CC BY
120
УДК 573.6.086.83
Л. К. Букуру, Е. В. Скворцов, Т. В. Багаева, З. А. Канарская
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ Р-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОЛАКТОЗНОГО НАПИТКА НА ОСНОВЕ МОЛОЧНОЙ СЫВОРОТКИ
Ключевые слова: молочная сыворотка, лактоза, в-галактозидаза, ферментативный гидролиз, безлактозный напиток.
Методом хроматографического анализа определено, что эффективность гидролиза лактозы в-галактозидазой препарата «Лактазар» в молочной сыворотке с консервантом аскорбиновой кислотой составила 97,7 %, с консервантом лимонной кислотой 84,2 %. В напитках на основе гидролизованной молочной сыворотки имеется сладость, как результат гидролиза лактозы до глюкозы и галактозы.
Key words: whey, lactose, в-galactosidase, enzymatic hydrolysis, lactose-free drink.
Chromatographic analysis determined that the effectiveness of lactose hydrolysis with в-galactosidase of the preparation "Lactazar" in milk whey with preservative ascorbic acid was 97.7°%>, with a preservative of citric acid of 84.2%. In beverages based on hydrolyzed whey there is sweetness, as a result of the hydrolysis of lactose to glucose and galactose.
Введение
Лактоза представляет собой дисахарид, основной углевод, присутствующий в молоке и состоит из двух сахаров - глюкоза и галактоза. Усвоение лактозы в организме человека связано с наличием лактазы (ß-галактозидазы). Дефицит этого фермента у человека вызывает непереносимость лактозы поступающей в организм с молочными продуктами [1, 2].
Лактазная недостаточность является патологией тонкой кишки, при которой лактоза не достаточно расщепляется и не усваивается в тонком кишечнике. Во многих медицинских исследованиях описываются следующие симптомы лактазной недостаточности: если лактоза попадает в пищеварительный тракт, появляется диарея, повышается газообразование в кишечнике, боли в животе, и т.д. В раннем возрасте у детей в большинстве случаев развивается симптом дегидратации или потеря массы тела [2].
Для лечения лактазной недостаточности предлагается применение молочных продуктов малосо-держащих лактозу или принимать лекарственные препараты, которые содержат фермент лактазу.
ß - галактозидазу получают из животных, растений и микроорганизмов (бактерии, грибы, дрожжи). Микроорганизмы, способные использовать лактозу в качестве единственного источника углерода и энергии являются продуцентами ß- галактозидазы. В промышленности для получения лактазы используют дрожжи Kluyveromyces lactis и Kluyveromyces fragilis, плесневые грибы Aspergillus niger и Aspergillus оrуzае [3], бактерии родов Lactobacillus и Bifidobacterium [4].
Анализ публикаций показывает, что интерес к ß - галактозидазе (EC 3.2.1.2.3) растет благодаря огромному потенциалу возможностей ее использования в пищевой, молочной и фармацевтической промышленности [5, 6, 7].
Существует несколько интересных применений ß-галактозидазы в пищевой промышленности: гидролиз лактозы вк молоке для производства новых молочных продуктов без лактозы в их составе. Возможно полное устранение лактозы в молоке для решения проблемы людей с непереносимостью лактозы. Также возможно, предотвращение кристаллиза-
ции лактозы и увеличение сладости во время приготовления продуктов питания из молока, например мороженое, сгущенное молоко и т.д [8].
Благодаря использованию Р-галактозидазы возможна утилизация различных молочных отходов, особенно гидролиз лактозы молочной сыворотки [9]. Сывороткой является жидкость, оставшаяся после осаждения и удаления молочного казеина при производстве сыра и творога.
Молочной сыворотке, которая используется в пищевой промышленности, присущи биологически ценные свойства. Из сыворотки вырабатывают молочный квас, молочное пиво, коктейли. Ее сушат и используют для приготовления детского питания, молочного сахара [10] .
Также молочная сыворотка богата гетерогенными белками. Белки и пептиды молочной сыворотки находят все большее применение в качестве функциональных соединений, используемых в фармацевтических препаратах [11].
Увеличение производства безлактозных продуктов питания на сегодняшний день является актуальной задачей в пищевой и фармацевтической промышленности, для людей с лактазной недостаточностью. В связи с этим продолжают быть актуальными исследования, направленные на использование, переработку и оптимизацию процессов гидролиза лактозы молочной сыворотки.
Описан гидролиз лактозы молочной сыворотки ферментным препаратом р-галактозида и методом ВЭЖХ определено, что максимальная глубина гидролиза лактозы составила 96 % [12]. Полученные гидролизаты молочной сыворотки рекомендуется использовать для получения витаминизированных сладких напитков.
Создание эффективных способов гидролиза лактозы позволит реализовать в пищевой промышленности указанные выше технологии получения продуктов из молочной сыворотки [12].
Исходя из этого, цель настоящей работы - получение газированного низколактозного напитка на основе гидролизованной лактозы сыворотки. Для достижения данной цели поставлены задачи:
1. Определить эффективность применения в-галактозидазы для гидролиза лактозы молочной сыворотки.
2. Определить влияние консервантов на эффективность гидролиза лактозы молочной сыворотки в-галактозидазой.
3. Получение газированного безалкогольного низколактозного напитка из ферментированной молочной сыворотки.
Материалы и методы исследования
В исследовании применяли препарат в-галактозидаза - «Лактазар», ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Россия. Анализ активности в - галактозидаз
в-галактозидазную активность определяли модифицированным методом Konig, 2002 в трех по-вторностях [12, 13].
Проведение гидролиза и анализ гидролизованной молочной сыворотки с добавкой консерванта
Проведение гидролиза молочной сыворотки с добавкой консерванта. В ходе работы проводили гидролиз молочной сыворотки с добавкой консерванта коммерческим препаратом в-галактозидаза «Лактазаром» (1л молочной сыворотки +1 капсула «Лактазар» + 1г лимонной кислоты/аскорбиновой кислоты). Готовые смеси выдерживали 24 часа в термостате при температуре 38 оС.
Анализ гидролизатов молочной сыворотки с добавкой консерванта методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
К пробе гидролизата добавляли ацетонитрил в соотношении 1:4, перемешивали и центрифугировали 10 мин при 10 000 об/мин. Супернатант исследовали методом ВЭЖХ на хроматографе Waters. Определяли моносахаридный состав гидролизата. Хроматография проводилась на колонке Supelcosil LC-NH2 58338 250 х 4.6 мм. Элюент - ацетонитрил, 75%. Элюент готовили смешиванием 750 мл ацето-нитрила с 250 мл особо чистой воды. Элюент фильтровали через фильтр 0,2 мкм с помощью установки вакуумной фильтрации.
Регистрацию фракций моносахаридов осуществляли рефракционным детектором Refractive Index Detector Waters. Параметры хроматографирования: объем инъекции - 20 мкл, скорость - 0.2 мл/мин, температура - 25,5°С, длительность - 30 минут. В качестве стандартов использовали лактозу в растворе ацетонитрила и воды 80/20, приготовленные в двух концентрациях 1 и 5 г/л.
Готовили следующим образом, 5 г/л: растворяли 0,05г лактозы в 10 мл 80 % раствора ацетонитрила;1 г/л: смешивали 100 мкл раствора концентрации 5 г/л и 400 мкл 80 % раствора ацетонитрила. Вычисление концентраций сахаридов в анализируемом гидроли-зате проводили по площади пиков, используя программное обеспечение хроматографа.
Газирование ферментированной молочной сыворотки для получения газированного низколактозно-го напитка
Полученные гидролизаты газировались углекислым газом под давлением 3 атм. до полного насыщения.
Статистическая обработка данных
Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием программы Excel, методом интервальных оценок. Значимость р < 0.05 [14].
Результаты и обсуждение
Определена в-галактозидазная активность коммерческого препарата «Лактазар» - 33350 IU/ml.
Рис. 1 - Калибровочный график зависимости площади пика от концентрации лактозы
Хроматограммы стандартного раствора лактозы 1 г/л показали следующие параметры пика: время задержки выхода пика - 26,597 мин, площадь 836784 Mvxsec. Стандартного раствора 5 г/л, соответственно, время задержки выхода пика - 26,391 мин, площадь - 2069966 Mv*sec. Площади пропорциональны концентрации лактозы в образцах. По полученным результатам стандартных образцов, построен калибровочный график зависимости (рис. 1) площади пика от содержания лактозы в растворе.
Параметры пика лактозы исходной молочной сыворотки, время задержки выхода - 25,632 мин, площадь - 4967044 Mv*sec (рис. 2).
ООО 2.00 4.00 6.И 1.00 Ш 11.» 1« 16« 11.00 21.® 22.М 1« 26.00 21.00 Ю.01
Рис. 2 - Хроматограмма исходной негидролизо-ванной молочной сыворотки
Используя калибровочный график, находим, что концентрация лактозы в образце в негидролизован-ной молочной сыворотке составляла 10,88 г/л. С учетом пятикратного разведения концентрация лактозы в сыворотке 10,88 г/л х5 = 54,4 г/л.
Эффективность гидролиза лактозы в-галактозидазой вычисляют по следующей формуле: Э = [(Си - Ск) / Си] х 100 %
где Э - эффективность гидролиза, % гидролиза; Си -исходная концентрация лактозы в сыворотке до гидролиза, г/л; Ск - концентрация лактозы в гидро-лизате сыворотки, г/л.
На рис. 3 гидролизата молочной сыворотки с добавкой консерванта лимонной кислоты концентрированным препаратом ß-галактозидазы «Лактазар» параметры пика лактозы: время задержки выхода -25,213 мин, площадь пика 925495 Mv*sec. Содержание лактозы снизилось до 8,6 г/л. Эффективность гидролиза лактозы составила 84,2 %.
Рис. 3 - Хроматограмма гидролизата сыворотки с добавкой консерванта лимонной кислоты
На рис. 4 гидролизата молочной сыворотки с добавкой консерванта аскорбиновой кислоты препаратом Р-галактозидаз «Лактазар» параметры пика лактозы: время задержки выхода-25,613 мин, площадь пика 112916 Mvxsec. Содержание лактозы снизилось до 1,25 г/л. Эффективность гидролиза лактозы составила 97,7 %.
Рис. 4 - Хроматограмма гидролизата сыворотки с добавкой консерванта аскорбиновой кислоты
Полученные результаты исследований показывают, что примененные методы хроматографическо-го анализа лактозы в сыворотке и ее гидролизатах, чувствительность рефрактометрического детектора дает возможность с высокой точностью определять содержание лактозы.
Полученные гидролизаты газировались углекислым газом под давлением 3 атм. до полного насыщения. В результате получены два вида газированного напитка на основе гидролизованной лактозы молочной сыворотки с консервантом лимонной и аскорбиновой кислоты. Напитки имели кисловатый вкус, присущий молочной сыворотке, сладость, как результат присутствия гидролизных глюкозы, галактозы и жгучесть присущую газированным напиткам.
Выводы
Методом хроматографического анализа определено, что эффективность гидролиза лактозы ß-галактозидазой препарата «Лактазар» в молочной сыворотке с консервантом - аскорбиновой кислотой составила 97,7 %, с консервантом - лимонной кислотой 84,2 %.
Для напитков на основе гидролизованной молочной сыворотки отмечена сладость как результат гидролиза лактозы до глюкозы и галактозы.
Литература
1. Akinola GE, Adebayo-Tayo BC, Olonila OT. Nat Sci. 10(12):265-270. (2012).
2. М. Л. Бабаян. remedium.ru (2014).
3. Swati Soni, Sanjay Timande. Journal of Environmental Research and Development- Vol. 6 №. 3 A- -P.721-726. (2012).
4. M.R.Mozumder, M. Akhtaruzzaman, M. A. Bakr and Fatema-Tuj-Zohra. J. Sci. Res. 4(1): 239-249. (2012).
5. Gopalakrishnan VK, Palaniswamy M, Vidya B. World J. Pharmacy and Pharmaceutical Sc. 3(6): 1809-1821. (2014).
6. Maity M., Sanyal S., Bhowal J., Bhattacharyya D.K. Research Journal of Recent Sciences. Vol. 2(8) - P.92-94. (2013).
7. Maksimainen M., H. Nina, M.K. Johanna. Journal of Structural Biology. 174: 156-163. (2011).
8. S. Princely, N. SaleemBasha, J. John Kirubakaran1, M. D. Dhanaraju. European Journalof Experimental Biology,-,3(2):P.242-251. (2013).
9. А.Н. Петров, А.С. Матвеенко, М.Н. Стрижко. Техника и технология пищевых производств. № 1, ISSN 2074-9414. (2013).
10. Храмцов А.Г. Х-897 Феномен молочной сыворотки. -СПб.: Профессия, - 804 с. (2011).
11. Constanta S. Innovative Romanian Food Biotechnology. Vol. 10. 2012.P. 1-8. (2012).
12. ЕВ. Скворцов, Ю.А.Морозова, Л.К. Букуру, Ф.К. Алимова, З.А. Канарская. Вестник Казанского технол. унив. - Т. 17, № 13. - С.288-291. (2014).
13. J. König, R.Grasser, H. Pikor, K. Vogel. Anal Bioanal Chem. V.37. P. 80-87. (2002).
14. Акберова, Н.И. Описательная статистика. Интервальные оценки: Учебно-методическое руководство и сборник задач к практическим занятиям по курсу «Математические методы в биохимии». Казань: Казанский госуд. универ. им. В. И. Ульянова-Ленина. 40с. 2004.
© Л. К. Букуру - асп. каф. биохимии и биотехнологии КФУ, blysechrista@yahoo.fr; Е. В. Скворцов - к.б.н., ассис. той же кафедры, eskvortsov@rambler.ru; Т. В. Багаева - д.б.н., проф. той же кафедры, Tatiana.Bagaeva@kpfu.ru; З. А. Канарская -к.т.н., доц. каф. пищевой биотехнологии КНИГУ, zosya_kanarskaya@mail.ru.
© L. K. Bukury - postgraduate student dep. biochemistry and biotechnology KFU, blysechrista@yahoo.fr; E. V. Skvortsov - Ph.D. bio. sci. assistant the same Department, eskvortsov@rambler.ru; T. V. Bagaeva - professor bio. sci. the same Department, Tatia-na.Bagaeva@kpfu.ru; Z. A. Kanarskaya - Ph.D. tech. sci., docent dep. Food biotechnology KSRTU, zosya_kanarskaya@mail.ru.
