокислота обладает способностью соединяться с другими аминокислотами.
На второй стадии синтеза белковых веществ происходит связывание активированной аминокислоты с транспортной т-РНК. При этом одна молекула аминокислоты присоединяется к одной определенной молекуле т-РНК. В результате образуется богатое энергией соединение, которое в дальнейшем используется для образования пептидных связей в молекуле белка. Схематически это может быть представлено так: [активированная аминокислота + АТФ] + т-РНК ^ [активированная аминокислота + т-РНК] + АТФ.
Это соединение транспортируется к рибосомам. В процессе третьей стадии происходит синтез полипептидных цепочек и образование белковой молекулы. К растущей белковой цепочке присоединяются аминокислоты со скоростью около двух аминокислот в секунду.
На четвертой стадии происходит образование трехмерной структуры белковых молекул. Процесс создания объемной молекулы белка еще недостаточно изучен.
Механизмы протекания ферментативных реакций у одноклеточных организмов, как и у других живых существ, сложны, разнообразны и зависят от ряда факторов как переменного, так и постоянного характера. Несмотря на микроскопические размеры, процесс синтеза белка у них осуществляется значительно быстрее, чем у более сложных организмов. В процессе синтеза белка аминокислоты одноклеточных организмов используются не только в качестве пластического материала. Они являются и предшественниками многих биомолекул, выполняющих
специализированные функции. Биосинтез аминокислот как основных структурных единиц белка складывается из многих последовательных реакций, осуществляемых одноклеточными организмами. Образование в них большинства аминокислот происходит по принципу обратной связи с участием особых ферментов клетки. В ней осуществляется и регуляция синтеза ферментов, участвующих в образовании аминокислот. Их синтез может подавляться (репрессироваться), если из питательной среды поступает достаточное количество готовых для образования белка аминокислот. Наличие двух форм регуляции процесса синтеза белка служит выражением специфики и экономичности использования аминокислот (Коновалов С. А., 1967, 1972, 1980; Ленинджер А., 1974 и др.).
Как и другие живые организмы, одноклеточные существа не способны без белка осуществлять обмен веществ, связанный с ассимиляцией азотсодержащих соединений. Аминокислоты являются первыми продуктами биологической ассимиляции азота. Одноклеточные организмы за счет его неорганических форм синтезируют все аминокислоты, входящие в состав их белка; тогда как человек и животные не обладают этой способностью и нуждаются в готовых незаменимых аминокислотах.
Одноклеточные организмы способны потреблять для синтеза белка более разнообразные субстраты, чем животные и растения. Они не являются конкурентами в питании и могут использовать как органические, так и неорганические субстраты, даже вредные для других живых организмов. Сейчас известно много видов одноклеточных организмов, которые могут быть использованы в качестве протеиновых ресурсов. По аминокислотному составу и безопасности для здоровья человека они соответствуют санитарно-гигиеническим требованиям и не вызывают инфекционных заболеваний и аллергических реакций.
Синтез белка одноклеточными организмами на основе прямой ассимиляции аминокислот представляет собой эффективный способ ускорения процесса, увеличения выхода биомассы и улучшения качества протеиновых ресурсов. При наличии в смеси всех аминокислот, необходимых для биосинтеза белка, одноклеточные организмы потребляют их без предварительного дезамини-рования. При этом достигается мак-
симальный рост клеток. При неполном составе аминокислот в питательной среде проявляется избирательная способность клеток в их потреблении и используется дезаминирование отдельных из них, вследствие чего убывание аминокислот из питательной среды происходит в разных количествах и размножение дрожжей протекает медленнее и слабее.
При прямой ассимиляции аминокислот дрожжевые клетки их используют полностью в качестве источника азота. Одновременно они усваивают и углеродистый остаток. Размножение дрожжей на средах с полным набором аминокислот протекает интенсивнее, чем на средах, содержащих отдельные аминокислоты или неорганические азотистые соединения. Количество потребляемых аминокислот дрожжами значительно изменяется в зависимости от фазы их развития. В экспоненциальной фазе роста у них наблюдаются наиболее высокие потребности в аминокислотах (см. таблицу).
Исследования, проведенные отечественным ученым С. А. Коноваловым, свидетельствуют о том, что дрожжи для синтеза белка используют разное количество аминокислот. В фазе затухания роста некоторые из них не потребляют их из питательной среды вообще.
На основе полученных результатов возможно осуществлять контроль за содержанием аминокислот в питательной среде и развивать новое направление по ускорению синтеза белка одноклеточными организмами с учетом их физиологических потребностей. Реальные возможности управления биосинтезом белка с регуляцией его аминокислотного состава открывают большие возможности в ликвидации протеинового дефицита в масштабах нашей планеты Земля.
Протеины одноклеточных организмов содержат все незаменимые аминокислоты и характеризуются благоприятным составом для организма человека. У этих микроскопических существ аминокислоты находятся как в связанном, так и в свободном состояниях, что характерно и для организма человека. Количество свободных аминокислот в клетках поддерживается на определенном уровне. Их внутриклеточный синтез регулируют ферменты, выступающие в роли индукторов или репрессоров этого процесса. Синтез необходимых ферментов происходит в самой клетке из свободных аминокислот
Потребление аминокислот дрожжами, мкг на 1 мл сбраживаемого субстрата
Аминокислота в лагпериоде в экспоненциальной фазе в стационарной фазе в фазе затухания всего
Алании 76 81 53 41 251
Глутаминовая кислота 132 259 133 73 598
Лейцин 139 194 39 23 395
Аминомасляная 22 78 23 0 123
Метионин 55 32 5 0 92
Серин 152 140 0 0 292
Тирозин 59 108 40 14 221
Цистеин 54 22 34 0 110
Фенилаланин 158 233 30 3 424
Лизин + гистидин 42 139 0 0 181
Аспарагиновая + глюкоза 156 295 65 30 546
Сумма 1046 1581 422 184 3233
с помощью саморегуляционных биохимических процессов.
При экзогенном аминокислотном питании их ферментная система способна перестраиваться в соответствии с количественным содержанием внутриклеточных аминокислот. Так, дрожжи способны синтезировать все незаменимые аминокислоты, требующиеся для образования белковых молекул. Они их образуют из минеральных солей и безазотистых органических веществ. За эту способность их относят к особой группе, называемой аминоавтатрофами. В отличие от представителей этой группы известны и аминогетеротро-фы, которые самостоятельно не могут синтезировать даже какую-либо одну из аминокислот. Естественно, они являются их потребителями, а не источниками образования.
У одноклеточных организмов пути биосинтеза незаменимых аминокислот являются более сложными и включают от 5 до 15 стадий; тогда как биосинтез заменимых аминокислот у них происходит менее чем в 5 стадий. Промежуточные продукты биосинтеза незаменимых аминокислот играют важную роль в клетках и служат предшественниками ряда других типов молекул (Коновалов С. А., 1980).
К настоящему времени выявлены реальные возможности и способы биорегуляции количественного содержания аминокислот у одноклеточных организмов, а также установлена возможность увеличения количества отдельных незаменимых аминокислот в их клетках (Коновалов С. А., 1980, Кудряшева А. А., 1992).
Количество аминокислот можно существенно повышать за счет прямой их ассимиляции одноклеточными организмами и регуляции их количества и состава в питательной среде. В процессе промышленного получения аминокислот из одноклеточных организмов имеется возможность использовать специально выведенные для этих целей виды с учетом возраста и фазы развития организмов. Аминокислоты в биомассе одноклеточных организмов изменяются в зависимости от их индивидуальных особенностей, возраста, жизненного цикла, а также от состава питательной среды. Фактические экспериментальные данные, полученные к настоящему времени, позволяют научно обоснованно и эффективно осуществлять коррекцию количественного и качественного состава аминокислот в этих организмах, что не всегда возможно с растениями и животными.
Рядом исследователей отмечена целесообразность использования одноклеточных организмов в качестве натуральных источников незаменимых аминокислот (Басс-Шадхан Х. Ф., 1960; Беликов В. М. и др., 1978; К1пБе!а, Латов В. К., 1981; Неклюдов А. Д., Навашин С. М., 1985; Лепесова Р., 1992; Кудряше-ва А. А., 1986, 1987, 1992, 1995-1997, 2000).
Таким образом, дрожжи являются представителями одноклеточных организмов, которые содержат все незаменимые аминокислоты, что позволяет их использовать в качестве биорационального сырья в различных вариациях.
