CC BY
79
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
«наука. инновации. технологии», №2(6), 2014
удк 637.044 В. Е. Супрунчук [V. E. Suprunchuk],
А. Д. Лодыгин [A. D. Lodygin], Е. В. Денисова [E. V. Denisova]
ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПОЛИМЕРОВ В КАЧЕСТВЕ ИНЕРТНЫХ НОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ р-ГАЛОКТОЗИДАЗЫ
Prospects of synthetic polymers application as inert carriers for p-galactosidase immobilisation
В статье обоснована актуальность производства низколактозных и без-лактозных продуктов. Рассмотрены методы иммобилизации р-галактозидазы, а также особенности, обусловленные видом носителя. Представлены способы образования ковалент-ной связи для фиксации лактазы на синтетических носителях.
Ключевые слова: гиполактозия, гидролиз лактозы, иммобилизация,
Р-галактозидаза, синтетические носители.
The actuality of lactose-reduced and delactosed products manufacturing is founded. Methods of p-galactosidase immobilization and it's peculiarities, concerned with type of carrier, are considered. Ways of covalent link formation for lactose binding by synthetic polymers are presented.
Key words: hypolactasia, lactose hydrolysis, immobilization,
P-galactosidase, synthetic carriers.
На сегодняшний день одной из актуальных проблем пищевой промышленности является развитие сектора по производству низколактозных и безлактозных продуктов. Это в первую очередь обусловлено тем, что определенная часть населения не может употреблять в пищу молочные продукты и продукты на основе молока в связи с недостаточным количеством, а иногда и полным отсутствием Р-галактозидазы (лак-тазы) в пищеварительном тракте. Непереносимость лактозы может носить наследственный характер, либо возникать в результате перенесенных кишечных инфекций [1]. Гиполактазией (лактазной недостаточностью) в России по разным оценкам страдают около 15 % населения [2]. Необходи-
мость гидролиза лактозы обусловлена так же ее низкими вкусовыми качествами (отсутствие сладости), ухудшением товарного вида конечного продукта в его процессе реализации (формирование кристаллов лактозы при ее избытке в готовом продукте), определена и важностью в решении проблемы переработки сыворотки, являющейся побочным продуктом молочной промышленности.
Для снижения уровня лактозы в молочных продуктах используют различные способы гидролиза: тепловой, химический и ферментативный [2]. Однако первые два способа имеют ряд недостатков, в первую очередь связанных с потерей таких важных компонентов молочного сырья как витамины и минеральные вещества [3]. Ферментативный способ исключает эти недостатки и наиболее перспективным в настоящей области является гидролиз под действием лактазы. Данный фермент способствует расщеплению «молочного сахара» до глюкозы и галактозы - моносахаридов, легко усваиваемых организмом и повышающих сладость продуктов.
Кроме того, Р-галактозидаза проявляет трансферазную активность и катализирует реакции трансгалактозилирования с образованием олиго-сахаридов различного состава. Как отмечено в работе [4] имеется возможность использования лактазы для производства лактулозы и других бифи-догенных олигосахаридов, входящих в состав лечебно-профилактических продуктов питания.
Таким образом, существуют широкие перспективы применения Р-галактозидазы в пищевой промышленности. Однако в любом производстве остро стоит проблема снижения уровня затратности производства, в связи с чем необходимо рассмотреть способы многократного использования ферментных препаратов, что повысит экономическую эффективность технологического процесса. Это возможно достичь путем иммобилизации фермента с использованием синтетических носителей. Иммобилизация фермента позволит обеспечить непрерывность производственного процесса, повысить качество конечных продуктов. Такого рода ферменты, обеспечивая тот же каталитический эффект, что и находящиеся в растворе, не загрязняют реакционную смесь и не попадают в конечный продукт [5], дают возможность остановки реакции в нужный момент.
Под иммобилизацией фермента понимается прикрепление фермента к нерастворимой матрице, либо заключение его в полупроницаемую мембрану, сопровождающееся сохранением его каталитической активности. Данный термин появился в середине 50-х гг. XX в.
Существует два способа иммобилизации фермента.
1. Физический, или абсорбционный, осуществляемый за счет возникновения сил нековалентной природы между ферментом и носителем, например, за счет электростатических, Ван-дер-Ваальсовых сил связывания; образования водородных и координационных связей; возникновения стерических соответствий типа «ключ - замок» и т. д. К физическим методам так же относят включение энзима в поры геля; введение фермента в двухфазную реакционную среду, в которой он растворим, но может находиться только в одной из фаз; пространственное разделение фермента от остальной части реакционной смеси с помощью полупроницаемой мембраны. К последнему методу относят инкапсулирование фермента в различного рода микросферы. Интересный способ физической иммобилизации фермента рассмотрен в работе [6]. Данный метод основан на фиксации молекул Р-галактозидазы на поверхности микроканалов в полистироле путем воздействия СО2 под давлением порядка 4,48 - 6,89 МПа, после чего каналы запечатывались, при этом активность фермента сохранялась. Этот способ является экологически чистым, его воспроизведение не требует использования «чистой комнаты», что открывает широкие возможности его практического применения.
2. Химический, характеризуемый образованием ковалентных связей, например амидных, карбамидных и других типов взаимодействий.
Оба метода имеют как достоинства, так и недостатки. При рассмотрении достоинств абсорбционного способа иммобилизации фермента необходимо отметить его простоту, дешевизну и доступность носителей. Основным же недостатком является низкая прочность связывания носителя и белка. В свою очередь химический способ обеспечивает высокую степень связывания, однако существенно изменяются кинетические характеристики фермента (кинетические константы прямой и обратной реакций взаимодействия фермента и субстрата, сродство фермента к субстратам и т.д.).
В качестве матриц могут выступать носители органической или неорганической природы. Для последних наиболее часто используют такие материалы как керамика, силикагель, глина, стекло, оксиды металлов. Так в работе [7] показано, что иммобилизация лактатдегидрогеназы и алко-гольдегидрогеназы путем абсорбции на различных формах оксида алюминия приводит к увеличению на порядок стабильности данных ферментов по сравнению с их нативными формами.
Для иммобилизации фермента органическими матрицами могут выступать как синтетические, так и природные полимеры, причем каждый из которых подразделяется на ряд видов. Среди природных полимеров можно выделить полисахаридные, белковые и липидные носители.
Из полисахаридов для иммобилизации часто используют агарозу, целлюлозу, каррагинан, пектин, хитозан. Интересно, что фермент субти-лизин, катализирующий гидролиз белков, в пленках состава субтилизин/ хитозан сохраняет свою каталитическую активность в течение 7 циклов без существенного ее изменения, а так же поле трех суток выдерживания в безводной среде, что позволяет использовать иммобилизирован-ный таким образом фермент для обратной задачи, а именно, для синтеза пептидной связи [8]. Лактаза, иммобилизированная на сульфатировнном полисахариде каррагинан с помощью полиэтиленамина, сохраняет до 60 % активности иммобилизированного фермента в течение 20 циклов применения [9]. К белковым носителям относят желатин, коллаген, фиброин и т. д.
Липидные носители, как правило, используются в виде моно- и бислоев сферической формы определяемые как липосомы. Все большую популярность среди исследований в области липидных носителей занимают липид-белковые нанодиски (нанолипопротеиновые частицы, rHDL), которые впервые были описаны в 1982 [10]. На сегодняшний день главным направление их применения является использование в роли среды для стабилизации и структурно-функциональных исследований мембранных белков.
Основными недостатками природных носителей являются их био-диградируемость, имунногенность и высокая стоимость, что зачастую «сводит на нет» возможность их использования в производстве. Наиболее перспективными в этом плане являются синтетические полимеры. В качестве носителей синтетической природы выступают полиакриламидные, полиуретановые и многие другие полимеры. Химическая иммобилизация Р-галактозидазы на синтетических носителях может быть осуществлена с помощью ковалентных связей, образованных в результате реакций классической органической химии (см. рисунок).
Так были получены стабильные препараты иммобилизированого фермента путем связывания Р-галактозидазы с полимером (силанизиро-ванным силохромом С - 2), содержащим NH - группы, с помощью бифункционального реагента (глутарового альдегида) [11].
Рис. 1. Способы образования ковалентной связи для фиксации лактазы на синтетических носителях.
В общем случае для иммобилизации лактазы используют различные синтетические полимерные носители. Для данной цели, наиболее часто используется полимолочная кислота и поли (молочная -со - гликолевая) кислота [12], полиамид (нейлон - 6) [13], полиакрила-мид, поливиниловый спирт. Использование диметиладипимидата позволило увеличить ферментативную активность в - галактозидазы до 190 % по сравнению с исходной [13]. Иммобилизация в геле поливинилового спирта увеличивает устойчивость фермента к температуре, величине рН и ионной силе [13].
В работе [14] показана возможность включения Р-галактозидазы в нерастворимые гранулы поли - N - винилкапролактама, стабилизированные резорцином с сохранением гидролитической активности до 45-62 %, а при замене стабилизатора на ПЭГ - 40 000 ферментативная активность увеличивается до 80 %. Таким образом более 20 %, а в первом случае более 50 % активности фермента теряется, что свидетельствует о невозможности использования данных способов в производстве. Существуют так же разработки рН зависмых систем. Авторами Squillante и Morshed [15] осуществлена инкапсуляция Р-галактозидазы с помощью Eudragit L - 100 (анионный сополимер метакриловой кислоты и метилметакрилата), где в качестве эмульгатора выступил стеарат сахарозы. В сильно кислых средах высвобождение фермента не наблюдалась, однако уже при рН 6,8 наблюдалось 80 %-е выделение фермента. Данная разработка способствует замедлению выделения фермента в кислой среде и обеспечения высвобождения в кишечной рН, что обеспечивает возможность ее применения для нужд фармацевтической промышленности.
Таким образом, основным недостатком при иммобилизации Р-галактозидазы на синтетических носителях является потеря ферментативной активности. Однако фиксированный с помощью иммобилизации фермент лактаза обладает большей стабильностью, при низких значениях рН и высокой температуре, т. е. снижаются отрицательные для производства свойства фермента (нестабильность физиологических условиях, антигенность, токсичность). Это в свою очередь способствует уменьшению вероятности загрязнения конечного продукта. Кроме того, благодаря возможности многократного использования такого фермента усиливается экономический эффект, что позволяет считать его перспективным для использования в промышленности.
ЛИТЕРАТУРА 1. Калинина Е. Д., Коваленко А. В. Исследование и установление технологических параметров проведения гидролиза лактозы молока // Восточно-Европейский журнал передовых технологий. — 2014. — Т. 10. — № 1. — С. 26-31.
2. Мамаева Л. В., Смирнова С. В. Дифференцированные подходы к диагностике непереносимости молока в гериатрии // Сибирский медицинский журнал. — 2008. — Т. 23. — № 3-1. — С. 58-64.
3. Михайлова Н.И. Гидролиз лактозы // Переработка молока. — 2003. №5. — С. 11-13.
4. Пилипенко О.С. Активность и стабильность р-галоктозидаз: дис. ... канд. хим. наук. — М., 2006. — 170 с.
5. Василисина В. В., Храмцов А. Г., Василисин С. В. Сгущенная гидролизованная сыворотка для хлебопечения // Молочная промышленность. — 1974. — № 4. — C. 28-30.
6. Jeffrey LeClair Ellis, David L. Tomasko. Fariba Dehghani Novel Dense CO2 Technique for p-Galactosidase Immobilization in Polystyrene Microchannels // Biomacromolecules. — 2008. — № 9 (3). — С. 10271034.
7. Коваленко Г.А. Иммобилизация оксидоредуктаз на неорганических носителях: дис. ... канд. хим. наук. — М., 1984. — 176 с.
8. Бачева А. В., Исаков М. С., Лысогорская Е. Н. Эффективный биокатализатор для реакций гидролиза и синтеза пептидов - биокомпозит субтилизин карлсберг/хитозан // Биоорганическая химия. 2008. Т. 3. — № 34. — С. 371-375.
9. Elnashar M. M., Awad G. E., Hassan M. E., Mohy Eldin M. S., Ha-roun B. M. Optimal Immobilization of p-Galactosidase onto к-Carra-geenan Gel Beads Using Response Surface Methodology and Its Applications [ТехЦ. ScientificWorld Journal. 2014. 7 pages. DOI: 10.11 55/2014/571682
10. Matz C. E., Jonas A. Micellar Complexes of Human Apolipoprotein A - I with Phosphatidylcholines and Cholesterol Prepared from Cholate -Lipid Dispersions // J. Biol. Chem. 1982. № 257(8). С. 4535-4540.
11. Грачева И. М. , Кривова А. Ю. Технология ферментных препаратов. 3-е изд., перераб. и доп. М.: Элевар, 2000. 512 с.
12. Stivaktakis N., Nikou K., Panagi Z., Beletsi A., Leondiadis L., Avgo-ustakis K. Immune responses in mice of beta-galactosidase adsorbed or encapsulated in poly(lactic acid) and poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres // J Biomed Mater Res A. — 2005. — № 73(3). — C. 332338.
13. Пат. № 01586113 Российская Федерация, МПК7 A61K 9/00 B01J 2/00 F26B 17/02. ^особ промышленного производства биокатализаторов в форме ферментов или микроорганизмов, иммобилизованных в геле на основе поливинилового спирта, их применение и устройства для их получения / Ю. В. Кузнецова, А. С. Пантелеев, Е. Г. Ильмер; заявитель и патентообладатель: ЛЕНТИКАТ'С, А.С. № [EAA] 200801974; заявл. 13.03.2006; опубл. 06.03.2007, Бюл. № EAA20901.
14. Кравченко И. А. Иммобилизация щелочной протеазы и р-галак-тозидазы на полимерных носителях: автореф. дис. ... канд. хим. наук. Одесса, 1995. 19 с.
15. Squillante E., Morshed G., Bagchi S., Mehta K.A. Microencapsulation of beta-galactosidase with Eudragit L-100 // J. Microencapsul. 2003. № 20 (2). С. 153-167.
ОБ АВТОРАХ Супрунчук Виктория Евгеньевна, инженер-лаборант кафедры химии, студентка магистратуры 2 курса. Адрес: г Ставрополь, Пушкина, д. 1, корпус 3. Телефон (8652) 35-30-33. E-mail:vikasuprunchuk@gmail.ru.
Лодыгин Алексей Дмитриевич, заведующий кафедрой прикладной биотехнологии Северо-Кавказского федерального университета, доктор технических наук, доцент. Адрес: г. Ставрополь, ул. Маршала Жукова, 9 (корпус 7), ауд. 420. Телефон (8652) 23-39-43. E-mail: allodygin@yandex.ru
Денисова Евгения Владимировна, доцент кафедры медицинской биохимии, клинической лабораторной диагностики и фармации, кандидат биологических наук. Адрес: г. Ставрополь, Пушкина, д. 1, корпус 3. Телефон (8652) 35-50-68. E-mail: den_ev@mail.ru
Suprunchuk Victoria Evgen'evna, engineer technician Department of Chemistry, Master student 2 courses. Address: Stavropol, Pushkin, d. 1, the housing 3. Telephone: (8652) 35-30-33. E-mail: vikasuprunchuk@gmail.ru.
Lodygin Aleksei Dmitrievich, Head of the Department of Applied Biotechnology North Caucasus Federal University, doctor of technical sciences, professor. Location: city of Stavropol, street. Marshal Zhukov, 9 (case 7), Rm. 420 Telephone: (8652) 23-39-43. E-mail: allodygin@yandex.ru
Denisova Evgeniya Vladimirovna, Associate Professor of Medical Biochemistry, Clinical Laboratory Diagnostics and Pharmacy, PhD biologists and Physical Sciences. Address: Stavropol, Pushkin, d. 1, the housing 3. Telephone (8652) 35-50-68. E-mail: den_ev@mail.ru
