CC BY
28
DOI 10.25930/2687-1254/010.4.14.2021 УДК636.32/.38.087.7
ЭФФЕКТИВНОСТЬ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ФИБРОБЛАСТОВ ОВЕЦ НА БЕССЫВОРОТОЧНОЙ СРЕДЕ ГЛА 0,5% С ДОБАВЛЕНИЕМ СТИМУЛЯТОРА РОСТА НА ОСНОВЕ ГИДРОЛИЗАТА КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ
П.А. Шелудько, Н.А. Гвоздецкий
Среди клеток организма животных для культивирования invitro используются фибробласты, представляющие собой клетки соединительной ткани. Их широкое применение в молекулярно-генетических исследованиях обусловлено простым доступомк получению биоматериала и приемлемой ценой. Однако актуальным остается вопрос подбора оптимальной питательной среды для культивирования клеток фибробластов, а также факторов роста, отличающихся низкой стоимостью по сравнению с существующими аналогами. В статье приводятся результаты исследования, направленного наизу-чение влияния стимулятора роста на основе гидролизата куриных эмбрионов для выращивания фибробластов, полученных из отщипа уха овцы породы джалгинский меринос. Культивирование и субкультивирование клеток фибробластов проводилось согласно общепринятым методикам. По результатам проведенной работы оптимально подходящей питательной средой для выращивания культуры фибробластов является гидролизатлактальбумина (ГЛА 0,5%) с добавлением стимулятора роста на основе гид-ролизата куриных эмбрионов, отличающейся высоким содержанием основных источников стимуляции роста клеток.
Ключевые слова: овцеводство, джалгинский меринос, культивирование клеток, питательная среда, фибробласты.
EFFICIENCY OF FIBROBLAST CULTURE OF SHEEP ON A SERUM-FREE LACTALBUMIN HYDROLYZATE 0.5% MEDIUM WITH GROWTH STIMULATOR BASED ON THE HYDROLYSATE OF CHICKEN EMBRYOS
P.A. Sheludko, N.A. Gvozdetsky
Among the cells of the animal body, fibroblasts, which are cells of the connective tissue, are used for in vitro culture. Their widespread use in molecular genetics research is caused by simple access to obtaining biomaterial and an affordable price. However, the problem of choosing the optimal nutrient medium for the fibroblast cells culture, as well as growth factors, which are distinguished by a low cost in comparison with existing analogues, remains relevant. The article presents the results of a research, which is aimed at studying the effect of a growth stimulator based on hydrolyzate of chicken embryos for growing fibroblasts, which are obtained with a biopsy from ear of a Dzhalgin merino sheep. The culture and subculture of fibroblast cells were carried out according to conventional techniques. According to the results of the study, which was carried out, the optimal nutrient medium for growing fibro-blast culture was lactalbumin hydrolyzate 0.5% with growth stimulator based on the hydroly-zate of chicken embryo, which was characterized by a high content of the main sources of cell growth stimulation.
Key words: sheep breeding, Dzhalgin merino, cell culture, nutrient medium, fibro-
blasts.
Введение. Культивирование клеток тканей животных является прогрессирующим направлением в молекулярной биологии и генетике. Наиболее подходящим материалом для культивирования ^кгослужат фибробласты (соединительно-тканные клетки), получаемые путем дезагрегации образца соединительной ткани животного. Данный тип ткани интересен, в первую очередь, своей доступностью, простотой получения и невысокой стоимостью. Однако этот тип клеток имеет ряд недостатков, связанных с ограниченной способностью фибробластов к субкультивированию (4-5 пассажей), а также скоростью клеточной пролиферации, что обусловлено отсутствием системных компонентов регуляции гомеостаза [3, 4].
На сегодняшний день основные потребности фибробластов при культивировании их invitro известны. Основным компонентом сложных химически определенных сред (дМЕМ, а-МЕМ, среда 199, Игла, ГЛА 0,5%) является сыворотка крови КРС либо человека, содержание которой составляет 5-20% от общего состава питательной среды [1]. Наиболее предпочтительна в данном случае фетальная (эмбриональная либо пупо-винная) сыворотка крови. Это отражает, по-видимому, более низкий уровень специализации и наличие реплицирующихся клеток-предшественников [7, 9].
Помимо сыворотки крови в состав основных питательных сред входят субъединичные факторы роста, такие как низкая концентрация ионов Ca , присутствие ФРФ (факторов роста фибробластов FGF 19, FGF 23), цитокины, трансформирующие факторы роста TGF-beta1, TGF-beta2, фактор роста фибробластов FGF-2, содержащийся в сыворотке пуповинной крови человека [8, 10].
Внесение в состав питательной среды отдельных факторов роста позволяет применять при культивировании фибробластов invitroбессывороточные питательные среды. Но такие среды дорогостоящие и имеют сложный химический состав.
В связи с этим стоит задача в поиске и подборе дешевых компонентов, обеспечивающих увеличение пролиферации клеток в культуре, а также их выживаемость [2]. Наибольший интерес в этой области вызывают изоляты и гидролизаты растительного и животного происхождения,внесение которых в питательные среды способствует их обогащению полезными элементами. Такие стимуляторы роста отличаются простотой использования и относительно низкой ценой [5].
Среди продуктов сывороточного протеина наиболее перспективные- эмбриональные изоляты. Наличие большого ассортимента биологически активных веществ, входящего в состав эмбриональных тканей птиц, способствуетрегуляции и повышению пролиферативной активности клеток [2, 6].
Исходя из вышеизложенного, цель настоящей работы заключалась в поиске доступных, экономически выгодных питательных сред, пригодных для культивирования фибробластов овцы. Главной задачей исследования стал подбор необходимых факторов роста для культивирования фибробластов овцы в сывороточных питательных средах.
Материалы и методы исследования. Экспериментальная часть работы проведена на культуре клеток фибробластов, полученной из отщипа уха 12-месячной овцы породы джалгинский меринос. Лабораторные исследования проведены в 2020-2021 гг. на базе лаборатории ФКП «Ставропольская биофабрика».
Для получения гидролизата куриных эмбрионов использовались куриные яйца (10 шт.), инкубированные в течение 10 суток. По завершении инкубации яйца обраба-
тывали спиртовым раствором йода и облучали в течение 15 минут УФЛ. Далее куриные эмбрионы и внеэмбриональные ткани извлекали стерильно и подвергли гомогенизированию. Полученную субстанцию замораживали и лиофилизировали.
Из белоксодержащего лиофилизированногогомогената, полученного путем переработки эмбриональных и внеэмбриональных тканей куриных эмбрионов, методом простой экстракции удаляли липиды и жирорастворимые соединения. Обезжиренный белоксодержащий остаток высушивали в лиофильной сушке.
Культивирование и субкультивирование выполнялисьсогласно общепринятым методикам.
Рост культуры оценивали визуально при помощи светового микроскопа МИБ-Р в течении трех суток культивирования в CO2-инкубаторе MCO-19M(UV) при 37,7оС и 5,1% СО2.
На третьи сутки, при появлении визуально плотного монослоя в каждом из матрасов, культивирование прекращали. Монослой снимали в асептических условиях и производили подсчет клеток в камере Горяева.
Результаты исследования и их обсуждение. В ходе эксперимента полученные культуры клеток были разделены на две группы: контрольную (питательная среда ГЛА 0,5% с добавлением сыворотки КРС (FBS)) и опытную (питательная среда ГЛА 0,5% с добавлением гидролизата куриных эмбрионов (ГКЭ)).
Согласно полученным результатам, в опытной группе на третьи сутки после пассажа наблюдалось значительное увеличение монослоя культуры клеток, по сравнению с контрольной группой (рис. 1).
А Б
Рисунок 1. Культура клеток фибробластов овцы на третьи сутки культивирования в контрольной группе (А) и опытной группе (Б)
Согласно данным таблицы 1, при добавлении в питательную среду стимулятора роста на основе гидролизата куриных эмбрионов наблюдается более высокая концентрация клеток фибробластов на 1 мл среды, по сравнению с контрольной группой (табл. 1). Положительное влияние ГКЭ отразилось и на длительности культивирования. Она составила 68 часов, тогда как на культивированиев стандартной питательной среде ушло 70 часов.
Таблица 1- Результаты получения субкультуры клеток фибробластов овцы
Группа Длительность культивирования Визуальная плотность монослоя Визуальная жизнеспособность клеток Концентрация клеток в мл среды
Контрольная (ГЛА 0,5% + FBS) 70 часов Средняя В поле зрения присутствует не более 1-2% дегенерирующих клеток 750 тыс.
Опытная (ГЛА 0,5% + ГКЭ) 68 часов Высокая В поле зрения мертвые клетки отсутствуют 812 тыс.
Заключение. В ходе проведенного нами исследования была определена наиболее подходящая среда для культивирования фибробластов овцы. Гидролизатлактальбу-мина (ГЛА 0,5%) с добавлением стимулятора роста на основе гидролизата куриных эмбрионов содержит доступный источник основных стимуляторов роста (цитокины, ß-глобулины, факторы роста фибробластов). При этом культура клеток фибробластов, полученная на данной питательной среде, на третьи сутки после первого субкультивирования показала лучшие результаты в части клеточной концентрации и визуальной жизнеспособности клеток.
Литература
8. Конструирование питательных сред на основе ГБСМ /Г.М. Строкина, Л.П. Дьяконов, Т.В. Гальнбек, А.В. Федотов //Тезисы докладов Всесоюзной конференции «Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток» 14-17 окт., Кольцово, Новосибирская обл. 1991. С.12-17.
9. Новые ветеринарные препараты на основе эмбриональных тканей птиц /Л.Д. Тимченко, И.В. Ржепаковский, Д.А. Арешидзе, С.И. Писков, М.Н. Сизоненко. Ставрополь. 2016. С. 39-44.
10. Опыт использования различных способов доставки плазмидных векторов для редактирования гена миостатина в фибробластах овцы с использованием системы CRISPR/CAS9 /А.Ю. Криворучко, М.И. Селионова, О.А. Яцык, Е.Ю. Сафарян, А.В. Мальченко //Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. 2020. №. 4. С. 44-49.
11. Опыт культивирования фибробластов овцы /А.Ю. Криворучко, В.А. Беляев, ИИ. Некрасова, Н.В. Федота //Вестник АПК Ставрополья. 2013. Т. 11. № 3. С. 139-141.
12. Питательная среда для суспензионногоо культивирования клеток млекопитающих /А.К. Елисеев и др. //Патент 2558253. Опубл. Стр.: 6 RU 2 673 718 C1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 27.07.2015. Бюл. №21.
13. Создание и аттестация банков перевиваемой культуры клеток MDCK для производства гриппозной вакцины /И.Ф. Радаева и др. // Вопросы вирусологии. 2005. №2. С. 43-49.
14. Трухан И.С. Питательная среда как ключевой фактор культивирования клеток млекопитающих //Международный журнал прикладных и фундаментальных исследо-
ваний. 2018. № 12-1. С. 165-172.
15. Факторы роста фибробластов FGF19, FGF21, FGF23 как эндокринные регуляторы физиологических функций и геропротекторы. Эпигенетические механизмы регуляции /Б.И. Кузник, В.Х. Хавинсон, Н.С. Линькова, Г.А. Рыжак, Т.С. Салль, С.В. Трофимова //Успехи современной биологии. 2017. Т. 137. №. 1. С. 84-99.
16. Черкасова Е.И., Брилкина А.А. Работа с культурами клеток //Учебно-методическое пособие. Нижний Новгород: Издательство Нижегородского университета. 2015. 57 с.
17. Freshney R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications //John Wiley & Sons. 2015. 680 p.
References
1. Design of culture media based on HPSM / G.M. Strokina, L.P. Dyakonov, T.V. Galnbek, A.V. Fedotov // Abstracts of the All-Union conference "Nutrient media and serums for cell cultivation" October 14-17, Koltsovo, Novosibirsk region. 1991. P. 12-17.
2. New veterinary drugs based on embryonic tissues of birds / L.D. Timchenko, I.V. Rzhepakovsky, D A. Areshidze, S.I. Piskov, M.N. Sizonenko. Stavropol. 2016. P. 39-44.
3. Experiment of using different delivery methods of plasmid vectors for editing the myo-statin gene in sheep fibroblasts using the CRISPR / CAS9 system / A.Yu. Krivoruchko, M.I. Selionova, O.A. Yatsyk, E.Yu. Safaryan, A.V. Malchenko // Bulletin of Kursk State Agricultural Academy. 2020. No. 4. P. 44-49.
4. Experiment of cultivation of sheep fibroblasts / A.Yu. Krivoruchko, V.A. Belyaev, I.I. Nekrasova, N.V. Fedota // Agricultural Bulletin of Stavropol Region. 2013. Vol. 11. No. 3. P. 139-141.
5. Nutrient medium for suspension cultivation of mammalian cells / А.К. Eliseev et al. // Patent 2558253. Publ. Pages: 6 RU 2 673 718 C1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 27.07.2015. Bul. No. 21.
6. Creation and certification of banks of a passaged culture of MDCK cells for the production of influenza vaccine / I.F. Radaeva et al. // Problems of Virology. 2005. No. 2. P. 43-49.
7. Trukhan I.S. Nutrient medium as a key factor in the cultivation of mammalian cells // International Journal of Applied and Fundamental Research. 2018. No. 12 - 1. P. 165-172.
8. Fibroblast growth factors FGF19, FGF21, FGF23 as endocrine regulators of physiological functions and geroprotectors. Epigenetic mechanisms of regulation / B.I. Kuznik, V.Kh. Khavinson, N.S. Linkova, G.A. Ryzhak, T.S. Sall, S.V. Trofimova // Advances in modern biology. 2017. Vol. 137.No. 1.P. 84-99.
9. Cherkasova E.I., Brilkina A.A. Working with cell cultures // Study guide. Nizhny Novgorod: Publishing House of Nizhny Novgorod University. 2015.57 p.
10. Freshney R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications // John Wiley & Sons. 2015.680 p.
Шелудько Петр Алексеевич, аспирант лаборатории геномной селекции и репродуктивной криобиологии в животноводстве, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Северо-Кавказский федеральный научный аграрный центр», г. Ставрополь, [email protected]
Гвоздецкий Николай Алексеевич, ассистент, кандидат ветеринарных наук,старший преподаватель кафедры ,Ставропольский государственный аграрный университет, г. Ставрополь, [email protected]
Sheludko Petr Alekseevich, postgraduate student of the Laboratory of Genomic Selection and Reproductive Cryobiology in Animal Husbandry, Federal State Budgetary Scientific Institution "North Caucasus Federal Agrarian Research Center", Stavropol, [email protected]
Gvozdetskiy Nikolay Alekseevich, Assistant, Candidate of Veterinary Sciences, Senior Lector of Epizootology and Microbiology Department, Stavropol State Agrarian University, Stavropol, [email protected]
