Научная статья на тему 'РАЗРАБОТКА МЕТОДИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ К СОЗДАНИЮ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИНЕЙНЫХ β- (1→3)-ГЛЮКАНОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ В ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ'

РАЗРАБОТКА МЕТОДИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ К СОЗДАНИЮ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИНЕЙНЫХ β- (1→3)-ГЛЮКАНОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ В ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
286
50
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Иммунология
Scopus
ВАК
CAS
RSCI
Ключевые слова
БЕТА-ГЛЮКАНЫ / ГРИБЫ / ПОЛИСАХАРИДЫ / ОКРУЖАЮЩАЯ СРЕДА / β-(1→3)-НОНАГЛЮКОЗИД / КОНЪЮГАТ БСА / ПОЛИКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА / ИММУНОФЕРМЕНТНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОЛИГОГЛЮКАНОВ / BETA-GLUCANS / FUNGI / POLYSACCHARIDES / ENVIRONMENT / β-(1→3) NONAGLUCOSID / BSA CONJUGATE / POLYCLONAL ANTIBODIES / ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT DETECTION OF OLIGOGLUCAN

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Ахапкина Ирина Гавриловна, Желтикова Т. М., Антропова А. Б., Михайлова Н. А., Яшунский Д. В.

Микогенные полисахариды окружающей среды активно влияют на иммунную систему человека, причем часто результат взаимодействия зависит от концентрации полисахаридов. С целью создания тест-системы для иммуноферментного определения концентрации линейных бета-глюканов и их производных в окружающей среде разработан набор реагентов. Для этого были синтезированы β-(1→3)-нонаглюкозид (G9) фрагмент линейного β-(1→3)-глюкана, конъюгаты G9 с бычьим сывороточным альбумином (БСА) и полиакриламидом (АА). Конъюгат олигосахарида с БСА был использован в качестве иммуногена и покровного антигена. Получены высокоактивные специфические поликлональные антисыворотки. Разработан одностадийный способ исключения из иммунохимических реакций антител против белка-носителя БСА. Использование полученных антисывороток в ингибиторном твердофазном иммуноферментном анализе позволило выявлять G9 в пределах от 1 до 50 мкг/мл.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Ахапкина Ирина Гавриловна, Желтикова Т. М., Антропова А. Б., Михайлова Н. А., Яшунский Д. В.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Development of methodical approaches to creation of reagents for enzyme-linked immunosorbent detection of linear β- (1→3) - glucans and their derivatives in the environment

Environmental fungal polysaccharides actively influence human immune system, and the result often depends on polysaccharides concentration. The set of reagents was developed to create the test system for enzyme-linked immunosorbent determination of linear beta glucans and their derivatives in the environment. β-(1→3) nonaglucosid (G9) a fragment of linear β-(1→3) glucan, G9 conjugates with the bovine serum albumin (BSA) and polyacrylamide (AA) were synthesized. The conjugate of oligosaccharide with BSA was used as immunogen and coating antigen. Highly active specific polyclonal antisera were received, at the same time the single-stage way of anti-BSA antibodies elimination was developed. Received antisera allowed to reveal G9 ranging from 1 to 50 mkg/ml by inhibitory solid-phase enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Текст научной работы на тему «РАЗРАБОТКА МЕТОДИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ К СОЗДАНИЮ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИНЕЙНЫХ β- (1→3)-ГЛЮКАНОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ В ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ»

БИОТЕХНОЛОГИЯ И ВАКЦИНЫ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 614.7-078.33

Ахапкина И.Г.1, Желтикова Т.М.1, Антропова А.Б.1, Михайлова НА.1, Яшунский Д.В.2, Карелин А.А.2, Хатунцева Е.А.2, Цветков Ю.Е.2, Нифантьев Н.Э.2

РАЗРАБОТКА МЕТОДИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ К СОЗДАНИЮ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИНЕЙНЫХ р-(1^3)-ГЛЮКАНОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ В ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ

1ФГБУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, 105064, Москва; 2Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, 119991, Москва

Микогенные полисахариды окружающей среды активно влияют на иммунную систему человека, причем часто результат взаимодействия зависит от концентрации полисахаридов. С целью создания тест-системы для им-муноферментного определения концентрации линейных бета-глюканов и их производных в окружающей среде разработан набор реагентов. Для этого были синтезированы р-(1^-3)-нонаглюкозид (G9) - фрагмент линейного Р-(1^3)-глюкана, конъюгаты G9 с бычьим сывороточным альбумином (БСА) и полиакриламидом (АА). Конъюгат олигосахарида с БСА был использован в качестве иммуногена и покровного антигена. Получены высокоактивные специфические поликлональные антисыворотки. Разработан одностадийный способ исключения из иммунохими-ческих реакций антител против белка-носителя - БСА. Использование полученных антисывороток в ингибиторном твердофазном иммуноферментном анализе позволило выявлять G9 в пределах от 1 до 50 мкг/мл.

Ключевые слова: бета-гяюканы; грибы, полисахариды; окружающая среда; [¡-(1^3)-нонагяюкозид; конъюгат БСА; поликлональные антитела; иммуноферментное определение олигоглюканов.

Для цитирования: Иммунология. 2015; 36 (5): 276-279.

Akhapkina I.G.1, Zheltikova T.M.1, Antropova A.B.1, Mikhailova N.A.1, Yashunskiy D.V.2, Karelin A.A.2, Hatuntseva E.A.2, Tsvetkov Yu.E.2, Nifantiev N.E.2

DEVELOPMENT OF METHODICAL APPROACHES TO CREATION OF REAGENTS FOR ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT DETECTION OF LINEAR B-(1^3) - GLUCANS AND THEIR DERIVATIVES IN THE ENVIRONMENT

Tederal State Budgetary Institution Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera of the Russian Academy of Medical Science, Moscow; ^N.D. Zelinsky Institute of Organic Chemistry of the Russian Academy of Sciences, 119991, Moscow

Environmental fungal polysaccharides actively influence human immune system, and the result often depends on polysaccharides concentration. The set of reagents was developed to create the test system for enzyme-linked immunosorbent determination of linear beta glucans and their derivatives in the environment. fi-(1^-3) - nonaglucosid (G9) - a fragment of linear^-(1^3) - glucan, G9 conjugates with the bovine serum albumin (BSA) and polyacrylamide (AA) were synthesized. The conjugate of oligosaccharide with BSA was used as immunogen and coating antigen. Highly active specific polyclonal antisera were received, at the same time the single-stage way of anti-BSA antibodies elimination was developed. Received antisera allowed to reveal G9 ranging from 1 to 50 mkg/ml by inhibitory solid-phase enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Keywords: beta-glucans; fungi; polysaccharides; environment, fi-(1^-3) - nonaglucosid; BSA conjugate; polyclonal antibodies; enzyme-linked immunosorbent detection of oligoglucan.

Citation: Immunologiya. 2015; 36 (5): 276-279.

Полисахаридные соединения, такие как хитин, маннан, линейные и разветвленные тюканы и др. входят в состав клеточных стенок грибов (дрожжей и мицелиальных), водорослей, членистоногих (клещи домашней пыли, тараканы) и других микроорганизмов. В настоящее время, очевидно, источником основной массы полисахаридных соединений в домашней пыли являются грибы, которые постоянно заносятся в помещение воздушным путем, а также на одежде, шерсти животных и т.д. Попадая в благоприятные условия (влажность более 70% и температура около 20оС) грибы активно развиваются, причем на любой поверхности (пи-

Для корреспонденции: Ахапкина Ирина Гавриловна, isun17@yandex. ru

For correspondence: Akhapkina Irina Gavrilovna, isun17@ yandex.ru

щевые продукты, обои, материалы стен зданий). Например, существует группа заболеваний, объединяемых под общим названием "синдром больных зданий" - "Sick building syndrome", от которых страдают люди, длительное время находящиеся в помещениях, зараженных плесневыми грибами [1]. Известно также, что присутствие микроскопических грибов и их метаболитов в непосредственном окружении человека может способствовать развитию различных патологий: микозов, токсикозов, аллергозов [2-5]. Важной представляется гипотеза о том, что грибы могут играть роль неспецифических иммунных триггеров при развитии аллергических заболеваний и усиливать иммунный ответ на другие аллергены, в частности, клещевые [3]. Полагают, что существенную роль в патогенезе этих заболеваний играют и полисахаридные комплексы микромицетов [6]. Так, полисахариды микогенной природы, с одной стороны, имеют свойства мощных иммуномодуляторов, а с другой - могут об-

ладать пирогенными свойствами, вызывая воспалительные реакции в организме человека [7-11]. Сложность трактовки имеющихся данных о зависимости концентрации действующего вещества на конечный эффект и, соответственно, развитие определенных иммунологических реакций организма человека заключается в отсутствии единообразия в используемых методах анализа, тем более, что существующие тест-наборы предназначены для определения концентрации пирогенных соединений в лекарственных препаратах. Например, "Lal-тест" позволяет определять концентрацию эндотоксина (липополисахарид грамотрицательных бактерий) и частично глюканов. Тест-набор "Glucatell" позволяет определять бета-глюканы. Однако это колориметрический метод, поэтому его сложно адаптировать к использованию мониторинга образцов пыли помещений, где в значительной мере скапливаются полисахаридные соединения, поскольку в пыли часто присутствуют пигментные вещества тех же грибов или бактерий, либо текстильные красители. На наш взгляд, более удобным и эффективным способом определения концентрации глюканов в пыли помещений может быть иммуноферментный метод, основанный на использовании синтетического олигосахаридного антигена - аналога мико-генного бета- (1-3)-глюкана.

В связи с вышесказанным цель настоящего исследования - разработка набора реагентов иммуноферментного определения линейных производных ß-(1—3)-глюканов плесневых и дрожжевых грибов в окружающей среде с использованием синтетического линейного ß-(1—3)-нонаглюкозида и его конъюгатов с БСА и АА.

Материал и методы

Получение р-(1^3)-нонаглюкозида. G9 (рис. 1) был получен в лаборатории химии гликоконъюгатов Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН. Его синтез будет опубликован отдельно.

Получение конъюгата G9 с БСА (G9-BCA) скваратным методом [12-13]. К раствору 10 мг (6,5 мкмоль) аминопро-пилгликозида G9 в 2 мл 50% водного этанола прибавляли 1,16 мкл (7,8 мкмоль) диэтилскварата и 1 мкл (7,0 мкмоль) триэтиламина. Через 2 часа реакционную смесь упаривали. Остаток растворяли в 2 мл воды и наносили на патрон Sep-Pak С-18, промывали 10 мл воды, затем продукт элюировали градиентом метанола в воде (3%—>18%). Элюат упаривали, остаток лиофилизовали из воды и получили 9,0 мг аддукта (83%).

Раствор 9,0 мг (5,4 мкмоль) аддукта и 18 мг (0,27 мкмоль) БСА в 2 мл буферного раствора (0,35М KHCO3 и 0,07М Na2B407; pH = 9) выдерживали 4 сут при комнатной температуре. Раствор подвергали гель-хроматографии на колонке с Сефадексом G-15 в воде; фракции, содержащие конъюгат, объединяли и лиофилизовали. Получили 16,9 мг (77%) ко-ньюгата G9-БСА. В масс-спектре MALDI-TOF полученного продукта присутствовал широкий пик с максимумом при miz 81500, что соответствует включению в конъюгат в среднем 10 остатков нонаглюкозида на молекулу белка.

Получение конъюгата G9 с АА ^9-АА). К раствору 4,4 мг (22,8 мкмоль) поли (п-нитрофенил)акрилата [14] в 250 мкл диметилформамида прибавляли раствор 7,0 мг (4,6 мкмоль) G9 в 400 мкл диметилсульфоксида и 20 мкл триэтиламина. Полученный раствор перемешивали при температуре 40-45°С, контролируя вступление в реакцию G9 методом ТСХ в системе этанол - бутанол - 1 М HCl (5:5:2). После поглощения всего олигосахарида (20-24 часа) к реакционной смеси прибавляли 18 мкл (9,1 мкмоль) 5%-ного (по объему) раствора н-бутиламина в диметилформамиде и смесь перемешивали при температуре 40-45oC следующие 24 часа. Затем прибавляли 15 мкл 2-аминоэтанола и продолжали перемешивание и нагревание еще 24 часа. Растворители упаривали в вакууме масляного насоса (~1 мбар) при нагревании до температуры 50-55oC, остаток хроматографировали на колонке с Сефадексом LH-20 в 50%-ном водном ацетонитриле. Фракции, содержащие конъюгат G9-АА, объединяли, упа-

Рис. 1. Структура G9.

ривали и остаток лиофилизовали из воды. Получили 9,0 мг (95%) конъюгата G9-AA в виде аморфного порошка.

Сапонин QS - сапонин из коры квиллайи мыльной («Sigma").

Сапонин А - производное квиллайевой кислоты, выделенное из корней Acanthophyllum gypsophiloides Regel [15].

Получение специфических кроличьих антисывороток. Для получения специфичных поликлональных антисывороток (ПС) использовали кроликов (самцов) породы шиншилла массой 2,5±0,3 кг Перед началом иммунизации животных выдерживали в карантине в течение 2 нед, после чего у животных брали кровь для использования в дальнейшем в качестве отрицательного контроля. Иммунизацию проводили подкожно. Для первой иммунизации использовали 1,6 мг G9-BCAs присутствии 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда ("Sigma") или сапонина QS, или сапонина А. Также проводили иммунизацию без введения адъюванта. Следующие иммунизации проводили в течение 5 мес через каждые 28 дней в дозе 1 мг G9^CA. Кровь у животных забирали через 10 суток после каждой иммунизации из краевой вены уха, в стерильные пробирки. Инкубировали 1 ч в термостате при 37oC, затем на 1 ч при температуре 40С. После образования сгустка кровь центрифугировали 10 мин со скоростью

2 тыс. об/мин. ПС отбирали и разливали по 50 мкл в микропробирки, хранили при температуре 70oc.

Определение специфической активности ПС проводили методом обратного твердофазного иммунофермент-ного анализа (ИФА). В каждые две параллельные лунки 96-луночного планшета («Costar") помещали в карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,4 (КББ) последовательно 100 мкл G9-BCA с концентраций 1 мкг/мл, 100 мкл БСА (10 мкг/мл), 100 мкл КББ. Инкубировали 1 час при 370C, затем ночь при температуре 40C. Жидкость удаляли, промывали в фосфатно-солевом буфере в присутствии Tween-20 рН 7,2 (ФСБ). Прибавляли по 100 мкл ПС в разведении 1:1000 в ФСБ. Инкубировали 40 мин при 370C, удаляли жидкость из лунок, промывали ФСБ 3 раза. Прибавляли антивидовые антитела против IgG (H±L) кролика, меченные пероксидазой хрена (конъюгат) (РАМН, предприятие по производству бак-препаратов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи), в разведении 1:2000. Инкубировали 30 мин при 370C. Жидкость удаляли, промывали ФСБ 3 раза, затем дистиллированной водой 2 раза. Прибавляли субстрат - 3,3', 5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ) (ООО НПО "БиоТестСистемы", Россия). Через 3-5 мин реакцию останавливали прибавлением 100 мкл 0,5% раствора серной кислоты. Определяли оптическую плотность (ОП) растворов при длине волны 450 нм.

Истощение ПС относительно антител против БСА в объеме. Для этого к 100 мкл ПС прибавляли 100 мкл БСА с конечной концентрацией 1 мг/мл и 10 мг/мл. Инкубировали 1 ч при 370C. Полученную таким образом ПС хранили при температуре 200C.

Истощение ПС относительно антител против БСА при помощи глутарового альдегида (ГА). Для этого к 2,5% раствору ГА в воде прибавляли БСА до конечной концентрации 50 мг/мл, перемешивали до образования геля. Затем

3 ч инкубировали при 20°С. Полученный гель измельчали, промывали водой, затем 0,2 М фосфатным буфером рН 7,4, затем 0,1 М буфером глицин-НС1 рН 3,2, затем фосфатным буфером рН 7,4. После центрифугирования к 0,8 мл сорбента прибавляли 0,8 мл ПС. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. Надосадочную жидкость - фракцию, истощенную относительно антител против БСА,- отби-

рали и хранили при температуре 20oC.

Обогащение ПС относительно иммуноглобулинов класса G на ДЭАЭ-целлюлозе проводили следующим образом: 5 мл ДЭАЭ-целлюлозы, уравновешивали 0,5 М фосфатным буфером (рН 7,0). 2 мл ПС диализовали против того же буфера в течение 36 ч при 4oC. Далее весь объем ПС наносили на ДЭАЭ-целлюлозу, перемешивая 30 мин при комнатной температуре. Затем центрифугировали 15 мин со скоростью 1 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость, представлявшую собой обогащенную IgG-антителами фракцию отбирали и хранили при температуре 20oC.

Построение калибровочной кривой при помощи ИФА ингибиторным способом. Для этого в параллельные лунки 96-ти луночного планшета вносили по 100 мкл G9-BCA в КББ (концентрация 1 мкг/мл) или 100 мкл G9-AA в КББ (концентрация 1 мкг/мл). Инкубировали 1 ч при 37oC, затем 16 ч при 4oC. Жидкость удаляли, промывали ФСБ. В соответствующие лунки вносили по 50 мкл кратных разведений G9 в ФСБ (100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125; 1,56; 0 мкг/мл). Прибавляли ИПС в разведении 1:500 в ФСБ. Инкубировали 40 мин при 37°С, удаляли жидкость из лунок, промывали ФСБ 3 раза. Прибавляли конъюгат в разведении 1:2000. Инкубировали 30 мин при 37oC. Жидкость удаляли, промывали ФСБ 3 раза, затем дистиллированной водой 2 раза. Прибавляли ТМБ. Через 3-5 мин реакцию останавливали прибавлением 100 мкл 0,5% раствора серной кислоты. Определяли ОП растворов при длине волны 450 нм.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программ Statistica 6 и Microsoft Excel 2007.

Результаты исследований

Синтетический G9 представляет собой гаптен, т. е. соединение самостоятельно неспособное провоцировать синтез антител иммунной системой макроорганизма. Поэтому в качестве иммуногена был использован конъюгат олигосаха-рида с крупным белковым соединением - БСА с молекулярной массой порядка 67 кД. Для усиления иммунного ответа в практике обычно применяют различные адъюванты. В нашем случае мы использовали классический вариант - полный адъювант Фрейнда (ПС1) и два вида сапонинов - QS (ПС2) и А (ПС3). Для контроля провели иммунизацию кроликов только иммуногеном (ПС4), поскольку крупные белки-носители всегда вызывают более активную реакцию иммунной системы. Из данных изучения специфической активности полученных ПС видно, что наиболее эффективным адъювантом был сапонин А (табл. 1). К сожалению, дальнейшее использование этого адъюванта оказалось невозможным, из-за его гемолитических свойств. Поэтому в дальнейшем для приготовления антисыворотки использовали адъювант Фрейнда, что позволяло дольше поддерживать выработку животными эффективного соотношения антител к G9-БСA и БСА.

Присутствие в антисыворотках значительного количества антител против БСА (см. табл. 1) снижало специфическую активность приготовленных ПС. Поэтому на следующем этапе были использованы несколько способов повышения специфической активности ПС. К сожалению, воспользоваться известным классическим методом аффинной хроматографии в нашем случае было затруднительно из-за дороговизны синтетических препаратов (олигоглюкозид и его конъюгаты).

В этой связи были предприняты более экономичные способы истощения ПС, а именно связывание антител против БСА избыточным количеством БСА (ИПС) и аффинная очистка ПС на полимере ГА с БСА (ИПС1). Данные способы обеспечивают сохранность исходных биологических свойств ПС. Несмотря на то, что в работе изначально предполагалось использовать непосредственно ПС, т. е. весь комплекс образовавшихся иммуноглобулинов без стадии выделения IgG-антител, также была исследована возможность повысить качество анализа путем выделения фракции антител класса G при помощи ДЭАЭ-целлюлозы в объеме (ИПС2) с последующим прибавлением избыточного количества БСА для связывания IgG-антител против БСА. Как видно из данных, приведенных в табл. 2, наи-

Таблица 1

Динамика образования иммуноглобулинов класса G, специфичных к G9^CA и БСА, в присутствии разных адъювантов

ПС 2-я иммунизация (ед. ОП) 4-я иммунизация (ед. ОП) 5-я иммунизация (ед. ОП)

09-БСА БСА 09-БСА БСА 09-БСА БСА

ПС1 0,58

ПС2 0,201

ПС3 0,557

ПС4 0,111

1,870 1,261

1,387 0,226

1,911 1,576

1,063 0,252

2,488 0,810 2,129 1,431

0,989 0,124

0,07

1,520 1,080

1,163

более эффективным способом повышения специфической активности ПС оказался метод связывания антител против БСА избытком БСА в объеме. В этом случае сохранялось 82,6% активности ПС. Обогащение ПС на ДЭАЭ-целлюлозе привело к потере 41,3% специфической активности ПС, при этом сохранилась высокая степень сродства антисыворотки к БСА - 61,17%. Прибавление избытка БСА привело к получению фракции иммуноглобулинов класса G, у которой практически отсутствовала какая-либо степень сродства к БСА. Однако специфическая активность в отношении G9-БСА несколько понизилась (см. табл. 2). Истощение ПС на полимере ГА с БСА позволило получить антисыворотку, неспецифическая активность (сродство к БСА) которой была незначительной, но произошло снижение степени специфической (сродство к G9-БСА) активности на 59,28%.

Для проведения иммунохимических определений важной составляющей является выбор покровного антигена. Специально синтезированный для этих целей конъюгат G9-АА продемонстрировал более низкую степень связывания с ПС по сравнению с иммуногеном G9-БСА (см. табл. 2). Причем степень связывания приготовленных разными способами ПС с G9-AA оказалась ниже степени связывания с G9-БСА (в пределах от 18,26 до 50,55%).

Важной составляющей ингибиторного способа проведения ИФА является выбор ингибирующего (конкурентного) антигена, который в идеале должен обладать характеристиками, сходными с таковыми исследуемого вещества. В нашем исследовании апробированы три претендента на роль ингибиторного антигена: G9, G9-АА и G9-БСА. На рис. 2 представлены калибровочные кривые с этими антигенами при использовании в качестве покровного антигена G9-БСА. Результаты выявили невозможность титрования G9-БСА и G9-АА, поэтому их исключили их дальнейших исследований. Пригодным в качестве ингибиторного антигена оказался G9. Как видно из графика, пределы концентраций, в которых лежит участок обратно пропорциональной зависимости, составляют 1 и 50 мкг/мл.

Обсуждение

В последние годы в связи с ростом числа аллергических заболеваний среди населения, появились когортные исследования, проводимые одновременно во многих странах мира, посвященные изучению влияния биоаэрозоля жилых поме-

Таблица 2

Повышение специфической активности ПС разными способами

По- Специфическая активность ПС (ед. ОП)

кровный ПС1 ИПС ИПС1 *ИПС1+ ИПС2 * ИПС2 +

антиген БСА БСА

G9-AA 1,718 1,638 0,654 0,578 0,698 0,626

09-БСА 2,426 2,004 0,988 0,902 1,424 1,266

БСА 2,288 0,0 0,022 0,0 0,871 0,0

* - обработанные соответствующим способом ПС после прибавления избыточного количества БСА.

-2т&

I-1-е—-1-1—

0.01 0,1 1 10 100

мкг/г

Рис. 2. Концентрационные кривые при использовании в ингибитор-ном ИФА G9, -G9-AA и G9^CA в качестве ингибиторных антигенов.

щений (аллергены, эндотоксин, бета-глюкан, поллютанты) на развитие аллергических заболеваний [8-11]. Однако разработок ИФА тест-систем для выявления бета-глюканов единицы [16-21], а коммерческих ИФА-диагностикумов нет.

В результате проведенной работы синтезированы р-(1—>3)-нонашюкозид и его конъюгаты с БСА и АА. Необходимость в таких синтетических агентах обусловлена современным поиском новых способов определения полисахаридных соединений в окружающей среде. Природные соединения имеют высокую молекулярную массу, трудно поддаются выделению, очистке и полной молекулярной характеристике. Последнее обстоятельство имеет первостепенное значение для проведения каких-либо иммунных и иммунохимических взаимодействий. Использование синтетического аналога фрагмента природного полисахарида для этого предпочтительнее. Поэтому для разработки подходов к созданию реагентов для иммуноферментного определения линейных олигосахаридов микогенной природы нами были синтезированы новый олиго-глюкозид и его конъюгаты с крупными молекулами белковой и небелковой природы - G9-БСА и G9-АА.

Использование G9-БСА в качестве иммуногена позволило разработать схему получения ПС с высокой специфической активностью в отношении олигоглюкозида. Предложен простой и экономичный способ исключения из иммунохи-мических реакций антител против белка-носителя путем прибавления к нативной ПС раствора БСА (1 мг/мл). Такой одностадийный метод позволяет сохранять более 80% специфической активности ПС.

Изучение иммунохимических свойств G9-БСА и G9-АА, сорбированных на твердой фазе, продемонстрировало более высокую степень связывания G9-БСА с ПС. Последнее крайне важно для конечного результата любого иммунофермент-ного определения, причем особенно, когда предполагается получать не качественные, а количественные показатели. На данный момент трудно однозначно объяснить, с чем связана меньшая эффективность G9-АА. Можно предположить, что G9-АА обладает меньшим сродством к активированной полистироловой поверхности лунок планшета. Другим возможным объяснением может быть существенная разница в глобулярной структуре G9-БСА и G9-АА, вследствие чего антитела, образованные против определенных доминант G9-БСА, не проявляют высокой степени связывания с G9-АА.

Выбор ингибиторного способа проведения ИФА обусловлен тем, что в образцах природных материалов предполагается определять полисахаридные соединения, имеющие низкое сродство к материалу планшетов для ИФА. Как следствие этого результаты анализа могут оказаться заниженными, обуслов-

ливая в дальнейшем низкую чувствительность тест-системы. Для устранения этого дефекта в случае ингибиторного ИФА на плашку сорбируют покровный антиген, проявляющий высокую степень сродства с материалом планшета. Далее прибавляют специфические антитела в оптимальном количестве и ингибиторный антиген, связывающий часть антител. Оставшиеся свободными антитела вступают в иммунохими-ческое взаимодействие с покровным антигеном. Поскольку все реагенты используют в определенных концентрациях, то исключается вероятность получения ложных результатов. Соответственно, ингибиторный антиген должен обладать рядом характеристик, позволяющих использовать его для этих целей. В нашем случае опытным путем был выбран синтетический олигосахарид G9. Концентрационная кривая, полученная с его использованием, позволяет определять содержание олигоса-харидов в пробе в концентрации от 1 до 50 мкг/мл.

В перспективе разработанные методики приготовления реагентов для иммуноферментного определения линейных бета-глюканов и их производных могут быть использованы в различных областях, таких как экология, медицина, пищевая и фармакологическая индустрия.

Работа выполнена при поддержке государственного контракта от 22 июля 2009 г. № 9411.1007500.13.979 на выполнение ОКР «Поиск и разработка новых биологически активных соединений для создания на их основе лекарственных препаратов, вакцин и клеточных биофармацевтических препаратов», шифр «Фарма».

ЛИТЕРАТУРА (REFERENCES)

1. Sahlberg B., Gunnbjornsdottir M., Soon A., Jogi R., Gislason T., Wieslander G. et al. Sci. Total Environ. 2013; 444: 433-40.

2. Ross M.A., Curtis L., Scheff P.A., Hryhorczuk D.O., Ramakrishnan V., Wadden R.A. Persky V.W. Allergy. 2000; 55: 705-11.

3. Savilahti R., Uitti J., Roto P., Laippala P., Husman T. Allergy. 2001; 56: 175-9.

4. Osborne M., Reponen Т., Adhikari A., Cho S.H., Grinshpun S.A., Levin L. et al. Pediatr. Allergy Immunol. 2006; 17: 450-7.

5. Heseltine E., Rosen J., eds. WHO guidelines for indoor air quality: dampness and mould. 2009.

6.Blatter J., Forno E., Brehm J., Acosta-Perez E., Alvarez M., Colon-Semidey A. et al. Ann. Am. Thorac. Soc. 2014; 11: 925-32.

8. Iossifova Y.Y., Reponen T., Bernstein D.I., Levin L., Karla Y., Campo P. Allergy. 2007; 62 (5): 504-13.

9. Mendell M.J., Mirer A.G., Cheung K., Tong M., Douwes J. Environ HealthPerspect. 2011; 119: 748-56.

10. Choi H., Byrne S., Larsen L.S., Sigsgaard Т., Thorne P.S., Larsson L. et al. Indoor Air. 2014; 24: 158-70.

11. Karvonen A.M., Hyvarinen A., Rintala H., Korppi M., Taubel M., Doekes G. et al. Allergy. 2014; 69: 1092-101.

12. Krop E.J.M., Jacobs J.H., Sander I., Raulf-Heimsoth M., Heederik D.J.J. PLoS ONE. 2014; 9: e88871.

13. Chernyak A., Karavanov A., Ogawa Y., Kovac P. Carbohydr. Res. 2001; 330: 479-86.

14. Hou S.-J., Saksena R., Kovac P. Carbohydr. Res. 2008; 343: 196.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

15. Bovin N.V., Korchagina E.Yu., Zemlyanukhina T.V., Byramova N.E., Galanina O.E., Zemlyakov A.E. Glycoconjugate J. 1993; 10: 142.

16. Khatuntseva E. A., Men'shov V. M., Shashkov A. S., Tsvetkov Y. E., Stepanenko R. N., Vlasenko R. Y. Beilstein J. Org. Chem. 2012; 8: 763-75.

17. Douwes J., Doekes G., Montijn R., Heederik D., Brunekreef B. Appl. Environ. Microbiol. 1996; 62: 3176-82.

18. Douwes J., Doekes G., Montijn R., Heederik D., Brunekreef B. Mediators Inflamm. 1997; 6: 257-62.

19. Douwes J., van Strien R., Doekes G., Smit J., Kerkhof M., Gerritsen J. J. Allergy Clin. Immunol. 2006; 117: 1067-73.

20. Milton D.K., Alwis K.U., Fisette L., Muilenberg M. Appl. Environ. Microbiol. 2001; 67: 5420-4.

21. Van Dyken S.J., Garcia D., Porter P., Huang X., Quinlan P.J., Blanc P.D. J. Immunol. 2011; 187: 2261-7.

Поступила 30.03.15

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.