CC BY
107
УДК 577.15
Разработка технологии производства гидролизатов сывороточных белков молока с использованием мембранной техники.
Часть 2. Оптимизация технологических режимов производства гидролизатов сывороточных белков молока в ферментативном мембранном реакторе
Ю. Я. Свириденко, д-р биол. наук, академик РАН; Д. С. Мягконосов, канд. техн. наук; Д. В. Абрамов, канд. биол. наук; Е. Г. Овчинникова
Всероссийский научно-исследовательский институт маслоделия и сыроделия, г. Углич, Ярославская обл.
Ферментативный гидролиз сывороточных белков молока - хорошо известный метод модификации
Рис. 1. Схема ферментативного мембранного реактора: 1 - емкость с субстратом для гидролиза; 2 - кран с переливным клапаном, 3 - ферментативный реактор, 4 - рециркуляционный насос; 5, 10 - измеритель давления; 6 - расходомер; 7 - теплообменник; 8 - мембранный модуль; 9 - кран сброса ретентата; С - субстрат; Г - гидролизованный субстрат; П - поток пермеата, Р - поток ретентата
их функциональных свойств: растворимости, вязкости, эмульгирующих и пенообразующих свойств, и, что более важно, повышения их биологической ценности в результате расщепления белка на фрагменты разной молекулярной массы [1]. Ги-дролизаты сывороточных белков рассматриваются как идеальные компоненты для создания заменителей женского молока, вследствие их высокой пищевой ценности, низкой степени горечи и низкой остаточной антигенности.
Антигенные реакции вызываются наличием в нативных белках специфических анпоследовательностей аминокислот (эпитопов), которые были выявлены, в частности, в бета-лактоглобулине, основном белке молочной сыворотки [2]. Посредством применения соответствующих протеаз, такие последовательности аминокислот могут быть разрушены, а остаточная антигенность белков понижена. К сожалению, антигенная структура пептидов может сохраняться незатронутой даже после обширного гидролиза. Эта проблема может быть решена с помощью технологии мембранной фильтрации, позволяющей разделить гидроли-зат на короткоцепочечные пептиды с расщепленными эпитопами и содержащие антигенные последовательности - длинноцепочечные пептиды.
В результате мембранной фильтрации, возможна очистка гидролизата не только от содержащих негидроли-зованные эпитопы пептидов, но также и от остатков негидролизованного сывороточного белка и фермента. В результате отпадает необходимость в жесткой температурной обработке гидролизата, традиционно применяемой для инактивации ферментов и перевода остатков негидроли-зованного белка в нерастворимую форму. За счет этого сокращается образование нежелательных побочных примесей, возникающих при высокой температуре из-за реакции свободных аминокислот с содержащимися в гидролизате остаточными количествами лактозы, солей и кислот (продукты реакций Штрекера и Майяра и ряд других веществ). Эти примеси снижают биологическую ценность гидролизатов и придают нежелательные вкусовые оттенки [3].
Во Всероссийском НИИ маслоделия и сыроделия проводятся работы по созданию технологии гидролизата сывороточных белков, обладающих низкой остаточной антигенностью и улучшенными органолептическими свойствами с применением ферментативного мембранного реактора. Ферментативный мембранный реактор является специфической технологией, обеспечивающей непрерывный процесс ферментативного преобразования субстрата, при котором фермент отделяется от продукта реакции при помощи специальной селективной мембраны [4] (рис. 1).
Главная цель разработки технологии мембранного реактора - полное отделение фермента с целью сохранения его в активном состоянии внутри активной зоны реактора. Основным преимуществом технологии ги-
дролиза с применением мембранных реакторов является то, что она позволяет экономно использовать фермент и регулировать молекулярный состав продуктов гидролиза путем подбора мембран с советующим порогом отсечения по молекулярной массе.
Для гидролиза белка использо-валиферментныйпрепарат Alcalase 2.4L (Novozymes A/S, Дания). Было изучено влияние селективности используемых мембран (5, 10 и 20 кДа) на массообменные процессы в системе ферментативного мембранного реактора в ходе гидролиза, а также на свойства получаемого гидролиза-та. Молекулярно-массовое распределение в гидролизатах определяли с помощью метода гель-фильтрафии высокого разрешения на колонке Superose 12 (GE Healthcare) на базе комплекса лабораторного оборудования компаний LKB и Amersham Pharmacia. Детектирование разделяемых азотистых фракций осуществляли на УФ-детекторе при длине волны 280 нм.
На начальной стадии исследований были проведены эксперименты, направленные на воспроизведение технологии гидролиза в мембранном реакторе, описанной в иностранной научно-исследовательской и патентной литературе [4, 5, 6]. Было установлено, что процесс, предусматривающий гидролиз белка, совмещенный с отделением продуктов гидролиза на ультрафильтрационных мембранах, приводит к получению профильтрованного гидролизата с низким содержанием сухого вещества (< 1,5%). Реализация такой технологии не будет эффективна в промышленных масштабах, поскольку повлечет за собой высокие энергетические затраты на концентрирование и высушивание продукта и приведет к заметному удорожанию его себестоимости.
Одной из причин получения профильтрованного гидролизата с низким содержанием сухого вещества является низкий порог отсечения по молекулярной массе (5 и 10 кДа) у использованных в ходе опытов мембран. В результате часть продуктов гидролиза задерживается селективными мембранами при фильтрации и остается в составе ретентата. В сравнении с исходным гидроли-затом в фильтрате доля низкомолекулярных фракций возрастает, а в ретентате - снижается. Повышение содержания низкомолекулярных фракций в продукте приводит в повышению его осмоляльности
Рис. 2. Схема технологического процесса получения гидролизата в мембранном реакторе
и ухудшению вкуса [3, 7]. Другим отрицательным результатом от использования в составе мембранного реактора мембран с низким порогом отсечения по молекулярной массе (< 10 кДа) является снижение скорости фильтрации продукта, а также повышение трансмембранного давления. Повышенное трансмембранное давление способствует ускоренному образования концентрационно-поляризационного слоя на поверхности мембраны и закупориванию пор мембраны, что приводит к еще большему снижению скорости фильтрации [8].
Анализ научной литературы по вопросам производства гидролизатов в мембранных реакторах показал, что наиболее важным параметром для выбора порога отсечения мембран служит молекулярная масса фермента, применяемого для гидролиза белка. Отобранный для гидролиза сывороточных белков ферментный препарат Alcalase представляет собой бактериальный субтилизин (продуцент Bacillus licheniformis), состоящий из двух фракций с молекулярной массой около 24 и 27 кДа [7]. Для отделения частиц с такой молекулярной массой достаточно будет использовать мембраны с селективностью по молекулярной массе 20 кДа. В работе [9] установлено, что молекулярно-массовое распределение в гидролизатах, полученных
в мембранном реакторе, оборудованном мембранами селективностью в 3 или 30 кДа, существенно не различалось. Эти данные позволили сделать вывод, что применение мембран с порогом отсечения по молекулярной массе 20 кДа не ухудшит свойств получаемого гидролизата. Вместе с тем, использование таких мембран позволит существенно снизить трансмембранное давление и устранит условия для быстрого возникновения концентрационно-поляризационного слоя на поверхности мембраны и закупорки пор мембраны.
На основании проведенных экспериментов и литературных данных была разработана схема технологического процесса получения гидролизата сывороточных белков в мембранном реакторе, обеспечивающая получение гидролизата с высоким выходом и требуемыми функциональными свойствами (рис. 2).
Процессы гидролиза и фильтрации по разработанной технологии осуществляют раздельно, что позволяет проводить каждый из процессов при оптимальных условиях. Для начала в ферментативном реакторе проводят гидролиз белка до накопления максимального количества продуктов гидролиза. Далее, продукты гидролиза отделяют от гидроли-зованной смеси при помощи ультрафильтрации на мембранах с порогом отсечения 20 кДа. После фильтрации
Ш
Молекулярная масса, кДа
Молекулярная масса, кДа б
Рис. 3. Молекулярно-массовое распределение после разделения гидролизата сывороточных белков на мембране с порогом отсечения по молекулярной массе 20 кДа: а - в гидролизате, б - в ретентате и пермеате
а
остающийся внутри мембранного реактора непрофильтрованный остаток (ретентат), содержащий ферментный препарат, остатки негидролизованно-го белка и пептиды с молекулярной массой, превышающей порог отсечения мембраны, пополняют свежим раствором субстрата и технологический цикл «гидролиз-фильтрация» повторяется.
Гидролиз проводили при помощи ферментного препарата Alcalase 2.4L в соответствии с установленными ранее оптимальными параметрами гидролиза (концентрация субстрата S = 4,5%; доза внесения фермента E = 0,5 %, температура гидролиза 65 °С, продолжительность гидролиза 60 мин). Начальную кислотность ферментационной смеси устанавливали на уровне 10,0 ед. рН и в процессе гидролиза не регулировали. Разделение продуктов гидролиза проводили на установке, оборудованной мембранами GR61PP 20,000 MWCO (Alfa Laval Corporate AB, Швеция), с порогом отсечения мембран по молекулярной массе 20 кДа.
Из анализа профилей молекулярно-массового распределения гидролиза-тов и продуктов, полученных в результате мембранного разделения (рис. 3), следует, что при мембранном разделении ферментативной смеси мембраной задерживаются остатки негидролизованного белка и некоторое количество продуктов гидролиза. Это приводит к снижению выхода гидролиза. Для повышения выхода гидролизата осуществлялась 2-кратная диафильтрация непро-фильтрованного остатка. Использование диафильтрации позволило увеличить выход готового продукта
в среднем на 6%, подняв его с 70-75 до 76-81%.
Полученный по разработанной технологии гидролизат сывороточных белков имел степень гидролиза 18-25%; массовую долю зольного остатка 6,5-6,9 %; осмоляльность 10 %-ного раствора гидролизата -280-300 ммоль/л воды; остаточную антигенность - менее 2х10-5 от массы белкового компонента. Вкус 10%-ного водного раствора гидролизата характеризовался как чистый, умеренно горький, без посторонних привкусов.
В результате проведенных исследований были получены уточненные параметры технологии гидролиза в мембранном реакторе. Благодаря этому удалось получить гидролизат без примесей нерасщепленного белка и фермента, что позволило использовать щадящие режимы пастеризации гидролизата (68 °С на протяжении 30 мин) и избежать образования нежелательных продуктов, ухудшающих вкус и снижающих биологическую ценность гидролизата. Степень анти-генности гидролизата позволяет применять его в продуктах лечебного назначения на основе аминокислотных смесей и ферментативных ги-дролизатов белка, когда совокупная доля антигенов не должна превышать 10-5-10-6 от массы белкового компонента [10]. Осмоляльность гидролизата находится на уровне аналогичного показателя для грудного молока (300±2,9 ммоль/л воды) [11].
ЛИТЕРАТУРА
1. Mahmoud, M. I. Physicochemical and functional properties ofprotein hydrolysates in nutritional products/M. I. Mahmoud // Food Technology. - 1994. - № 48 (10). -P. 89-95.
2. Cheison, S. C. Bioactive milk peptides: Redefining the food-drug interphase -review/S. C. Cheison, Z. Wang // African Journal of Food, Nutrition Science, Agriculture and Development. - 2003. -№ 3 (1). -P. 29-38.
3. Leksrisompong, P. P. Characterization of Flavor of Whey Protein Hydrolys ates/P. P. Leksrisompong, R. E. Miracle, M.-A. Drake // J . Agric. Food Chem. - 2010. - № 58 (10). -Р. 63186327.
4. Guadix, A. Production of whey protein hydrolysates with reduced aliergenicity in a stable membrane reactor / A. Guadix, F. Camacho, E. M. Guadix // Journal of Food Engineering. - 2006. -№ 72. - P. 398-405.
5. Cheison, S. C. Use of response surface methodology to optimise the hydrolysis of whey protein isolate in a tangential flow filter membrane reactor/ S. C. Cheison, Z. Wang, S.-Y. Xu // Journal of Food Engineering. - 2007. - № 80 (4). -P. 1134-1145.
6. Samuelsson, E.-G., Poulsen, O. M. Peptide preparation, a process for producing it and use of the peptide preparation / E.-G. Samuelsson, O. M. Poulsen. - US Patent № 5112812, 1992.
7. Doucet, D. E n zy m e-In d uce d Gelation of Extensively Hydrolyzed Whey Proteins by Alcalase: Peptide Identification and Determination of Enzyme Specificity/D. Doucet [et al] // J. Agric. Food Chem. - 2003. - № 51. -P. 6300-6308.
8. Cheison, S. C. Hydrolysis of whey protein isolate in a tangential flow filter membrane reactor: I. Characterisation of permeate flux and product recovery by multivariate data analysis // S. C. Cheison, Z. Wang, S.-Y. Xu // Journal of Membrane Science. - 2006. -№ 255 (1-2). -P. 45-56.
9. Chiang, W.-D. Functional properties of soy protein hydrolysate produced from a continuous membrane reactor sys-tem/W.-D. Chiang, C.-J. Shih, Y.-H. Chu // Food Chemistry. - 1999. - №65. - P. 189-194.
10. Боровик, Т. Э. Профилактика пищевой аллергии у детей первого года жизни./Т. Э. Боровик [и др.] // Тезисы докладов научно-практ. конф. «Питание здорового и больного ребенка. Современные аспекты». - Красноярск, 2003. -С. 17-19.
11. Tomarelli, R. M. Osmolality, osmolality, and renal solute load of infant formulas/R. M. Tomarelli // J Pediatr. -1976. - № 88. - P. 454-456.
REFERENCES
1. Mahmoud M. I. Physicochemical and functional properties of protein
hydrolysates in nutritional products. Food Technology, 1994, no. 48 (10), pp. 89-95.
2. Cheison S. C., Wang Z. Bioactive milk peptides: Redefining the food-drug interphase - review. African Journal of Food, Nutrition Science, Agriculture and Development, 2003, no. 3 (1), pp. 29-38.
3. Leksrisompong P. P., Miracle R. E., Drake M. A. Characterization of Flavor of Whey Protein Hydrolysates. J. Agric. Food Chem., 2010, no. 58 (10), pp. 63186327.
4. Guadix A., Camacho F., Guadix E. M. Production of whey protein hydrolysates with reduced aUergenicity in a stable membrane reactor. Journal of Food Engineering, 2006, no. 72, pp. 398-405.
5. Cheison S. C., Wang Z., Xu S.-Y. Use of response surface methodology to optimise
the hydrolysis of whey protein isolate in a tangential flow filter membrane reactor. Journal of Food Engineering, 2007, no. 80 (4), pp. 1134-1145.
6. Samuelsson E. G., Poulsen 0. M. Peptide preparation, a process for producing it and use of the peptide preparation. Patent US № 5112812, 1992.
7. Doucet D. et al. Enzyme-Induced Gelation of Extensively Hydrolyzed Whey Proteins by Alcalase: Peptide Identification and Determination of Enzyme Specificity. J. Agric. Food Chem., 2003, no. 51, pp. 6300-6308.
8. Cheison S. C., Wang Z., Xu S.-Y. Hydrolysis of whey protein isolate in a tangential flow filter membrane reactor: I. Characterisation of permeate flux and product recovery by multivariate data
analysis. Journal of Membrane Science, 2006, no. 255 (1-2), pp. 45-56.
9. Chiang W. D., Shih C.-J., Chu Y.-H. Functional properties of soy protein hydrolysate produced from a continuous membrane reactor system. Food Chemistry, 1999, no. 65, pp. 189-194.
10. Borovik T. E. et al. [Prevention of food allergy in children of the first year of life]. Tezisy dokladov nauchno-prakt. konf. «Pitanie zdorovogo i bol'nogo rebenka. Sovremennye aspekty» [Proc. Scientific and practical conf. "Eating a healthy and sick child. Modern aspects"]. Krasnoyarsk, 2003, pp. 17-19. (In Russ.)
11. TomareUi R. M. Osmolality, osmolarity, and renal solute load of infant formulas.J Pediatr, 1976, no. 88, pp. 454-456.
Разработка технологии производства гидролизатов сывороточных белков молока с использованием мембранной техники. Часть 2. Оптимизация технологических режимов производства гидролизатов сывороточных белков молока в ферментативном мембранном реакторе
Ключевые слова
антигенность; гидролиз; мембраны; молочные белки; специальное питание; сывороточные белки, ферментные препараты
Реферат
В статье изложена технология получения гидролизатов сывороточных белков путем гидролиза субстрата в ферментативном мембранном реакторе. Разработка технологии является одним из передовых направлений биотехнологии переработки пищевого сырья. При помощи гидролиза может быть получены продукты улучшенного состава, обладающие высокой степенью усвоения, пониженной антигенностью и хорошими вкусовыми качествами. Во Всероссийском НИИ маслоделия и сыроделия (г. Углич) проводятся исследования по созданию технологии гидролизатов сывороточных белков с регулируемым пептидным составом на базе ферментативного мембранного реактора. В ходе работы получены данные по параметрам процесса гидролиза сывороточных белков и технологии мембранного разделения продуктов гидролиза, использованные для оптимизации технологии гидролиза в мембранном реакторе. Установлено, что описываемый иностранными исследователями процесс, предусматривающий гидролиз белка, совмещенный с мембранным разделением продуктов гидролиза, приводит к получению гидролизата с низким содержанием сухого вещества (менее 1,5%). Это увеличивает энергетические затраты на концентрирование и высушивание продукта и повышает его себестоимость. Более рациональным является метод с предварительным накоплением максимального количества продуктов гидролиза в ферментативной среде с последующим мембранным разделением на очищенный гидролизат (пермеат) и нерастворимый остаток (ретентат). В ходе экспериментов подобран тип селективных мембран (с порогом отсечения мембран по молекулярной массе 20 кДа), обеспечивающий очистку гидролизата от остатков негидролизованного белка и используемого для гидролиза белка ферментного препарата А1са!аБе 2.4 L. Получаемый по разработанной технологии гидролизат обладает низкой осмоляльностью (280-300 ммоль/л воды), низкой остаточной антигенностью (менее 2х10-5 от массы белкового компонента) и практически нейтральным вкусом.
Авторы
Свириденко Юрий Яковлевич, д-р биол. наук, профессор, академик РАН,
Мягконосов Дмитрий Сергеевич, канд. техн. наук, Абрамов Дмитрий Васильевич, канд. биол. наук, Овчинникова Елена Григорьевна Всероссийский научно-исследовательский институт маслоделия и сыроделия, 152613, Ярославская обл., г. Углич, Красноармейский бульвар, д. 19, uglich-cheese@mail.ru
Development of manufacturing processes of whey protein hydrolyzates using membrane technology. Part 2. Optimizing process conditions for producing whey protein hydrolysates in an enzymatic membrane reactor
Key words
antigenicity; hydrolysis; membranes; milk proteins; special nutrition; whey proteins; enzyme preparations
Abstracts
The article presents the data of the derivation of whey protein hydrolyzates by means of substrate hydrolysis in the tangential flow filter enzyme membrane reactor. The hydrolysis technology development of food raw materials in the enzymatic membrane reactor is one of the leading areas of biotechnology processing of food raw materials. Using the hydrolysis it is possible to get the products of improved composition, having a high degree of digestibility with neutralized antigenic sequences, contained in the native protein, and with a lack of taste defects. In All-Russian R&D Institute of Butter and Cheesemaking investigations of the technology creation of whey protein hydrolysates with adjustable peptide structure, implemented on the basis of the enzymatic membrane reactor, are carried out. During the investigations, the data of the processes parameters of whey protein hydrolysis and membrane separation of the hydrolysis products used to optimize the hydrolysis in the membrane reactor technology were obtained. It was found that recommended by international researchers the process, involving the protein hydrolysis, combined with a membrane separation of the hydrolysis products, results in a hydrolysate with a low content of dry matter (<1.5%) which increases the energy costs for concentrating and drying the product as well as its expensive cost. It was admitted that more rational method was a method with a preliminary accumulation of the maximum number of hydrolysis products in the fermentation medium with a further membrane separation into purified hydrolysate (permeate) and the insoluble residue (retentate). The experiments enabled selecting a type of selective membranes (with a membrane cut-off threshold by a molecular mass of 20 kDa) that would ensure hydrolysate purification from non-hydrolysed protein residue and its use for hydrolysis of the protein of enzyme preparation Alcalase 2.4L. The hydrolysate obtained with the technology developed has low osmolality (280-300 mmol/L water in a 10% hydrolysate solution), a low residual antigenicity (less than 2x10-5 of the protein component mass) and a neutral flavour.
Authors
Sviridenko Yuriy Yakovlevich, Doctor of Biological Science, Professor, Academician o f RAS,
Myagkonosov Dmitry Sergeevich, Candidate of Technical Science, Abramov Dmitry Vasilievich, Candidate of Biological Science, Ovchinnikova Elena Grigoryevna
All-Russian Scientific Research Institute of Butter and Cheese Making, 19, Krasnoarmeysky Bulvar, Uglich, Yaroslavl region, 152613, uglich-cheese@mail.ru
