CC BY
17Вестник АПК
Ставрополья Ветеринария - -:№ 3(11), 2013. " "
УДК 576.3:573.6:636.32/.38
Криворучко А. Ю., Беляев В. А., Некрасова И. И., Федота Н. В.
Krivoruchko A. Yu., Belyaev V. A., Nekrasova I. I., Fedota N. V.
ОПЫТ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ФИБРОБЛАСТОВ ОВЦЫ
EXPERIENCE OF CULTIVATION OF SHEEP FIBROBLASTS
Однослойные первичные культуры клеток фибробластов Single-walled primary cell cultures of sheep fibroblasts were
овцы были получены методом трипсинизации. Фибробла- obtained by trypsinization. Fibroblasts of sheep may be used in
сты овец могут быть использованы для различных направ- different areas of biotechnology research. лений биотехнологических исследований.
Ключевые слова: культивирование клеток, фибробла- Key words: cells culturing, fibroblasts, sheep. сты,овцы.
Криворучко Александр Юрьевич -
доктор биологических наук, руководитель научно-диагностического и лечебного ветеринарного центра Ставропольский государственный аграрный университет Тел.: 8-918-881-43-27 E-mail: rcvm@yandex.ru
Беляев Валерий Анатольевич -
доктор ветеринарных наук, профессор кафедры
терапии и фармакологии
Ставропольский государственный
аграрный университет
Тел.: 8-928-313-73-06
E-mail: valstavvet@yandex.ru
Некрасова Ирина Ивановна -
кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры физиологии, хирургии и акушерства Ставропольский государственный аграрный университет Тел.: 8-903-443-05-39, E-mail: irine_nekrasova@mail.ru.
Федота Наталья Викторовна -
кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры
терапии и фармакологии
Ставропольский государственный
аграрный университет
Тел.: 8-962-442-99-01
E-mail: nataliafedota@yandex.ru
Krivoruchko Aleksandr Yurievich -
Doctor of Biological Sciences, Director of Veterinary Scientific, Diagnostic and Treatment Center Stavropol State Agrarian University Tel.: 8-918-881-43-27 E-mail: rcvm@yandex.ru
Belyaev Valery Anatolyevich -
Doctor of Veterinary Medicine, Professor of the Department of Pharmacology and Therapy Stavropol State Agrarian University Tel.: 8-928-313-73-06 E-mail: valstavvet@yandex.ru
Nekrasova Irina Ivanovna -
Ph.D. in Veterinary Medicine, Docent of the
Department of Physiology, Surgery and Obstetrics Stavropol State Agrarian University Tel.: 8-903-443-05-39 E-mail: irine_nekrasova@mail.ru.
Fedota Natalya Viktorovna -
Ph.D. in Veterinary Medicine, Docent of the
Department of Pharmacology and Therapy Stavropol State Agrarian University Tel.: 8-962-442-99-01 E-mail: nataliafedota@yandex.ru
Культивирование и трансплантация фибробластов - область биотехнологии, развивающаяся в последние десятилетия, когда появились методики, обусловившие возможность культивирования отдельных клеток [1, 2].
Существуют реальные перспективы использования фибробластов сельскохозяйственных животных, в частности овец, для различных направлений биотехнологических исследований [3, 4, 5]. Фибробласты могут служить источниками ядер соматических клеток, вводимых в энуклеированный ооцит млекопитающих с целью репрограммирования генома клеток т vit-
го. Культура клеток фибробластов является основой для получения гибридных и реконструированных клеток млекопитающих. На основе культуры клеток фибробластов возможна апробация существующих и совершенствование методов выделения и культивирования эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) сельскохозяйственных животных. На культуре клеток фибробластов проводится апробация и совершенствование методов криоконсервации различных клеток и тканей сельскохозяйственных животных. Фибробласты применяют в качестве тест-объектов при испытании новых фармакологических веществ.
Ж™^™^ |Э естник ЛПК
О Ставрополья
научно-практическии журнал
Целью наших исследований, проведенных на базе научно-диагностического и лечебного центра ветеринарной медицины ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет», было получение однослойных первичных культур клеток фибробластов овцы методом трипсинизации [6]. Исследования проводили по следующей схеме:
1. Биопсия кожи. Фибробласты можно получить из многих тканей и органов. Проще всего - из дермального слоя кожи. Наиболее удобно проводить биопсию кожи у основания ушной раковины животного. Для этого кожу дезинфицировали 70 % этиловым спиртом. После дезинфекции кожу захватывали гемоста-тическим зажимом и скальпелем срезали кусочек кожи над браншами зажима. При правильно проведенной биопсии, захватывающей эпидермис и сосочковый слой кожи, кровотечение минимальное. Отсеченный кусочек погружали в заранее приготовленную пробирку с питательной средой. В качестве питательной среды использовали среду ЭМБМ, в которую добавляли, согласно прописи, антибиотик, L-глутамин и эмбриональную телячью сыворотку (ЭБС).
2. Механическая и ферментативная дезагрегация ткани. Полученный биоптат кожи измельчали на кусочки размером 1-3 мм, отмывали от эритроцитов раствором Хенкса с антибиотиками. Для дезагрегации ткани использовали 0,25 % трипсин. В нем выдерживали кусочки ткани в термостате при температуре 37 0 С в течение 30 мин. В результате получали густую суспензию клеток.
3. Получение первичной культуры фибробластов кожи. Полученную суспензию клеток центрифугировали, осадок ресу-спендировали в 1 мл полной питательной среды и помещали в стерильные пластиковые чашки Петри, которые инкубирова-
ли 72 часа при 37 0 С в атмосфере, содержащей 5 % Со2.
По истечении 72 часов чашки Петри просматривали с помощью инвертированного микроскопа. На дне сосуда появляются единичные фибробласты, которые заметны в виде длинных веретеновидных клеток плоской формы с отростками, прозрачной цитоплазмой и плоским овальным ядром (рис. 1).
Культуру клеток фибробластов инкубировали в СО2-инкубаторе Binder С-150 (Binder, Германия) в течение 3 дней до получения монослоя клеток (рис. 2).
4. Получение линии фибробластов. Для получения линии фибробластов их пересевают. Для этого проводили трипсини-зацию монослоя фибробластов 0,05% трипсином. Ход трипсинизации контролировали, просматривая культуры под микроскопом до появления первых признаков округления и всплытия клеток. Затем быстро нейтрализовали трипсин 2-3 мл раствора Версена (ЭДТА). Аккуратно ре-суспендировали клетки пипеткой. Полученную суспензию клеток переносили в центрифужную пробирку и центрифугировали 5 минут при 1650 об/мин (200 g). Удаляли супернатант, ресуспендирова-ли клетки в ростовой среде и высевали на новые культуральные матрасы.
Ежедневно проводили просмотр культураль-ных сосудов для оценки цвета среды и ее прозрачности. Резкое изменение цвета и появление мути может свидетельствовать о бактериальном или грибковом заражении. Если цвет индикатора среды не изменяется после пересева или сдвигается в сторону малинового, это может быть связано с отсутствием размножения клеток, с недостаточным количеством для данного объема или гибелью. При помощи инвертированного микроскопа оценивали морфологию клеток и слоя в целом. Отсутствие рисунка на субстрате (фибробласты обладают ориен-
«:,S v. * 1 I к* IX,
\ s ■ ■. .J| >\ ft уяя Я J
|; ч ■ JT "' Я Ч ■НЕ -Ж 4.1 б V-' Яб "
.,-.¡2 Л
Рис.1. Единичные фибробласты кожи овцы (увеличение х 400; контраст Хоффмана)
Рис. 2. Монослой фибробластов кожи овцы (увеличение х 400; контраст Хоффмана)
в
естник АПК
Ставрополья
:№ 3(11), 2013!
Ветеринария
141
тированным ростом), появление зернистости в цитоплазме, пустые места в слое клеток свидетельствуют об их дегенерации.
После образования монослоя клеток производили второй пересев (обычно через 3-6 суток). В процессе пересева клеток после трип-синизации подсчитывали общее количество клеток, используя гемоцитометр. Пересевы производят для получения количества клеток, достаточного для цитогенетического или биохимического исследования, а также для криокон-сервации. Клеточный штамм считают установившимся, если после пассирования в течение первых 5 пассажей прирост клеток спустя 3-4
суток после пересева превосходит количество посеянных минимум вдвое.
Нами апробирована и освоена методика культивирования фибробластов кожи овец. Полученные перевиваемые культуры клеток фибробластов кожи овец позволят проводить следующие исследования:
- репрограммирование генома клеток млекопитающих in vitro;
- получение гибридных и реконструированных клеток млекопитающих;
- применение культуры клеток в качестве тест-объектов при испытании новых фармакологических веществ.
Литература
1. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 2002. 306 с.
2. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М. : Мир, 1978.
333 с.
3. Агробиотехнология в мире / под ред. К. Г Скрябина М. : Центр «Биоинженерия» РАН, 2008. 135 с.
4. Дьяконов Л. П., Глухов В. Ф., Поздняков А. А., Денисенко Г Ф., Калмыкова Т. П. Культивирование клеток и тканей животных : учебно-методическое пособие. Ч. 1. Ставрополь, 1986. 96 с.
5. Дьяконов Л. П., Глухов В. Ф., Поздняков А. А., Денисенко Г Ф., Калмыкова Т. П. Культивирование клеток и тканей животных : учебно-методическое пособие. Ч. 2. Ставрополь, 1988. 96 с.
6. Баранова С. П., Вихреев Б. С., Малахов С. В. [и др.]. Культивирование эпителиальных клеток кожи человека // Цитология. 1987. № 9. С. 29.
References
1. Glick B., Pasternak J. Molecular Biotechnology. The Principles and Applying. SpringerVerlag, 2002. 306.
2. Perth S. J. Basics Cultivation of Microorganisms and Cells. M.: Mir, 1978. 333.
3. Agrobiotechnology in the world / ed. by K. G. Skryabin, Moscow, Center «Bio-inzheneriya» RAS, 2008. 135.
4. Deacons L. P., Gluhov V. F., Pozdnyakov A. A., Denysenko G. F, Kalmikova T. P. The Cultivation of Cells and Tissues of Animals. Part 1. Stavropol, 1986. 96.
5. Deacons L. P., Gluhov V. F, Pozdnyakov A. A., Denysenko G. F, Kalmikova T. P. The Cultivation of Cells and Tissues of Animals. Part 2. Stavropol, 1986. 96.
6. Baranova, S. P., Bihreev B. S., Malakhov S. V. [et al.]. Cultivation of Epithelial Cells of Human Skin / / Cytology. 1987. № 9. P. 29.
