CC BY
35
УДК 602.621
ОПЫТ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБОВ ДОСТАВКИ ПЛАЗМИДНЫХ ВЕКТОРОВ ДЛЯ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНА МИОСТАТИНА В ФИБРОБЛАСТАХ ОВЦЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИСТЕМЫ CRISPR/CAS9
КРИВОРУЧКО А.Ю.,
доктор биологических наук, директор, Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства - филиала ФГБНУ «Северо-Кавказский Федеральный научный аграрный центр», e-mail: rcvm@yandex.ru, тел. 8(8652) 71-70-33.
СЕЛИОНОВА М.И.,
доктор биологических наук, профессор РАН, заведующая лабораторией геномной селекции и репродуктивной криобиологии, Всероссийский научно-исследовательский институт овцеводства и козоводства - филиал ФГБНУ «Северо-Кавказский Федеральный научный аграрный центр», e-mail: m_selin@mail.ru, тел. 8(968)266-33-03.
ЯЦЫК О.А.,
кандидат биологических наук, ветеринарный врач научно-диагностического и лечебного ветеринарного центра Ставропольского государственного аграрного университета, e-mail: malteze@mail.ru, тел. 8(918) 757-14-58.
САФАРЯН ЕЮ.,
кандидат биологических наук, ассистент кафедры кормления животных и общей биологии Ставропольского государственного аграрного университета, e-mail: telegina.helen@yandex.ru, тел. 8(903) 409-24-72.
МАЛЬЧЕНКО А.В.,
аспирант кафедры физиологии, хирургии и акушерства Ставропольского государственного аграрного университета; e-mail: metlyaeva90@mail.ru, тел. 8(918) 887-65-63.
Реферат. В статье приведены данные по результатам использования двух наиболее распространенных способов доставки плазмидных векторов для экспрессии CRISPR/Cas9 при редактировании гена миостатина в фибробластах овцы. Биохимическую трансфекцию клеток проводили с использованием реагента Lipofectamine®. Электропорацию осуществляли на приборе Multiporator 4308 (Eppendorf, Germany) с использованием буфера для электропорации Gene Pulser (BioRad, США). Для сборки редактирующей конструкции использовался коммерческий набор GeneArt® CRISPR Nuclease Vector with OFP Reporter Kit (Thermo Fisher Scientific, США). Целевая последовательность используемой РНК CRISPR гомологична области первого экзона гена миостатина. Эффективность трансфекции фибробластов с использованием метода липофекции и реагента Lipofectamine 3000 была на 16 % выше, чем с использованием метода электропорации и составила 28 %. Использование физического метода трансфекции негативно влияло на выживаемость клеток и отдельные показатели жизнеспособности. В культурах, подвергшихся трансфекции с использованием метода электропорации отмечалось замедленее адгезии клеток и усиленная вакуолизация. Эффективность биохимической трансфекции дермальных фибробластов овцы в нашем эксперименте оказалась близка к эффективности, заявленной производителем трансфеци-рующего агента при работе с дермальными фибробластами человека. Крайне низкая эффективность электропорации вероятно связана с необходимостью оптимизации протокола, поскольку при проведении трансфекции нами использовались параметры продолжительности электрического импульса, напряжения и емкости, предложенные для фибробластов человека. Дальнейшие исследования будут направлены на получение линий мутантных клеток фибробластов с нокаутированным геном миостатина.
Ключевые слова: ген, ДНК, культура, редактирование генома, овцы, маркер-ассоциированная селекция, CRISPR, СAS, генная инженерия.
EXPERIENCE IN USING DIFFERENT DELIVERY METHODS FOR PLASMID VECTORS FOR EDITING THE MYOSTATIN GENE IN SHEEP FIBROBLASTS USING THE CRISPR/CAS9 SYSTEM
KRIVORUCHKO A.Y.,
doctor of Biology Sciences, Director All-Russian Research Institute of Sheep and Goat Breeding -branch of the North Caucasus Federal Scientific Agricultural Center, e-mail: rcvm@yandex.ru, tel. 8(8652) 71-70-33.
SELIONOVA M.I.,
doctor of Biological Sciences, Professor of the RAS, head of the laboratory of genomic selection and reproductive Cryobiology, All-Russian Research Institute of Sheep and Goat Breeding - branch of the North Caucasus Federal Scientific Agricultural Center, e-mail: m_selin@mail.ru, tel. 8(968) 266-33-03
YATSYK OA.,
candidate of Biological Sciences, veterinarian scientific-diagnostic and medical veterinary center Stavropol state agrarian University, e-mail: malteze@mail.ru, tel. 8(918) 757-14-58
SAFARYAN E.Y.,
candidate of Biological Sciences, assistant of the Department of animal feeding and General biology, Stavropol state agrarian University; e-mail: telegina.helen@yandex.ru; tel. 8(903) 409-24-72.
MALCHENKO A.V.,
post-graduate student of department of physiology, surgery and obstetrics Stavropol State Agrarian University, e-mail: metlyaeva90@mail.ru, tel. 8(918) 887-65-63.
Essay. The article presents data on the results of using two most common methods of delivery of plasmid vectors for CRISPR/Cas9 expression when editing the myostatin gene in sheep fibroblasts. Biochemical cell transfection was performed using the Lipofectamine®reagent. Electroporation was performed on a Multiporator 4308 device (Eppendorf, Germany) using a Gene Pulser electroporation buffer (BioRad, USA). A commercial GeneArt®CRISPR Nuclear Vector with OFP Reporter Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) was used to build the editing structure. The target sequence of the crispr RNA used is homologous to the region of the first exon of the myostatin gene. The efficiency of fibroblast transfection using the lipofection method and The lipofectamine 3000 reagent was 16 % higher than using the electroporation method and was 28 %. The use of the physical transfection method negatively affected cell survival and individual viability indicators. In cultures subjected to transfection using the electroporation method, slower cell adhesion and increased vacuolation were observed. The effectiveness of biochemical transfection of sheep dermal fibroblasts in our experiment was close to the effectiveness stated by the manufacturer of the transfecting agent when working with human dermal fibroblasts. The extremely low efficiency of electroporation is probably due to the need to optimize the Protocol, since we used the parameters of the duration of the electric pulse, voltage and capacitance proposed for human fibroblasts when performing the transfection. Further research will be aimed at obtaining lines of mutant fibroblast cells with the knockout myostatin gene.
Keywords: gene, DNA, culture, genome editing, genetic engineering.
Введение. В 2013 году впервые была продемонстрирована возможность использования системы адаптивного иммунитета бактерий CRISPR/Cas9 для направленной модификации генома клеток млекопитающих [1-3]. Относительная простота подбора, синтеза и использования системы CRISPR/Cas9, высокая точность и эффективность привели к ее широкому использованию в самых различных направлениях молекулярной биологии в том числе для но-
sheep, marker-associated selection, CRISPR, SAS,
каута генов влияющих на продуктивность сельскохозяйственных животных [4]. Уже в 2014 году с применением системы CRISPR/Cas9 были получены первые клинически здоровые разнополые ягнята с отредактированной последовательностью гена миостати-на (GDF-8, MSTN, TGF-8) - одного из ключевых регуляторов мышечного роста, ограничивающего дифференцировку и пролиферацию миосателлитов, миобластов и некоторых дру-
гих видов клеток [5-7]. Однако, животные, полученные в данном эксперименте, были генетическими мозаиками и миостатин не был полностью нокаутирован [8]. Ягнята нуль-мутанты по гену миостатина с использованием системы CRISPR/Cas9 были получены только в 2018 году [9,10]. Аналогичные эксперименты проводятся на козах, свиньях и животных других видов по всему миру [11-14]. При получении животных с отредактированным геномом в первую очередь сконструированную систему CRlSPR/Cas9 используют на фибробластах. Делается это как с целью проверки работоспособности редактирующей системы, так и для получения клеток - ядерных доноров для соматического клонирования клеток с отредактированным геномом. Существуют различные способы доставки плазмидных векторов, кодирующих систему CRISPR/Cas9 в фибробласты. Несмотря на то, что по результатам исследований, проведенных на клетках человека и мыши наибольшую эффективность трансфекции отмечают при использовании электропорации [15,16] при работе с фибробластами овцы довольно часто предпочтение отдают биохимической технологии трансфекции, основанной на использовании катионно-липидных реагентов - липофекции [17,18]. В России работы по редактированию гена миостатина в клетках овцы с использованием системы CRISPR/Cas9 ранее не проводились. В связи с этим, целью данной работы является сравнение двух наиболее широко используемых способов доставки плаз-мидных векторов для редактирования гена миостатина в фибробластах овцы с использованием системы CRlSPR/Cas9.
Материал и методы исследования. Получение векторов, кодирующих систему CRISPR/Cas9. Для сборки редактирующей конструкции использовался коммерческий набор GeneArt® CRISPR Nuclease Vector with OFP Reporter Kit (Thermo Fisher Scientific, США). Для направленного клонирования в коммерческую плазмиду была подобрана и синтезирована пара одноцепочечных олигонуклеотидов с хвостами, комплементарными участкам линеаризованного вектора кодирующих целевую РНК CRISPR (целевая последовательность) и два других - их комплементы. Целевые последовательности подбирали с использованием ресурса https://chopchop.cbu.uib.no Для увеличения количества редактирующей конструкции выполняли ее клонирование в компетентных клетках E. Coli One ShotR, поставляемых в составе набора. Все манипуляции на этих этапах выполнялись в соответствии с руководством пользователя и протоколом GeneArt CRISPR
Nuclease Vector Kit (Thermo Fisher Scientific, США). Выделение плазмидной ДНК из клеток E. Coli осуществляли с использованием набора Plasmid Midiprep 2.0 (Евроген, Россия) согласно протоколу. Концентрацию выделенной ДНК проверяли с использованием спектрофотометра NanoPhotometr (Implen, Германия).
Получение линии фибробластов. Для получения фибробластов использовали фрагменты кожи, взятые у основания ушной раковины у двух клинически здоровых овец северокавказской мясо-шерстной породы в возрасте 8 месяцев. Отсеченные фрагменты кожи погружали во флакон с предварительно подогретым до 37 °С фосфатным буфером с добавлением антибактериального препарата пенициллин-стрептомицин (100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина). В течение 30 минут биоптат доставлялся в лабораторию. Механическая и ферментативная дезагрегация ткани, получение первичной культуры фибробластов кожи осуществлялись согласно общепринятым методикам. Для ферментативной дезагрегации использовался 0,25 % в раствор трипсина. Среда для культивирования была приготовлена на основе питательной среды ДМЕМ с глутами-ном и глюкозой 4,5 г/л с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки крови (10 %) и антибактериального препарата (100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина). Фиб-робласты культивировали в питательной среде в СО2-инкубаторе Binder С-150 (Binder, Германия) при 37 °С в атмосфере, содержащей 5 % СО2 в течение 14 суток. При этом на 8-е сутки культивации осуществляли смену среды. При достижении культурой монослоя с конфлю-энтностью 80-90% осуществляли пересев. Для этого клетки снимали с поверхности чашек Петри 0,25% раствором трипсина. Отмывку клеток проводили в два этапа: фосфатным буфером с добавлением антибиотика и средой для культивирования. После отмывки клеточный осадок переносили в 6-луночные планшеты с добавлением среды для культивирования и инкубировали при 37 °С в атмосфере, содержащей 5 % СО2 в течение 3 суток.
В работе использовали питательные среды и реагенты для культур клеток фирмы ПанЭко (Россия), культуральную посуду фирмы Thermo Fisher Scientific (США).
Введение генетических конструкций в фибробласты выполняли с использованием двух различных методов - электропорации (физический) и липофекции (биохимический). Элек-тропорацию осуществляли на приборе Multiporator 4308 (Eppendorf, Germany) одиночным импульсом продолжительностью 25
мс, при напряжении 220В и емкости 960мкФ в кюветах Gene Pulser с зазором 0,2см (BioRad, США). Перед процедурой электропорации клетки дважды отмывали фосфатным буфером, затем ресуспендировали буфером для электропорации Gene Pulser (BioRad, США), плотность клеток составляла 1х106, исходная концентрация плазмидного вектора - 0,5 мкг/мкл. Биохимическую трансфекцию клеток проводили в 6-луночных планшетах с использованием реагента Lipofectamine® 3000 согласно рекомендациям фирмы-производителя (Invitrogen, США) при достижении культурой клеток кон-флюентности 60 %. После трасфекции фиброб-ласты культивировали в питательной среде в СО2-инкубаторе при 37 °С в атмосфере, содержащей 5 % СО2 в течение 2 суток.
Оценку культуры модифицированных клеток выполняли на вторые сутки после проведения трансфекции. Для оценки морфологии клеток культуры просматривали под инвертированным микроскопом GX -71 (Olympus, Япония). Для детекции экспрессии репортер-ного оранжевого флуоресцентного протеина, закодированного в плазмидном векторе и позволяющем судить об эффективности транс-фекции культуры клеток, просматривали под микроскоп BX41 дополненным блоком флуоресценции (Olympus, Япония). Оранжевый флуоресцентный протеин флуоресцирует при длине волны 600 нм. Культуру модифицированных клеток сравнивали как между собой, так и с контрольной культурой, полученной в тех же условиях, но не подвергавшейся транс-фекции.
Результаты исследования. В ходе проведения анализа последовательности первого эк-зона гена миостатина с использованием специализированного электронного ресурса https://chopchop. cbu.uib.no было определено 32 возможных варианта целевых последовательностей с прилегающим NGG мотивом: 17 на прямой цепи и 15 на обратной. Одна из подобранных нами целевых последовательностей совпала с последовательностями из литературных источников [10,19] и имела довольно удачное расположение с точки зрения возможности нарушения работы функциональных доменов кодируемого белка. Она была отобрана для дальнейшей работы. После выбора целе-
вых последовательностей из 18 пар оснований было проведено конструирование специфичных для crRNA олигонуклеотидов с добавлением на 3' конце пяти дополнительных оснований, обеспечивающих направленное клонирование последовательностей в нуклеазный вектор (таблица 1).
В качестве трансфекционного агента для липофекции использовался реагент нового поколения Lipofectamine 3000, обладающий на-более высокой трансфекционной эффективностью по сравнению с реагентами Lipofectamine 2000 и FuGene НО. По данным производителя ожидаемая эффективность трансфекции для клеточной линии фибробластов кожи человека составляет менее 30 %, а для клеточной линии эмбриональных фибробластов мыши - 51-79 % [20]. В нашем исследовании эффективность трансфекции с использованием реагента Lipofectamine 3000 составила 28 %. Использование физического метода трансфекции сопровождалось более низкой эффективностью трансфекции и негативно влияло на выживаемость клеток. Так в культурах, подвергшихся трансфекции с использованием метода элек-тропорации отмечался высокий уровень клеточной смертности с общим снижением основных показателей жизнеспособности, в то время как жизнеспособность клеток, подвергшихся липофекции по сравнению с контрольной практически не изменилась. В культуре, перенесшей процедуру электропорации отмечалось замедленее адгезии клеток. Так при пассаже контрольной культуры на поверхности пластикового культурального матраса без специальной обработки через 30 минут инкубации адге-зированы 24 % фибробластов, а при пассаже клеток после физической трансфекции только 13%. Через 60 минут культивирования контрольной культуры адгезия фибробластов достигала 68%, при культивировании клеток, подвергшихся электропорации только 35 %. В культуре, перенесшей процедуру электропорации (рисунок 1А) на вторые сутки после трансфекции 70 % фибробластов имеют вакуоли, против 25 % в культуре трансфецированной с пользованием липофектамина (рисунок 1Б) и 6 % в контрольной культуре (рисунок 1В).
Таблица 1 - Последовательности синтезируемых ^ олигонуклеотидов
Целевая последовательность (5'- 3') PAM Синтезируемые олигонуклеотиды (5'- 3')
Guide 2 - CTGTGTAATGCATGCTTG TGG CTGTGTAATGCATGCTTGGTTTT
CAAGCATGCATTACACAGCGGTG
А
Б
В
Рисунок 1 - Культуры клеток на вторые сутки после трансфекции: А - культура клеток, подвергшихся электропорации; Б - культура клеток, подвергшихся липофекции; В - контрольная культура клеток
Рисунок 2 - Модифицированные фибробласты при люминесцентной микроскопии
Количество клеток экспрессирующих ре-портерный оранжевый флуоресцирующий протеин через 48 часов после трансфекции в культуре трансфецированной с использованием электропорации составило 12 %, что на 16 % меньше, чем в культуре трансфецированной с использованием липофекции.
Таким образом, в нашей работе метод биохимической трансфекции с использованием реагента Lipofectamine® 3000 оказался более эффективным по сравнению с электропораци-ей. При этом эффективность биохимической трансфекции дермальных фибробластов овцы в нашем эксперименте оказалась близка к эффективности, заявленной производителем
трансфецирующего агента при работе с дер-мальными фибробластами человека (Рисунок 2). Крайне низкая эффективность электропо-рации вероятно связана с необходимостью оптимизации протокола, поскольку при проведении трансфекции нами использовались параметры продолжительности электрического импульса, напряжения и емкости, предложенные для фибробластов человека [21].
Выводы. В проведенном исследовании впервые в России осуществлено редактирование гена миостатина в клетках овцы с использованием системы CRISPR/Cas9. В ходе проведенной работы эффективность трансфекции фибробластов с использованием метода липо-
фекции и реагента Lipofectamine 3000 была на шие исследования будут направлены на полу-16 % выше, чем с использованием метода чение линий мутантных клеток фибробластов электропорации и составила 28 %. Дальней- с нокаутированным геном миостатина.
List of sources used
1. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems / L.Cong, F.A. Ran, D.Cox et al. // Science. - 2013. - V. 339. - № 6121. - P. 819-823.
2. RNA-guided human genome engineering via Cas9. / P.Mali, L.Yang, K.M. Esvelt et al. // Science. - 2013. - V. 339. - № 6121. - P. 823-826.
3. Системы редактирования геномов TALEN и CRISPR / Cas - инструменты открытий / А.А. Немудрый, К.Р. Валетдинова, С.П. Медведев и др. // Генетика. - 2014. - № 22. - Т. 3. - С. 20-42.
4. Livestock 2.0 - genome editing for fitter, healthier, and more productive farmed animals / C. Tait-Burkard, A. Doeschl-Wilson, M.J. McGrew et al. // Genome Biol. - 2018. - V. 19. - № 1. - P. 204-212. https://doi.org/10.1186/s13059-018-1583-1
5. Insulin-like growth factor-1 suppresses the Myostatin signaling pathway during myogenic differentiation / A. Retamales, R. Zuloaga, C.A. Valenzuela et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. Academic Press Inc. - 2015. - V. 464. - № 2. - P. 596-602.
6. Myostatin inhibits IGF-I-induced myotube hypertrophy through Akt / M.R. Morissette, S.A. Cook, C. Buranasombati et al. // Am. J. Physiol. Cell Physiol. - 2009. - V. 297. - № 19. - P. 1124-1132.
7. Aiello D., Patel K., Lasagna E. The myostatin gene: an overview of mechanisms of action and its relevance to livestock animals // Anim. Genet. - 2018. - №4. - Р.456-469.
8. One-step generation of myostatin gene knockout sheep via the CRISPR/Cas9 system / H. Hongbing, M. Yonghe, W. Tao et al. // Front. Agric. Sci. Eng. - 2014. - Vol. 1. - № 1. - P. 232-245.
9. CRISPR/Cas9- mediated sheep MSTN gene knockout and promote sSMSCs differentiation / Y. Zhang, Y. Wang, B. Yulin et al. // J. Cell. Biochem. John Wiley & Sons, Ltd. - 2018. - V. 120. - № 2. - P. 1794-1806.
10. Double-Muscled Phenotype in Mutant Sheep Directed by the CRISPRCas9 System / M. Wu, L. Du, R. Liu et al. // Cloning Transgenes. - 2018. - V. 7. - № 1. - Р. 212-224.
11. Generation of gene-modified goats targeting MSTN and FGF5 via zygote injection of CRISPR/Cas9 system / X. Wang, H. Yu, A. Lei et al. // Sci. Rep. Nature Publishing Group. - 2015. - V. 5. -№1. - P. 13878-13886.
12. CRISPR/Cas9-mediated knockout of myostatin in Chinese indigenous Erhualian pigs / К. Wang, X. Tang, Z. Xie et al. // Transgenic Res. Springer International Publishing. - 2017. - V. 26. - № 6. - P. 799805.
13. Efficient Generation of Myostatin Gene Mutated Rabbit by CRISPR/Cas9 / Q. Lv, L. Yuan, J. Deng et al. // Sci. Rep. Nature Publishing Group. - 2016. - V. 6. - № 1. - P. 25029-25039.
14. Generation of gene-target dogs using CRISPR/Cas9 system / Q. Zou, X. Wang, Y. Liu, Z. Ouyang, H. Long, S. Wei, X. Gao et al. // J. Mol. Cell Biol. - 2015. - V. 7. - № 6. - P. 580-583.
15. Evaluating Electroporation and Lipofectamine Approaches for Transient and Stable Transgene Expressions in Human Fibroblasts and Embryonic Stem Cells / M. Sharifi Tabar, M. Hesaraki, F. Esfandiari et al. // Cell. - 2015. - V. 17. - № 3. - P. 438-450.
16. Comparative Analysis of Non-viral Transfection Methods in Mouse Embryonic Fibroblast Cells. / M. Lee, K. Chea, R. Pyda et al. // J. Biomol. Tech. - 2017. - V. 28. - № 2. - P. 67-74.
17. Multiplex gene editing via CRISPR/Cas9 exhibits desirable muscle hypertrophy without detectable off-target effects in sheep / Х. Wang, Y. Niu, J. Zhou et al. // Sci. Rep. Nature Publishing Group. - 2016. -V. 6. - № 1. - P. 32271-32289.
18. Efficient Generation of Myostatin Knock-Out Sheep Using CRISPR/Cas9 Technology and Microinjection into Zygotes / M. Crispo, A. P. Mulet, L. Tesson et al. // PLoS One / ed. Veitia R.A. IETS. -2015. - V. 10. - № 8. - P. e0136690.
19. Targeted disruption of the sheep MSTN gene by engineered zinc-finger nucleases / C. Zhang, L. Wang, G. Ren et al. // Mol. Biol. Rep. - 2014. - V. 41. - № 1. - P. 209-215.
20. Scientific T.F. Lipofectamine 3000 Reagen [Electronic resource]. URL: https://www.thermofisher.com/ru/ru/home/brands/product-brand/lipofectamine/lipofectamine-3000. html.
21. Masse M. Gene Pulser® Electroprotocols // Bio-Rad Laboratories, Inc. Life D035551. - P. 160.
