CC BY
41
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
«НАУКА. ИННОВАЦИИ. ТЕХНОЛОГИИ», № 3, 2014
удк 57.088.2 Денисова Е. В. [Denisova E. V.], Бегдай И. В. [Begday I. V.], Андрусенко С. Ф. [Andrusenko S. F.], Супрунчук В. Е. [Suprunchuk V. E.], Кораблинова Н. В. [Korablinova N. V.], Фофанова Д. Ю. [Fofаnova D. U.]
оригинальная биотехнология получения матриц, содержащих маннан и фукоидан, для фармацевтических целей
Original biotechnology of receiving the matrixes containing mannane and fucoidane for the pharmaceutical purposes
В статье предложена новая методика получения липосомальных матриц на основе полисахаридов как носителей лекарственных препаратов, что связано в первую очередь с их низкой токсичностью, биодеградируемостью, биодоступностью. Усиление терапевтического эффекта, улучшение фармакокинетического профиля, увеличение биодоступности, с одновременным снижением побочного действия фармацевтических средств, а так же повышение химической и конформационной стабильности позволяет создавать при использовании различных эмульгаторов и инициаторов полимеризации отличающиеся по размеру матрицы. Маннан получали из 4 видов дрожжей, фукоидан - из бурых водорослей. Показано, что полисахариды вместе или по отдельности включаются в формирование капсулы.
Ключевые слова: маннан, фукоидан, дрожжи, липосомы, адсорбция, матрица.
Abstract: In article the new technique of receiving the liposomalnykh of matrixes on the basis of polysaccharides as carriers of medicines that is connected first of all with their low toxicity, a biodegradiruyemost, bioavailability is offered. Strengthening of therapeutic effect, improvement of a pharmacokinetic profile, increase in bioavailability, with simultaneous decrease in side effect of pharmaceutical means, and also increase of chemical and conformational stability allows to create the matrixes differing by the size when using various emulsifiers and initiators of polymerization. Mangnang received from 4 types of yeast, фукоидан - from brown seaweed. It is shown that polysaccharides together or separately join in formation of a capsule.
Key words: mannane, fucoidane, yeast, liposomes, adsorption, matrix.
Основными принципами медикаментозной терапии является дозирование и периодичность применения лекарственных средств для обеспечения их активности, биодоступности и соответс-
твенно эффективности. Однако многие лекарственные препараты имеют малый период биологического полураспада, а для некоторых важна пролонгация действия, в результате чего требуется многократное введение препарата во время лечения.
Усиление терапевтического эффекта, улучшение фармакокине-тического профиля, увеличение биодоступности с одновременным снижением побочного действия фармацевтических средств, а также повышение химической и конформационной стабильности возможно при использовании объектов наноструктурной природы. Причем препарат может быть либо включен в наноструктуру, либо абсорбирован на поверхности.
При создании наноструктурных матриц все большее внимание уделяется природным полимерам, а именно полисахаридам, что связано в первую очередь с их низкой токсичностью, биодеградируемос-тью, биодоступностью. Среди полисахаридов чаще используют в этих целях хитазан, хитин, альгинат, хондроитин сульфат, фукоидан и т. д.
Самым простым способом формирования нано- и микросфер является смешивание растворов разноименно заряженных полиэлектролитов. Возможно использование растворов двух и более полисахаридов, например, формирование микрочастиц хитазан-фукоидан, так называемых фукосфер [10], хитазан-фукоидан-хондроитин сульфат [3], хитазан-альгинат-декстран сульфат [6]. При этом один из полисахаридов может быть химически модифицирован, например, хитазан-гидроксипропилметилцеллюлоза [9]. Кроме того, полисахариды смешивают с белковыми структурами [4]; синтетическими полимерами, например, фукоидан-поликапролактон [5]. Формирование микросфер таким способом приводит к получению смеси частиц разного размера. Для выравнивания структур по размерам применяется ультразвук.
Формирование полисахаридных микросфер возможно также с использованием раствора и одного полисахарида, для этого необходимо введение в раствор солей металлов, способствующего гелеобра-зованию выбранного полимера. Так, нами ранее сообщалось, что для гелеобразования фукоидана [2] можно использовать соли Са2+. Причем микросферы могут быть образованы путем внешнего и внутреннего гелеобразования.
Альтернативной вышеописанному методу является метод пос-
№ 3, 2014
159
лойной абсорбции на объектах синтетической, например полистирола [8], и неорганической природы, например СаСО3 , с последующим ее растворением [12].
При этом удаление матрицы не приводит к изменению формы частиц, лишь несколько изменился их размер. Такие наносферы проявили себя перспективными системами доставки водорастворимых биологически активных соединений, таких как поли-Ь-лизин [8].
Еще одним методом явяляется метод коаксиальной электрораспылительной сушки, позволяющий получить гелеобразные композитные полисахардные частицы с высокой степенью загрузки. Изменение электрических потенциалов способствует регулированию изменения размера частиц (5-9 цм) [7].
Интересно, что полисахариды, включенные в структуру нано-структурных объектов, в некоторых случаях усиливают свою биологическую активность. Так, например, фукоидан в фукосферах проявляет большую антикоагулянтную активность, чем фукоидан в свободном виде той же концентрации. Возможно, это происходит вследствие того, что в растворе полисахарид может легко изменять конформацию, что, в свою очередь, приводит к изменению активности, в частности к снижению. В то время как в наноструктурах полисахарид имеет фиксированную конформацию, позволяющую более эффективно взаимодействовать с объектами, и соответственно увеличивать активность [3].
Кроме того, свободный фукоидан не оказывает влияния на свертываемость крови, в то время как фукоидан, находящийся в на-ночастинцах фукоидан-хитазан-хондроитинсульфата, приводит к увеличению свертываемости до 2-х раз, даже при низкой концентрации частиц [1].
При рассмотрении возможности взаимодействия лекарственных препаратов белкововой природы с наноструктурными матрицами можно выделить три способа:
1. Инкапсулирование - самый распространенный способ. Отличается «защитой» белковых структур от внешнего воздействия и возможностью доставки к месту всасывания. Так, например, полисахаридные микросферы, устойчивые при низких рН, сохраняют
белок от желудочного сока, но деградируют в щелочной среде, а именно в месте всасывания капсулируе-мого препарата - в тонком кишечнике.
2. Сшивание. Способ основан на электростатическом взаимодействии полисахарида и белковой молекулы, при этом последняя участвует в формировании стенок микрочастиц.
3. Адсорбция и хемосорбция. Осуществляется на поверхности полисахаридных микросфер за счет сил электростатической и/или химической природы.
В работе Sezer А. D. и Akbuga J. [11] была исследована эффективность инкапсулирования пептидных структур на примере БСА (бычьего сывороточного альбумина) с использованием фукосфер и микросфер на основе хитазана. Если сравнивать их инкапсулирующую эффективность, то у первых она выше, что было доказано с использованием офлоксацина.
Итак, целью нашего исследования являлась оптимизация биотехнологии выделения маннана из дрожжей и получение микросфер на основе маннана и фукоидана. Фукоидан был получен нами ранее.
Для эксперимента было использовано 4 вида дрожжей: пекарские дрожжи «Воронежские», пивные дрожжи, «живые» дрожжи и домашние. Каждый вид массой 4,5 грамма гомогенизировали, поместили в 4 колбы, прилили: 1,2 мл толуола, 3,5 мл этилового спирта, 50 мл дистиллированной воды. Полученный гомогенат встряхивали на шей-кере при температуре 50 °С, 1500 об/мин в течение 20 ч.
Автолизат центрифугировали. Надосадочную жидкость декантировали, осадок промыли дистиллированной водой. Объединили промывные воды с надосадочной жидкостью. К полученному раствору добавили концентрированную уксусную кислоту до конечной концентрации 1 н. Выделившуюся слизь промыли небольшим количеством разбавленной уксусной кислоты и отбросили. Раствор быстро нейтрализовали 6 н едким натром.
Чтобы осадить маннан, медленно при перемешивании, приливали этиловый спирт. Осадок отфильтровывали и дважды промывали спиртом. Неочищенное вещество растворяли в воде, бурый остаток от-
№3 , 2014
161
Таблица. СОДЕРЖАНИЕ МАННАНА В ДРОЖЖАХ
№ п/п Вид дрожжей Масса маннана, г Выход, %
1 Пивные дрожжи 0,0114 0,25
2 «Живые» дрожжи 0,0203 0,45
3 Домашние дрожжи - 0
4 Быстродействующие дрожжи 0,0192 0,43
Рисунок 1. Фукоидансодержащая матрица, полученная первым
способом.
деляли центрифугированием. Центрифугат подщелачивали 6 н едким натром и при перемешивании маленькими порциями добавляли реактив Фелинга, пока его избыток не обнаруживался по окрашиванию на-досадочного раствора. В результате образуется медный комплекс ман-
нана. Его после неоднократного промывания теплой водой, нагретой до 40 °С, суспендировали в дистиллированной воде.
Разлагали комплекс, медленно добавляя при механическом перемешивании 5 % соляную кислоту до ее избытка. Растворы выливали в 3-кратный объем 80 % этилового спирта при непрерывном перемешивании. Отфильтрованный полимер промывали этиловым спиртом и растворяли в дистиллированной воде, затем повторно проводили
Рисунок 2. Фукоидансодержащая матрица, полученная вторым
способом.
осаждение. В результате получили чистый маннан. После высушивания масса полученного полисахарида и выход продукта высчитывает-ся, что представлено в таблице.
На следующем этапе исследования получали липосомы, содержащие маннан и фукоидан.
№3 , 2014
163
Рисунок 3. Фукоидан- и маннансодержащая матрица, полученная
третьим способом.
Способ 1
0,0225 г фукоидана растворяют в 15 мл 2 % CH3COOH при 40-50 °С. Полученный раствор вносили в гексан (масляную фазу), содержащий 0,1 % SPAN, при перемешивании 600 об/мин при 60 °С через 1 ч вносили 4 мл 3 % лимонной кислоты по капле. Эмульсию перемешивали в течении 5 ч, центрифугировали при 1500 об/мин 2 мин.
Микросферы распределяли на фильтровальной бумаге, высушивали, выдерживали в холодильнике 2 дня, промывали хлороформом, хранили в эксикаторе при 4 °С (рис. 1).
Способ 2
Лимонную кислоту добавляли к 5 мл 2,7 % раствору фукоидана в 2 % СНХООН. Соотношение фукоидана: лимонная кис-
лота - 8 10-3 моль : 1 моль. Полученный раствор охлаждали до 0 °С, добавляли в 25 мл парафинового масла такой же температуры, перемешивали 2 мин. Добавляли 75 мл масла, нагревали до 120 °С. Смешивание осуществлялось в течение 40 мин при интенсивном перемешивании, микрочастицы центрифугируют, промывали диэтиловым эфиром, высушивали (рис. 2).
Способ 3
Полисахаридные микросферы были получены путём диспергирования водной эмульсии раствора фукоидана и маннана в гексане. Раствор CaCO3, фукоидана и маннана добавляли по каплям к 25 мл н-гексана, перемешивали со скоростью около 500 об/мин мешалкой в течение 30 мин. Затем по каплям добавляли 1 мл уксусной кислоты и 0,25 мл SPAN, перемешивание продолжалось в течение 1-2 мин. Добавляли 10 мл воды и перемешивание продолжали ещё 1-2 мин (рис. 3).
Итак, в результате проведенного исследования получены новые фукоидан- и маннансодержащие препараты, которые могут выполнять роль матриц для включения лекарственных веществ.
библиографический список
1. Бородина Т. Н. и др. Полиэлектролитные микрокапсулы как системы доставки биологически активных веществ // Биомедицинская химия. 2007. Т. 53. № 5. С. 557-565.
2. Денисова Е. В., Супрунчук В. Е., Пилипенко М. А., Кораблино-ва Н. В., Фофанова Д. Ю. Разработка матриц для медицинских препаратов на основе полисахаридов бурых водорослей // Материалы III Международной научно-практической конференции «Фундаментальная наука и технологии - перспективные разработки» (24-25 апреля 2014 г.). North Charleston, USA. Т. 1. С. 47-54.
3. Chen M. C. et al. The characteristics, biodistribution and bioavailability of a chitosan-based nanoparticulate system for the oral delivery of heparin // Biomaterials. 2009. V. 30 (34). P. 66296637.
4. Feijen J. Crosslinking protein and polysaccharide in an emulsion to form microspheres for drug delivery: пат. 5041292 США. 1991.
№ 3, 2014
165
5. Lee J. S. et al. Fabrication of electrospun biocomposites comprising polycaprolactone/fucoidan for tissue regeneration // Carbohydrate polymers. 2012. V. 90 (1). P. 181-188.
6. Martins S. et al. Insulin-loaded alginate microspheres for oral delivery-effect of polysaccharide reinforcement on physicochemical properties and release profile // Carbohydrate Polymers. 2007. V. 69 (4). P. 725-731.
7. Park S., Hwang S., Lee J. pH-responsive hydrogels from moldable composite microparticles prepared by coaxial electro-spray drying // Chemical Engineering Journal. 2011. V. 169 (1). P. 348-357
8. Pinheiro A. C. et al. Chitosan / fucoidan multilayer nanocapsules as a vehicle for controlled release of bioactive compounds // Carbohydrate polymers. 2015. V. 115. P. 1-9.
9. Reddy L. C. N. et al. Development of Polymeric Blend Microspheres from Chitosan-Hydroxypropylmethyl Cellulose for Controlled Release of an Anti-Cancer Drug // Journal of the Korean Chemical Society. 2013. V. 57 (4).
10. Sezer A. D., Akbuga J. Fucosphere-new microsphere carriers for peptide and protein delivery: Preparation and in vitro characterization // Journal of microencapsulation. 2006. V. 23 (5). P. 513-522.
11. Sezer A. D., Akbuga J. The design of biodegradable ofloxacin-based core-shell microspheres: Influence of the formulation parameters on in vitro characterization // Pharmaceutical development and technology. 2012. V. 17 (1). P. 118-124.
12. Silva L. C. et al. Preparation and characterization of polysaccharide-based nanoparticles with anticoagulant activity // International journal of nanomedicine. 2012. V. 7. P. 2975.
ОБ АВТОРАХ
Денисова Евгения Владимировна, кандидат биологических наук, доцент кафедры медицинской биохимии, клинической лабораторной диагностики и фармации Северо-Кавказского федерального университета. Телефон: 8 (8652) 35-50-68. E-mail: [email protected]
Бегдай Инна Владимировна, кандидат технических наук, доцент, зам. директора по научной работе Северо-Кавказского федерального университета. Телефон: 8 (8652) 35-43-53. Email: [email protected]
Андрусенко Светлана Федоровна, кандидат биологических наук, доцент кафедры медицинской биохимии, клинической лабораторной диагностики и фармации Северо-Кавказского федерального университета. Телефон: 8 (8652) 35-50-68. Email: [email protected]
Супрунчук Виктория Евгеньевна, инженер-лаборант кафедры медицинской биохимии, клинической лабораторной диагностики и фармации Северо-Кавказского федерального университета. Телефон: 8 (8652) 35-50-68. E-mail: vikasuprunchuk@ gmail.ru
Кораблинова Наталья Владимировна, студент группы МБС-092 (1) 6 курса Института живых систем Северо-Кавказского федерального университета. Телефон: (8652) 35-50-68. Фофанова Дарья Юрьевна, студент группы МБС-091 (2) 6 курса Института живых систем Северо-Кавказского федерального университета. Телефон: 8 (8652) 35-50-68.
Denisova Evgenija Vladimirovna, the candidate of biological sciences, the associate professor of department of the medical biochemistry, clinical laboratory diagnostics and pharmacy North Caucasus Federal University. Phone: (8652) 35-50-68. E-mail: [email protected]
Begday Inna Vladimirovna, the candidate of technical sciences, the associate professor, deputy director for scientific activities North Caucasus Federal University. Phone: (8652) 35-43-53. Email: [email protected]
Andrusenko Svetlana Fedorovna, the candidate of biological sciences, the associate professor of the Department of the medical biochemistry, clinical laboratory diagnostics and pharmacy North Caucasus Federal University. Phone: 8 (8652) 35-50-68. E-mail: [email protected]
Suprunchuk Viktoria Evgen'evna, engineer of the Department of the medical biochemistry, clinical laboratory diagnostics and pharmacy North Caucasus Federal University. Phone: 8 (8652) 3550-68. E-mail: [email protected].
Korablinova Natal'ja Vladimirovna, student of group MBS-092 (1) 6 course Institute of live systems North Caucasus Federal University. Telephone: 8 (8652) 35-50-68.
Fofanova Dar'ja Jur'evna, student of group MBS-091 (2) 6 course Institute of live systems North Caucasus Federal University. Telephone: (8652) 35-50-68.
