CC BY
42
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
НАУКА. ИННОВАЦИИ. ТЕХНОЛОГИИ, №2, 2017
удк 615.322 Супрунчук В.Е. [Suprunchuk V.E.], Денисова Е.В. [Denisova E.V.]
БЕЛОК-ПОЛИСАХАРИДНЫЕ МИКРОКАПСУЛЫ, СФОРМИРОВАННЫЕ НА МАТРИЦАХ РАЗЛИЧНОЙ ПРИРОДЫ
Protein-polysaccharide microcapsules formed on matrices of different structures
В данной работе рассматривается возможность формирования микрокапсул путем послойной адсорбции биополиэлектролитов на ядрах неорганической (частицы СаСОз) и полимерной природы (полистирольные частицы). Нами была осуществлена оценка размеров полученных микрокапсул, их форма, количественный выход. В качестве высокомолекулярного полианиона был использован фукоидан (F), в качестве высокомолекулярного поликатиона - бычий сывороточный альбумин (БСА). Удаление ядер осуществлялось путем понижения рН системы до 4, в случае карбонатной матрицы, или вымыванием с помощью тетрагидрофурана, в случае полистирольных носителей. Установлено, что природа матрицы, используемой для формирования микрокапсул, влияет на степень включения белка и выход полиэлектролитных частиц.
In this paper we consider the possibility of forming microcapsules by layer-by-layer adsorption of polymers on inorganic cores and polymeric nature. Removal of the carbonate cores were performed by lowering the pH of the system to 4.5. Removal of the polypropylene matrix were carried out using tetrahydrofuran in the case of polystyrene media. It is established that the nature of the matrix used for the formation of microcapsules, affect the degree of incorporation of protein and the yield of polyelectrolyte particles.
Ключевые слова: послойная адсорбция, фукоидан, БСА, микрокапсулы. Keywords: layer by layer adsorption, fucoidan, BSA, microcapsule.
Введение
На сегодняшний день в фармацевтической промышленности все более актуальной стоит проблема разработки новых технологий для создания препаратов с заданными свойствами в целях повышения эффективности их действия и снижения побочных эффектов. Одним из перспективных и популярных методов разработки является метод микрокапсу-лирования.
Микрокапсулирование позволяет усилить терапевтический эффект, улучшить фармокинетический профиль, увеличить биодоступность, и одновременно, снизить побочное действие фармацевтических средств, а так же повысить химическую и конформационную стабильность.
В качестве материала для формирования микрокапсул используют синтетические (полиакрилаты, полидиоксаноны, поликапролактоны) или
природные полимеры (липиды, белки, полисахариды), либо их сочетание. Физико-химические характеристики создаваемых микрокапсул (размер, стабильность, количество слоев) зависят от ряда факторов, в том числе рН среды, ПАВ, температуры и т. д.
Интерес к природным полимерам обусловлен тем, что они не токсичны, не вызывают аллергических реакций, продукты их распада не накапливаются в организме и могут выводиться из него или участвовать в дальнейшем метаболизме. Биополимеры эффективно взаимодействуют с клетками, что способствует повышению продуктивности их действия. Кроме того, полиэлектролиты природного происхождения обладают реакционно-способными функциональными группами, легко вступающими в химические реакции.
Фукоидан - сульфатированный гетерополисахарид, выделяемый из бурых водорослей, широко распространенных в морях приполярных и умеренных широт. Фукоидан обладает рядом важных характеристик. Во-первых, распространённость и доступность источника полисахарида. Данный полисахарид выделяют из бурых водорослей широко распространенных в морях приполярных и умеренных широт. Во-вторых, обладает широким спектром биологической активности и является антикоагулятным [12], противоопухолевым, им-муномодулирующим [6], антибактериальным, противовирусным [2], противовоспалительным [10] агентам. Ряд научных исследований [15; 11; 5] показали, что полисахарид индуцирует апоптоз, и ингибирует ангиогенез, метастази-рование и инвазию различных раковых клеток, т.е. является мощным ангиогенным и противораковым агентом, перспективным для терапии раковых заболеваний. 336]. Так при действии фукоидана отмечается значительное снижение in vitro жизнеспособности клеток меланомы В16 и карциномы легких, ингибирование их роста.
Но в тоже время, с точки зрения физики растворов, фукоидан имеет способность к гелеобразованию, самоорганизации, может выполнять роль стабилизатора и эмульгатора.
С более глубоким изучением свойств фукоидана, расширяются и области его применения. Можно выделит такие направления как терапия инфекционных заболеваний, терапия диабетической ретинопатии и др.
Микрокапсулы, сформированные с применением фукоидана, могут быть использованы для доставки биологически активных веществ. Также высока вероятность повышения биологической активности самого полисахарида, в связи с тем, что в растворе он находится в свободном состоянии и
может легко изменять свою конформацию, в то время как в микрокапсулах структура фиксирована, и может способствовать более эффективному взаимодействию с изучаемыми объектами [9].
Существует множество работ, направленных на изучение условий формирования комплексов белок/полисахарид [3, 9, 16], и лишь небольшое их число исследуют БСА/фукоидановые коньюгаты [7, 8]. Движущей силой образования полиэлектролитных комплексов белок/полисахарид является электростатическое взаимодействие между противоположно заряженными биополимерами. Полнота образования комплексов, их растворимость зависит от рН, ионной силы среды, соотношения белок/полисахарид [6]. Микроструктурные объекты с применением фукоидана могут быть использованы для доставки различных веществ, с малым количеством ограничений в отношении их химической природы, свойств и размера молекул, что дает уникальную возможность для решения многих медицинских проблем.
В данной работе рассматривается возможность формирования микрокапсул путем послойной адсорбции биополиэлектролитов на носителях неорганической и полимерной природы, осуществляется оценка размеров полученных микрокапсул, форма, количественных выход образуемых частиц. В качестве высокомолекулярного полианиона использовали фукоидан, поликатиона - бычий сывороточный альбумин (БСА), матрицами выступали микрочастицы СаС03 и полистирола.
Материалы исследования
Получение полиэлектролитных микрокапсул осуществлялось по известной методике [13] путем смешивания равных объемов суспензии СаС03 (0,5 %) (I) или полистирольных частиц (0,5 %) (II) и БСА (1 мг/л) при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Через 15 мин вносили такой же объем 1,5% раствора фукоидана (F) в фосфатном буфере (рН 7,4), перемешивали 15 мин при комнатной температуре. Каждое нанесение повторяли 5 раз. Центрифугировали (3,500 х g, 30 мин), промывали дистиллированной водой. Затем микрокапсулы обрабатывали 0,1 М НС1 для удаления ядра, доводя рН до 4. Микрокапсулы II дополнительно обрабатывали ТГФ в течение 12 ч. После чего оба образца центрифугировали (3,500 х g, 30 min) и промывали.
Размер полученных микрокапсул оценивали методом динамического рассеяния света на спектрометре PHOTOCOR COMPLEX (ООО «Антек-97», Россия) с применением программного обеспечения FAST Version 2.8.3. (Alango Ltd.). Программное обеспечение осуществляет расчет по формуле Стокса-Эйнштейна, что позволяет получить оптимальное распределение по размерам микрочастиц. Для рассмотрения возможности изменения диаметра микрокапсул после удаления матрицы осуществляли измерение размера частиц до и после удаления ядра.
Степень включения белка (СВБ) и выхода полученных микрочастиц (ВМ) рассчитывали по формулам, количественное содержание белка определяли спектрофотометрически по методу Бредфорд:
СВБ = ml_m2/mi х 100%,
где mi - исходная масса белка, т2 - масса невключенного белка.
ВМ рассчитывали в процентах от массы использованных для их формирования полимеров:
BM = m2/ml х 100%,
где mi - исходная масса полимеров в растворе, т2 - масса микрочастиц, не содержащих ядра.
Визуализация микрочастиц проводилась с помощью оптического микроскопа Motic.
Обсуждение результатов
Используемый в работе полисахарид является слабым полиэлектролитом и степень его диссоциации сильно зависит от рН среды. Известно, что раствор фукоидана имеет максимальный отрицательный заряд при рН 7, поэтому готовили раствор полисахарида с соответствующим рН.
Получение полиэлектролитных микрокапсул осуществляли путем последовательной адсорбции отрицательно заряженного F и положительно заряженного БСА на карбонатных и полистирольных микрочастицах. В связи с тем, что поверхность карбонатных матриц имеет положительный заряд [1], а полистирольных - отрицательный [14], то первым слоем наносился БСА при рН 7,4, а затем F с образованием полиэлектролитного комплекса. Последовательное нанесение повторяли до достижения необходимого количества слоев. Удаление ядра из микрокапсул образованных на СаС03-матрице осуществляли с помощью 0,1 М НС1, благодаря чему, помимо растворения ядра, осуществляли понижение рН системы до 4, что приводило к формированию более плотного комплекса F/БСА. Так постепенное понижение рН системы приводит сперва к взаимодействию аминогрупп белка и боковых цепей фукоидана с образованием растворимого комплекса белок/полисахарид, дальнейшее понижение рН приводит к нейтролизации заряда и образуется нерастворимый комплекс. При достижении рН 4 осуществляется уплотнение структуры комплекса за счет максимального взаимодействия белок-полисахарид [4]. Полистирольное ядро удаляли с помощью путем обработки полученных частиц ТГФ.
Полученные микрокапсулы и микрочастицы имели форму близкую к сферической. Удаление ядра привело к изменению размера многослойных
100 рм
100 ^м
Рис. 1. а) микрокапсулы, сформированные на карбонатной матри-
це (микрокапсулы I);
б) микрокапсулы, сформированные на полистирольной матрице (микрокапсулы II)
частиц (рис. 1). Так размер микрочастиц, сформированных на полистирольных матрицах, до удаления ядра находился в пределах 3,65 ± 0,8 цм, а диаметр микрокапсул составил 2,79 ± 0,5 цм. При использовании карбонатной матрицы до и после удаления ядра диаметр полученных многослойных
70 60
50 40
30
20
СВБ
Рис. 2.
Степень включения белка (СВБ) и выход микрокапсул (ВМ) при использовании матриц разной природы.
о
мшсрокапсул существенно не изменился и составил 4,10 ± 0,9 цм и 3,98 ± 0,6 цм.
Определение СВБ белка осуществляли спектрофотометрически по методу Бредфорда. Выход полиэлектролитного комплекса определяли весовым методом.
Установлено, что на выход многослойных микрокапсул влияет природа матрицы, используемой для их формирования. Так микрокапсулы, сформированные методом послойной адсорбции на карбонатной матрице имели больший выход (47,73 ± 0,33 %), чем микрокапсулы, сформированные на матрице полистирольной природы (38,26 ± 0,13 %).
Степень включения белка так же имеет зависимость от вида носителя. Применение СаС03-матрицы привело к более эффективному включению белка и составило 73,33 ± 0,43 %. Наблюдаемое увеличение выхода микрокапсул, сформированных на карбонатной матрице, а также более высокая степень включения белка может быть связана с пористостью поверхности карбонатных частиц и связанными с ней сорбционными процессами.
Выводы
В результате работы были сформированы многослойные микрокапсулы на основе природных полимеров (БСА/Б) с применением матриц неорганической и органической природы. Полученные микрокапсулы
имели форму близкую к сферической, с изменяющимся размером до и после удаления ядра, что было доказано с помощью метода динамического рассеяния света.
Кроме того были изучены количественный выход микрокапсул, а так же степень включения белка. Установлено, что на рассматриваемые параметры существенное влияние оказывает природа матрицы, применимой для формирования микрокапсул, что может быть связано с пористостью поверхности ядер неорганической природы, и связанными с ней сорбционными процессами.
Библиографический список
1. Berth G. et al. Polyelectrolyte complexes and layer-by-layer capsules from chitosan/chitosan sulfate // Biomacromolecules. 2002. T. 3. №3. C. 579-590.
2. Bilan M.I. et al. Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens C. Ag // Carbohydrate research. 2002. T. 337. №8. C. 719-730.
3. Chen M.C. et al. The characteristics, biodistribution and bioavailability of a chitosan-based nanoparticulate system for the oral delivery of heparin // Biomaterials. 2009. T. 30, №34. C. 6629-6637.
4. De Souza C.J.F. et al. Polymeric complexes obtained from the interaction of bovine serum albumin and к-carrageenan // Food Hydro-colloids. 2015. T. 45. C. 286-290.
5. Kalimuthu S., Kim S.K. Fucoidan, a sulfated polysaccharides from brown algae as therapeutic target for cancer // Handbook of Anticancer Drugs from Marine Origin. Springer International Publishing, 2015. C. 145-164.
6. Khil'chenko S.R. et al. Immunostimulatory activity of fucoidan from the brown alga Fucus evanescens: role of sulfates and acetates // Journal of Carbohydrate Chemistry. 2011. T. 30. №4-6. C. 291305.
7. Kim D.Y., Shin W.S. Characterisation of bovine serum albumin-fu-coidan conjugates prepared via the Maillard reaction // Food chemistry. 2015. T. 173. C. 1-6.
8. Kim D.Y., Shin W.S. Functional improvements in bovine serum albumin-fucoidan conjugate through the Maillard reaction //Food chemistry. 2016. T. 190. C. 974-981.
9. Kim D.Y., Shin W.S. Unique characteristics of self-assembly of bovine serum albumin and fucoidan, an anionic sulfated polysaccharide, under various aqueous environments // Food Hydrocolloids. 2015. T. 44. C. 471-477.
10. Lee S.H. et al. Anti-inflammatory effect of fucoidan extracted from Ecklonia cava in zebrafish model // Carbohydrate polymers. 2013. T. 92. №1. C. 84-89.
11. Marudhupandi T. et al. In vitro anticancer activity of fucoidan from Turbinaria conoides against A549 cell lines // International journal of biological macromolecules. 2015. T. 72. C. 919-923.
12. Nagumo T., Nishino T. Fucan sulfates and their anticoagulant activities // Polysaccharides in medicinal applications. 1996. C. 545-574.
13. Pa§calau V. et al. Curcumin delivered through bovine serum albu-min/polysaccharides multilayered microcapsules // Journal of biomaterials applications. 2016. T. 30, №6. C. 857-872.
14. Pinheiro A.C. et al. Chitosan / fucoidan multilayer nanocapsules as a vehicle for controlled release of bioactive compounds // Carbohydrate polymers. 2015. T. 115. C. 1-9.
15. Senthilkumar K. et al. Brown seaweed fucoidan: biological activity and apoptosis, growth signaling mechanism in cancer// International journal of biological macromolecules. 2013. T. 60. C. 366-374.
16. Xia S. et al. Probing conformational change of bovine serum albu-min-dextran conjugates under controlled dry heating // Journal of agricultural and food chemistry. 2015. T. 63. №16. C. 4080-4086.
