CC BY
18
Б01: 10.15593/2224-9400/2021.2.03 УДК 571.27
Л.В. Волкова, Е.П. Ратегова, Е.В. Корнилова
Пермский национальный исследовательский политехнический университет, Пермь, Россия
ОПЫТ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ СУБСТАНЦИИ ИЗ ПОБОЧНЫХ ПРОДУКТОВ ИММУНОГЛОБУЛИНА
На сегодняшний день переработка побочных продуктов на иммунобиологических производствах является актуальной в связи с использованием дорогостоящего сырья. На территории России с иммунобиологических производств и станций переливания крови образуются десятки тонн неутилизированных отходов, и переработка такого высокобелкового сырья имеет большие перспективы.
Побочные продукты иммуноглобулинового производства содержат практически полный аминокислотный состав. Переработка такого высокобелкового сырья позволит почти полностью выделить ценные белки из донорской плазмы и тем самым свести к минимуму технологические потери.
В последнее время интерес ученых все более привлекает получение белково-пептидных комплексов из продуктов природного происхождения. Низкомолекулярные антигенспецифичные цитокины, представляющие собой Ы-концевой фрагмент (с молекулярной массой менее 10 кДа) растворимых Т-клеточных антигенсвязываю-щих белков, были выделены из мембран лимфоцитов и иммунной плазмы человека.
Основным способом получения продуктов из отходов производства является растворение белков, содержащихся в осадках «Б». Для этого был подобран буферный раствор, способный экстрагировать белки с получением суспензий. Рассмотрена возможность разрушения белков с помощью ультразвука и химического детергента, в частности мочевины. Определены условия ферментативного гидролиза и продолжительности процесса. Получены наиболее эффективные параметры процесса для получения низкомолекулярных полипептидов. Определены физико-химические показатели процесса, такие как рН, концентрация белка и уровень ам-миного азота. Проведен анализ ВЭЖХ, по результатам которого проведена оценка степени разрушения белков, проведена очистка полупродукта на мембранных фильтрах. Полупродукт был проверен на стерильность, антибактериальную активность, острую токсичность, и фагоцитарную активность нейтрофилов у кроликов.
Ключевые слова: гидролиз, белки, фракционирование иммуноглобулинов, бел-ково-пептидный комплекс.
L.V. Volkova, E.P. Rategova, E.V. Kornilova
Perm National Research Polytechnic University, Perm, Russian Federation
EXPERIENCE IN OBTAINING BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES FROM IMMUNOGLOBULIN BYPRODUCTS
Today the processing of by-products in immunobiological industries is relevant due to the use of expensive raw materials. On the territory of Russia, tens of tons of unused waste are generated from immunobiological plants and blood transfusion stations, and the processing of such high-protein raw materials has great prospects.
The by-products of immunoglobulin production contain an almost complete amino acid composition. The processing of such high-protein raw materials will make it possible to almost completely isolate valuable proteins from donor plasma and thereby minimize technological losses.
Recently, scientists are increasingly interested in obtaining protein-peptide complexes from products of natural origin. It is known to obtain "low molecular weight antigen-specific cytokines" (LASC), which is an N-terminal fragment (with a molecular weight of less than 10 kDa) of soluble T-cell antigen-binding proteins (TAB), which were isolated from the membranes of lymphocytes and human immune plasma.
The main method of obtaining products from production wastes is the dissolution of proteins contained in sediments "B". For this, a buffer solution was selected, capable of extracting proteins to obtain suspensions. The possibility of protein destruction using ultrasound and a chemical detergent, in particular urea, is considered. The conditions of enzymatic hydrolysis and the duration of the process have been determined. The most effective process parameters for obtaining low molecular weight polypeptides have been obtained. The physicochemical parameters of the process were determined, such as pH, protein concentration and the level of ammonium nitrogen. HPLC analysis was carried out, according to the results of which the degree of protein degradation was assessed, the intermediate product was purified on membrane filters. The semi-finished product was tested for sterility, antibacterial activity, acute toxicity, and phagocytic activity of neutrophils in rabbits.
Keywords: protein hydrolysis, protein-peptide complex, cytokines, ultrasound.
Введение. В настоящее время перед биофармацевтическими предприятиями стоит важная задача рационального использования дорогостоящего сырья, в частности донорской плазмы. Большое количество белка плазмы крови не перерабатывается предприятиями и остается в отходах производства. Попадая в окружающую среду, они создают неблагоприятные микробиологические условия и вызывают экологические проблемы [2].
Побочные продукты иммуноглобулинового производства содержат практически полный аминокислотный состав. Переработка такого высокобелкового сырья позволит почти полностью выделить ценные
белки из донорской плазмы и тем самым свести к минимуму технологические потери [13].
В последнее время интерес ученых все больше привлекает получение белково-пептидных комплексов из продуктов природного происхождения. Низкомолекулярные антигенспецифичные цитокины (НАСЦ) с молекулярной массой менее 10 кДа были выделены из мембран лимфоцитов и иммунной плазмы человека [6]. Сравнительно недавно из осадка «Б» отхода производства противостафилококкового иммуноглобулина были выделены НАСЦ с молекулярной массой 5-8 кДа [1].
Однако существующие методы сложны и продолжительны, а получаемые препараты либо дорогостоящие, либо недостаточно эффективны. Перспективным методом получения полипептидов из побочных продуктов, на наш взгляд, является ультразвуковая обработка, поскольку возникающие при этом процессы кавитации могут изменять физико-химические характеристики биообъектов и оказывать вирусо-ингибирующую активность [9, 14].
Один из способов получения препаратов из побочных продуктов плазмы крови человека - это их глубокая переработка, которая предполагает гидролиз белковой молекулы до пептидных фрагментов [15]. Перспективным и распространенным методом получения полипептидов является ферментативный гидролиз [5]. Препараты, полученные на основе белковых гидролизатов, широко используются в медицине - для лечения болезней инфекционной природы и иммунодефицитных состояний [11].
Цель исследования - поиск метода получения биологически активной субстанции из побочных продуктов иммуноглобулина человека.
Материалы и методы. Объектом исследования был осадок фракции «Б», побочный продукт производства иммуноглобулинов. Осадок «Б» суспендировали в 0,01 М калий-фосфатном буферном растворе с 2 М мочевиной в соотношении 1:10. Полученную суспензию центрифугировали в течение 30 мин со скоростью вращения ротора центрифуги 8000 об/мин, осадок утилизировали, а надосадочную жидкость последовательно фильтровали через фильтры с размером пор 0,8; 045; 0,22 мкм.
Полученный осветленный супернатант облучали ультразвуком с использованием ультразвуковой установки ЦР50Н в течение 1, 3 и 5 мин при температуре +10 °С. Ультразвуковую обработку проводили при следующих условиях: мощность 50 Вт и частота 30 кГц - постоянные показатели; амплитуда варьировала в пределах от 60 до 80 %.
Количественное определение уровня белка в исследуемых образцах проводили биуретовым методом. Биуретовый метод основан на способности катионов меди (II) при взаимодействии в щелочной среде с группировками пептидных связей белков формировать устойчивые комплексы, окрашенные в сине-фиолетовый цвет. Интенсивность окрашивания зависит от концентрации белков в растворе. Количество белков в растворе определяют при сопоставлении оптической плотности анализируемого окрашенного раствора и набора окрашенных белковых растворов с известной концентрацией белков.
Определение молекулярных параметров белково-пептидного комплекса проводили с использованием метода ВЭЖХ при длине волны 280 нм на хроматографической колонке фирмы «Биохиммак» с сорбентом Диасфер-110-Диол. Содержание пептидных соединений контролировали в растворе комплекса с концентрацией 1 мг/мл по сухому веществу. Для предотвращения забивания колонки исследуемые образцы предварительно фильтровали через мембраны с размером пор 0,22 мкм. Идентификацию молекулярных масс пептидов проводили на хроматографе фирмы Knauer c использованием колонки SuperDex Increase. Подвижной фазой был калий-фосфатный буфер.
Методика определения аминного азота заключалась в колориметрическом определении с использованием нингидрина. Белки, полипептиды, а также свободные аминокислоты при кипячении с водным раствором нингидрина дают синее или сине-фиолетовое окрашивание. Нингидрин, воздействуя на аминокислоты, подвергает их окислению, в точности - дезаминированию и декарбоксилированию. Нингидрин в реакции восстановления образует вещество, окрашенное в фиолетовый цвет. По интенсивности окрашивания определяют количество свободных аминокислот в среде, так как они находятся в пропорциональной зависимости.
После проведения стерилизующей фильтрации проводили контроль на стерильность полученного полупродукта. Для испытания использовали жидкую тиогликолевую среду для выявления аэробных и анаэробных бактерий, и жидкую среду Сабуро для выявления грибов.
Экспериментальная часть. На первом этапе исследования воздействие ультразвука составило 1, 3 и 5 мин. Полученные результаты, анализированные методом ВЖЭХ, представлены на рис. 1.
мАи
3.
мАи
50-
2.
, 5ч Множественная РОА 1 280 пт, 4 пт
Л 10,662 11,880 1,988 - -ВД1- 01 9022,861 - 23,316 »26 5 5
м 1 /20,3 V 24,'. (26,79; [ 28,56: 132,427
15 20 25 30 35
: § Множественная РОА 1 280 пт, 4 пт
мАи 1007550250-
5 10 15 20 25 30 35
4.
2 5 Множественная РОА 1 280 пт, 4 пт гч.
\ ~ ¿X 1м. у 2' Я ч 5 1 : а
5 10 15 20 25 30 35
Рис. 1. Сравнительный анализ образцов побочного фракционирования иммуноглобулина, обработанных ультразвуком: 1 - воздействие УЗ в течение 1 мин; 2 - воздействие УЗ в течение 3 мин; 3 - воздействие в течение 5 мин;
4 - без воздействия УЗ на пробу
Показано, что воздействие УЗ практически не повлияло на фракционный состав исследуемых белковых комплексов.
Следующим этапом было изучение более длительного воздействие УЗ на осадок «Б» с дополнительной обработкой белковой суспензии хлороформом для осаждения липопротеидов и 8 М мочевиной. В качестве образцов использовали исходный супернатант с концентрацией белка 19,71 мг/мл. Хлороформ добавляли в суспензию в количестве 10 % по объему. Белково-хлороформенную смесь перемешивали при температуре 25 °С в течение 20 мин, затем центрифугировали в течение 30 мин со скоростью вращения ротора центрифуги 8000 об./мин при температуре 25 °С. В осветленном супернатанте контролировали содержание белка, а осадок, содержащий липопро-теиды, уничтожали.
Осветленный супернатант облучали ультразвуком при максимальной мощности в течение 15 мин. Часть образцов предварительно до воздействия УЗ обрабатывали мочевиной до конечной ее концентрации в растворе 8 М, так как при этой концентрации происходит обратимая денатурация белков [4].
Полученные результаты показали, что концентрация белка на всех стадиях процесса уменьшилась, наиболее значительные потери
наблюдали при осаждении примесей хлороформом (в 2 раза), при обработке УЗ наблюдали потери меньше на 1-10 %.
Растворы, обработанные УЗ в течение 15 и 30 мин (рис. 2, 3), состояли на 40 % из агрегатов с высокой молекулярной массой и на 50 % из белков с молекулярной массой около 150 кДа.
Рис. 2. Образец 5 после обработки УЗ в течение 15 мин
0 10 20 30 40
Рис. 3. Образец 6 после обработки УЗ в течение 30 мин
В образцах, содержащих мочевину в концентрации 8 М, на хро-матограмме присутствовал основной пик с высокой молекулярной массой (рис. 4). Низкомолекулярные примеси в образцах отсутствовали, кроме образца № 1, который обрабатывался УЗ в течение 1 мин. Здесь присутствовало незначительное количество белковых фракций с низкой молекулярной массой.
Использование ультразвука и мочевины в качестве физического и химического дезагрегатора не показало существенных изменений в разрушении белковых молекул. Поэтому был апробирован метод ферментативной дезагрегации: осадок «Б» суспендировали в 0,05 М ацетатном буферном растворе с добавлением 0,05 М №С1 в соотношении 1:10. Осветленный супернатант после центрифугирования закис-
ляли с помощью соляной кислоты до значения рН 1,9. Вносили свежеприготовленный раствор пепсина до его концентрации в среде 0,3; 1,0 и 2,0 мг/мл. Смесь инкубировали в термостате при температуре 37 °С в течение 78 ч.
105: 1009590851 8075706560-55^ 504540-35^ 30^ 25: 20151050--
-5^ ■■•■ I •■■•■•■■ ....... ■■■■■■•■ .........................................
2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5
Рис. 4. Хроматограммы образцов 1, 2, 3, 4 в присутствии мочевины 8 М. Наивысший пик соответствует образцу 4 после обработки УЗ 30 мин; далее в порядке убывания: образец 3 - УЗ 15 мин, образец 2 - УЗ 6 мин, образец 1 - УЗ 1 мин
С целью учета автогидролиза собственных молекул фермента использовали контрольные пробы: раствор фермента без добавления белковой суспензии [12]. Инактивацию пепсина после инкубации производили с помощью 0,1 N №ОИ до значения рН, равного 6,0.
Проводили реакцию с треххлоруксусной кислотой (ТХУ) на присутствие в среде высокомолекулярных белковых соединений, для этого к исследуемому образцу добавляли объем, равный 20 % ТХУ. В пробах наблюдали помутнение раствора, что свидетельствовало о присутствии следов белка.
В ходе опыта контролировали концентрацию аминного азота, которая незначительно возрастала в 1,5 и 2 раза после первых и вторых суток испытания, и только после третьих суток испытания увеличилась в 3,5-4,4 раза (рис. 5). Данные показатели являются недостаточно высокими для эффективного использования полученной субстанции в питательных средах [7].
о
и
о И
И «
70 60 50 ^ 40
я =5
^ ь
о та
<и Я И
о «
30 20 10
Пепсин 0,3 мг/мл Пепсин 1,0 мг/мл Пепсин 2,0 мг/мл
12 3 4
Продолжительность гидролиза, сут
Рис. 5. Зависимость концентрация аминного азота (мг %) от продолжительности гидролиза
После стадии инактивации пепсина пробы подвергали осветляющей и стерилизующей фильтрации. Кроме этого для проб 7-9 проводили центрифугирование в пробирках с фильтрующими пластинами на 30 кДа.
По результатам ВЭЖХ в образцах 1-6 присутствовали два основных пика: первый соответствовал агрегатам с высокой молекулярной массой, второй - пептидам с низкой молекулярной массой. По калибровочному графику с помощью аппроксимации определили, что пик с временем удерживания 27,3 мин соответствует молекулярной массе около 6 кДа.
Рис. 6. Хроматограммы образцов 6, 2, 4. Наивысший пик соответствует пробе 6 после 42 ч гидролиза с концентрацией пепсина 2,0 мг/мл; далее в порядке убывания: проба 2 - после 18 ч гидролиза, 1,0 мг/мл пепсина; проба 4 - после
42 ч гидролиза, 0,3 мг/мл пепсина
0
Таким образом, в результате проведенного исследования была получена субстанция с молекулярной массой менее 6,5 кДа, которая в дальнейшем будет изучена на биологическую активность.
Выводы:
1. Проведен анализ воздействия ультразвука на белковую суспензию. Показано, что концентрация белка после ультразвукового воздействия может как увеличиваться, так и уменьшаться.
2. Выполнена очистка суспензии от липидов и липопротеидов с помощью хлороформа, подобрана его оптимальная концентрация -10 % по объему.
3. Проведен анализ воздействия 8 М мочевины на белковую суспензию. Показано, что мочевина способствует образованию агрегатов белков. Увеличение температуры пробы при воздействии УЗ способствует возрастанию агрегатов молекул.
4. Проведен ферментативный гидролиз под действием пепсина при варьировании его концентрации и продолжительности процесса. Подобраны оптимальные условия гидролиза: 72 ч с концентрацией пепсина 1,0 мг/мл.
Список литературы
1. Афанасьева Т.М. Противостифилококковый препарат «Стафилолей-кин»: технология, иммунобиологическая характеристика: автореф. дис. ... канд. фарм. наук. - М., 2017. - 22 с.
2. Байбулатова Н.Ф., Волкова Л.В. Получение новых многофункциональных продуктов из белковых отходов производства препаратов крови // Всероссийская олимпиада студентов вузов по молекулярной и клеточной биоинженерии / МФТИ. - М., 2009.
3. Волкова Л.В. Биотехнология изготовления препаратов крови человека: учеб. пособие. - Пермь: Изд-во Перм нац. исслед. политехи. ун-та, 2018. - 115 с.
4. Максимова Е.М. Разработка технологии утилизации белковых отходов методом ферментативного гидролиза // Вестник МГТУ. - 2006. - № 5. -С. 875-879.
5. Мальгина Д.Ю. Разработка технологии гемодеривата из отхода производства интерферона и перспективы его использования: автореф. дис. ... канд. фарм. наук. - М., 2014. - 21 с.
6. Мац А.Н., Боков М.Н., Кузьмина М.Н. Концепция низкомолекулярных антигенспецифичных цитокинов и ее новые практические приложения // Аллергология и иммунология. - 2008. - № 4. - С. 444-447.
7. Мелихова А.В. Разработка технологии приготовления сухих дозированных форм комплексного иммуноглобулинового препарата: автореф. дис. ... канд. биол. наук. - М., 2010. - 31 с.
8. Миронов А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.
9. Effect of ultrasound on the physical and functional properties of reconstituted whey protein powders / Bogdan Zisu, Judy Lee, Jayani Chandrapala, Raman Bhaskaracharya, Martin Palmer, Sandra Kentish, Muthupandian Ashokkumar // Journal of Dairy Research. - 2011. - № 78 (2) - Р. 226-232.
10. Effect of ultrasound treatment on particle size and molecular weight of whey proteins / Anet Rezek Jambrak, Timothy J. Mason, Vesna Lelas, Larysa Paniwnyk Zoran Herceg // Journal of Food Engineering. - 2014. - № 121. - P. 15-23.
11. Научно-методические подходы к развитию технологии белковых гидролизатов для специального питания. Часть 2. Функциональные свойства белковых гидролизатов, зависящие от специфичности протеолитических процессов / Ю.Я. Свириденко, Д.С. Мягконосов, Д.В. Абрамов, Е.Г. Овчинникова // Пищевая промышленность. - 2017. - № 6. - С. 50-53.
12. Толочко Н.К., Прокопьев Н.А., Челединов А.Н. Перспективы ультразвуковой обработки молока // Молочная промышленность. - 2014. - № 8 -
C.28-30.
13. Пат. 2371200 Рос. Федерация. Способ получения иммуноглобули-нового препарата / А.В. Мелихова, В.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин, И.Ю. Да-выдкин. - Опубл. 27.10.2009.
14. Безотходные технологии в производстве гетерологичного антира-бического иммуноглобулина / И.М. Жулидов, Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, М.В. Антонычева, И.В. Шульгина, О.А. Лобовикова, Н.И. Вахрушин [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - Вып. 110. - С. 80-84.
15. Саломатов А.С. Исследование влияния гидротермической обработки на усвоение белков перловой крупы // Вестник ЮУрГУ. Пищевые и биотехнологии. - 2014. - № 4. - С. 70-76.
References
1. Afanas'eva T.M. Protivostifilokokkovyj preparat «Stafilolejkin»: tehnologija, immunobiologicheskaja harakteristika [Antisyphylococcal drug "Staphyloleukin": technology, immunobiological characteristics]. Abstract of Ph.
D. thesis. Moscow, 2017, 22 p.
2. Bajbulatova N.F., Volkova L. V. Poluchenie novyh mnogofunkcional'nyh produktov iz belkovyh othodov proizvodstva preparatov krovi [Obtaining new multifunctional products from protein waste from the production of blood preparations]. Vserossijskaja olimpiada studentov VUZov po molekuljarnoj i kletochnoj bioinzhenerii (5-28 nojabrja 2009 godaMFTI). Moscow, 2009.
3. Volkova L.V. Biotehnologija izgotovlenija preparatov krovi cheloveka [Biotechnology for the manufacture of human blood products]. Perm'. Perm nac. issled. politehn. un-ta, 2018, 115 p.
4. Maksimova E.M. Razrabotka tehnologii utilizacii belkovyh othodov metodom fermentativnogo gidroliza [Development of technology for the disposal of protein waste by the method of enzymatic hydrolysis]. Vestnik Moskovskij gosudarstvennyj tehnicheskij universitet. 2006, no. 5, pp. 875-879.
5. Mal'gina D.Ju. Razrabotka tehnologii gemoderivata iz othoda proizvodstva interferona i perspektivy ego ispol'zovanija [Development of hemoderivat technology from waste products of interferon and the prospects for its use]. Ph. D. thesis. Moscow, 2014. 21 p.
6. Mac A.N., Bokov M.N., Kuz'mina M.N. Koncepcija nizkomolekuljarnyh antigenspecifichnyh citokinov i ejo novye prakticheskie prilozhenija [The concept of low molecular weight antigen-specific cytokines and its new practical applications]. Allergologija i immunologija. 2008, no. 4, pp. 444-447.
7. Melihova A.V. Razrabotka tehnologii prigotovlenija suhih dozirovannyh form kompleksnogo immunoglobulinovogo preparata [Development of technology for the preparation of dry dosage forms of a complex immunoglobulin preparation]. Ph. D. thesis. Moscow, 2010, 31 p.
8. Mironov A. N. Rukovodstvo po provedeniju doklinicheskih issledovanij lekarstvennyh sredstv. Chast 1. [Guidelines for conducting preclinical studies of drugs. Part 1]. Moscow, Grif i K, 2012, 944 p.
9. Bogdan Zisu, Judy Lee, Jajani Chandrapala, Raman Bhaskaracharja, Martin Palmer, Sandra Kentish, Muthupandian Ashokkumar. Effect of ultrasound on the physical and functional properties of reconstituted shhhey protein poshhders. Journal of Dairy Research. 2011,78(2), pp. 226-232.
10. Anet Rezek Jambrak, Timothy J. Mason, Vesna Lelas, Larysa Panishhnyk Zoran Herceg. Effect of ultrasound treatment on particle size and molecular shheight of shhhey proteins Journal of Food Engineering. 2014,121, pp. 15-23.
11. Sviridenko Ju. Ja., Mjagkonosov D. S., Abramov D. V., Ovchinnikova E. G. Nauchno-metodicheskie podhody k razvitiju tehnologii belkovyh gidrolizatov dlja special'nogo pitanija. Chast 2. Funkcional'nye svojstva belkovyh gidrolizatov, zavisjashhie ot specifichnosti proteoliticheskih processov. [Scientific and methodological approaches to the development of technology of protein hydrolysates for special nutrition. Part 2. Functional properties of protein hydrolysates, depending on the specificity of proteolytic processes]. Pishhevaja promyshlennost. 2017, no. 6, pp. 50-53.
12. Tolochko N.K., Prokop'ev N.A., Cheledinov A.N. Perspektivy ul'trazvukovoj obrabotki moloka. [Prospects for ultrasonic processing of milk]. Molochnajapromyshlennost'. 2014, no. 8, pp. 28-30.
13. Melihova A.V., Davydkin V.Ju., Aleshkin V.A., Davydkin I.Ju. Sposob poluchenija immunoglobulinovogo preparata. [A method of obtaining an immunoglobulin preparation]. Pat. Ros. Federacija 2371200, 27.10.2009.
14. Nikiforov A.K., Zhulidov I.M., Abramova E.G., Antonycheva M.V., Shul'gina I.V., Lobovikova O.A., Vahrushin N.I. et al. Bezothodnye tehnologii v
proizvodstve geterologichnogo antirabicheskogo immunoglobulina. [Waste-free technologies in the production of heterologous anti-rabies immunoglobulin]. Problemy osobo opasnyh infekcij. 2011, vypusk. 110, pp. 80-84.
15. Salomatov A.S. Issledovanie vlijanija gidrotermicheskoj obrabotki na usvoenie belkov perlovoj krupy [Investigation of the influence of hydrothermal treatment on the assimilation of pearl barley proteins]. Vestnik Juzhno-Ural'skij gosudarstvennyj universitet. Ser. Pishhevye i biotehnologii. 2014, no. 4. pp. 70-76.
Получено 28.03.2021
Об авторах
Волкова Лариса Владимировна (Пермь, Россия) - доктор медицинских наук, профессор кафедры биотехнологии Пермского национального исследовательского политехнического университета (614990, г. Пермь, Комсомольский пр., 29, e-mail: wolkowalw@mail.ru).
Ратегова Елена Петровна (Пермь, Россия) - магистрант Пермского национального исследовательского политехнического университета (614990, г. Пермь, Комсомольский пр., 29, e-mail: rategova.l@mail.ru).
Корнилова Екатерина Вячеславовна (Пермь, Россия) - аспирант кафедры биотехнологии Пермского национального исследовательского политехнического университета (614990, г. Пермь, Комсомольский пр., 29, e-mail: EkaterinaKornilova95@yandex.ru).
About the authors
Larisa V. Volkova (Perm, Russian Federation) - Doctor of Medical Sciences, Professor of the Department of Biotechnology, Perm National Research Polytechnic University (29, Komsomolsky av., Perm, 614990; e-mail: wolkowalw@mail.ru).
Helena P. Rategova (Perm, Russian Federation) - Undergraduate Student Perm National Research Polytechnic University (29, Komsomolsky av., Perm, 614990, e-mail: rategova.l@mail.ru).
Ekaterina V. Kornilova (Perm, Russian Federation) - Postgraduate Student of the Department of Biotechnology, Perm National Research Polytechnic University (29, Komsomolsky av., Perm, 614990; e-mail: EkaterinaKornilova95@yandex.ru).
