CC BY
18
УДК 636:611.018.1
В. М. Левченко
МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АУТОЛОГИЧНЫХ ДЕРМАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ИХ КУЛЬТИВИРОВАНИИ В СРЕДЕ DMEM ПО УСОВЕРШЕНСТВОВАННОЙ МЕТОДИКЕ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «СТАВРОПОЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
V. M. Levchenko
THE MORPHOLOGICAL CHARACTERISTIC OF AUTOLOGICAL DERMAL FIBROBLASTS OF FARM ANIMALS DURING THEIR CULTIVATION IN DMEM MEDIUM UNDER THE IMPROVED TECHNIQUE
FEDERAL STATE BUDGETARY EDUCATIONAL INSTITUTION OF HIGHER EDUCATION «STAVROPOL STATE AGRICULTURAL UNIVERSITY»
Аннотация. Показано, что разработанная методика культивирования аутологичных дермальных фибробластов и ее апробация на культурах клеток различных сельскохозяйственных животных позволяет получить монослой в короткие сроки и в необходимом количестве. Изложенная морфофункциональная характеристика полученных фибробластов позволяет создать корреляционную линейку для дальнейшего изучения свойств полученной ткани.
Ключевые слова: аутологичные дермальные фибробласты; сельскохозяйственные животные; культивирование; морфология.
Summary. It is shown that the developed cultivation technique of autological dermal fibroblasts and their approbation on cell cultures of various farm animals allows to receive monolayer in short terms and in necessary quantity. The stated morphofofunctional characteristic of the received fibroblasts allows to create a correlation ruler for further studying of received fabric properties.
Keywords: autological dermal fibroblasts; farm animals; cultivation; morphology.
Владимир Михайлович Левченко
Vladimir Mikhaylovich Levchenko [email protected]
Введение. Благодаря достижениям в области клеточных технологий и началом их применения в клинической практике получило активное развитие новое направление в медицине - клеточная терапия. Среди наиболее перспективных и успешных областей использования культивированных клеток можно особо выделить лечение повреждений кожного покрова с использованием дермальных фибробластов, которые, благодаря своей эффективности и относительно небольшой себестоимости, прочно заняли определенную нишу. Активные попытки использовать культивированные фибробласты в медицинской практике стали предприниматься после того, как было установлено, что дермальные фибробласты в культуре сохраняют диплоидный кариотип, имеют ограниченную продолжительность жизни [1], не экспрес-сируют антигены главного комплекса гистосовместимо-сти класса II, не проявляют онкогенных свойств [2].
К сожалению, в связи с дороговизной существующих методик, отсутствием стандартизированных технологий культивирования фибробластов и отрывочными и
разрозненными сведениями о морфофункциональных показателях фибробластов различных видов сельскохозяйственных животных существует необходимость создания систематизированных данных с выявлением всех закономерностей роста и развития культуры клеток.
Цели работы: на первом этапе данного исследования - разработка универсальной методики культивирования аутологичных дермальных фибробластов сельскохозяйственных животных, на втором этапе - изучение морфологических свойств аутологичных дермальных фибробластов разных видов сельскохозяйственных животных, на третьем этапе - оценка жизнеспособности культур клеток аутологичных дермальных фибробластов с использованием данных морфометрических исследований базируясь на показатели энтропийного эквивалента.
Материалы и методы. Объектом исследования служили культуры клеток аутологичных дермальных фибробластов, полученных от овец, крупного рогатого скота и свиней в возрасте от 1 года до 1,5 лет. Забор биоптата кожи производился в области холки размером 1*1 см, предварительно шерстный покров в месте забора выстригался, и производилась обработка этиловым спиртом. После этого биоптат кожи помещали в стерильную пробирку с раствором фосфатного буфера + антибиотики (пенициллин и стрептомицин). Оценка морфологических показателей осуществлялась через 24, 48, и 96 часов культивирования.
Морфометрические исследования проводили с использованием программы Видео-Тест Морфология 5.1 для Windows, согласно рекомендациям Г. Г. Автандило-ва (2005).
38 Научный журнал Вестник Курганской ГСХА
Полученные материалы исследований анализировали, а статистическую обработку числовых данных проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа и множественного сравнения Ньюмена - Кейл-са в программе Primer of Biostatistics 4.03 для Windows. Достоверными считали различия при р<0,05.
Результаты исследований. За базовую методику культивирования аутологичных дермальных фибробла-стов была взята методика, изложенная в патенте «Способ культивирования фибробластов для заместительной терапии (RU 2320720)» [3].
При использовании данного способа у нас возникли следующие проблемы:
- отсутствие адгезии фибробластов к поверхности субстрата;
- отсутствие или задержка роста первичной культуры (данный показатель оценивался спустя 72 часа с момента начала культивирования);
- контаминация культуры.
В связи с вышеизложенными фактами были внесены существенные изменения в методику прототип:
Для культивирования использовали среду DMEM с аланил-глютамином с добавлением антибиотиков (пенициллина и стрептомицина) и 10 % ЭБС.
Для исключения контаминации культуры производили двойное промывание биоптата кожи сельскохозяйственных животных раствором фосфатного буфера + антибиотик. Все дальнейшие манипуляции с био-
Анализируя морфометрические параметры аутологичных дермальных фибробластов сельскохозяйственных животных установлено, что в первые сутки культивирования длина дермальных фибробластов овец составляет 4,431 ± 0,391 мкм, крупного рогатого скота 4,638 ± 0,424 мкм, свиней 4,445 ± 0,471 мкм. Также выявлено, что показатель длины фибробластов овец достоверно меньше показателя длины клеток свиней на 0,31 %, а этот же показатель у коров достоверно больше показателя длины фибробластов свиней на 4,16 %.
У аутологичных фибробластов, полученных от овец и свиней через 48 часов после начала культивирования отмечалось достоверное увеличение показателя длины в 3,9 раза по сравнению с суточными показателями, для фибробластов крупного рогатого скота увеличение было в 3,7 раза.
птатом кожи проводили в стерильных условиях в ламинарном боксе LabGard. Биоптат кожи подвергался механическому измельчению в стерильных чашках Петри на кусочки размером 1±0,5*3±0,5 мм. После этого полученный материал переносили 0,25 % раствор трипсина, помещали на магнитную мешалку с подогретым термостоликом до +37 С для ферментативной дезагри-гации в течение 20 минут. По истечению времени биоматериал переносили в микро-центрифужную пробирку типа Эпиндорф и центрифугировали в течение 3 минут и 2000 об./мин. Далее в стерильных условиях сливали супернатант, добавляли среду в объеме 0,6 мл, и снова проводили центрифугирование, данные операции повторяли 2 раза. По завершению этой процедуры содержимое центрифужных пробирок переносилои в культуральный матрас с добавлением 600 мкл среды для культивирования. Матрасы помещались в термостат с «комфортными» для культивирования условиями = +38 С и 5 % СО2) [4]. Морфометрические промеры фибробластов осуществляли через 24 часа, 48 и 96 часов культивирования.
По истечению 4 суток культивирования наблюдалось образование монослоя клеток аутологичных дермальных фибробластов 3 видов животных, участвующих в эксперименте, и проводили их морфометрические исследования с использованием программы Видео-Тест Морфология 5.1 согласно рекомендациям Г. Г. Автандилова, в результате чего были получены следующие данные.
Сравнивая числовые показателя длины клеток через 48 часов от начала культивирования, достоверно установили, что фибробласты у овец на 0,52 % больше, чем у свиней, а клетки коровы на 0,05 % меньше длины фибробластов свиней.
Анализируя числовые данные о длине фибробластов через 96 часов культивирования, установили, что у овец на 10,7 % длиннее, чем у свиней. Достоверного различия в показателях длины фибробластов овцы и коровы не выявлено. Также установлено, что аутологич-ные дермальные фибробласты коровы на 6,5 % больше, чем у свиней.
Таким образом, можно сделать вывод, что за двое суток (с 48 часов до 96) длина фибробластов у коровы и овцы увеличилась в 1,8 раза, а у свиней в 1,6.
Таблица 1 - Показатели длины клеток аутологичных дермальных фибробластов разных видов
сельскохозяйственных животных (п=30), мкм
Временной промежуток Овцы Крупный рогатый скот Свиньи
24 часа 4,431±0,391*# 4,638±0,424*# 4,445±0,471*#
48 часов 17,43610,492** 17,337±0,548*# 17,345±0.282*#
96 часов 31,040±0.492*# 30.62±0.272*# 28.75±0.225*#
Примечание: статистическая значимость различий фибробластов разных видов животных на 4 сутки культивирования: * - р<0,05; статистическая значимость различий размеров фибробластов по отношению к предыдущему временному отрезку: #- р<0,05
Сравнивая числовые показатели ширины фибробластов животных, мы установили, что через 24 часа культивирования клетки коровы и свиньи на 2 % и 0,09 % соответственно, шире, чем у овцы.
Сравнивая показатели на первые и вторые сутки, отметили достоверное увеличение фибробластов овец
и свиней в 2,9 раза, а коровы в 2,7 раза. Установлено, что ширина клеток у овцы стала больше на 3,6 %, чем у свиньи, и на 0,83 %, чем у коровы. Достоверности показателей ширины фибробластов крупного рогатого скота и свиней не выявлено.
Таблица 2 - Показатели ширины клеток аутологичных дермальных фибробластов разных видов
сельскохозяйственных животных (n=30), мкм
Временной промежуток Овцы Крупнорогатый скот Свиньи
24 часа 1,149±0,102*# 1,172±0,030*# 1,150±0,046*#
48 часов 3,372±0,036*# 3,250±0,050*# 3,344±0,037*#
96 часов 7,113±0,003*# 7,042±0,003*# 7,340±0,211*#
Примечание: статистическая значимость различий фибробластов разных видов животных на 4 сутки культивирования: * - p<0,05; статистическая значимость различий размеров фибробластов по отношению к предыдущему временному отрезку: #- p<0,05
На 4-е сутки культивирования было выявлено достоверное увеличение показателя ширины клеток у овец и у крупного рогатого скота в 2,1 раза, у свиней в 2,2 раза, по отношению ко вторым суткам. Ширина фибробластов у овец на 1 % больше, чем у крупного рога-
того скота и меньше ширины фибробластов свиней на 3,1 %. Достоверности в различии показателей ширины клеток крупнорогатого скота по отношению ширины клеток свиней не установлено.
Таблица 3 - Показатель ядерно-цитоплазматического отношения фибробластов
разных видов животных (n=30)
Временной промежуток Овцы Крупнорогатый скот Свиньи
96 часов 0,048±0,003* 0,047±0,002 0,049±0,002*
Примечание: статистическая значимость различий фибробластов разных видов животных на 4 сутки культивирования: * - p<0,05.
При сравнении числовых показателей ядерно-цито-плазмотического отношения (далее ЯЦО) аутологичных дермальных фибробластов сельскохозяйственных животных через 96 часов культивирования установлено, что у фибробластов овец, ЯЦО на 2,08 % меньше, чем у свиней. Достоверности между показателем ЯЦО у крупного рогатого скота и овцы не выявлено. Также нет достоверности между показателями фибробластов крупного рогатого скота и свиней.
Выводы. Впервые в ветеринарной практике изучены морфометрические показатели аутологичных дермальных фибробластов высоко продуктивных видов сельскохозяйственных животных. Полученные данные позволяют проводить оценку жизнеспособности культур клеток фибробластов. Разработанная методика культивирования позволит сократить экономические затраты на производство вакцин на основе культур клеток фибробластов.
Список литературы
1 Hayflick L, Moorhead P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res. 1961; Dec; 25:585-621.
2 Theobald V.A., Lauer J.D., Kaplan F.A., Baker K.B., Rosenberg M. «Neutral allografts» - lack of allogeneic stimulation by cultured human cells expressing MHC class I and class II antigens. Transplantation. 1993; Jan; 55:128-33.
3 Пат. № 2320720 Российская Федерация, Способ культивирования фибробластов для заместительной терапии / Е. В. Парфенова, В. А. Ткачук, Н. И. Калинина, К. А. Рубина, Т. Л. Друбич, М. Б. Балашова. - 2008.
- Бюл. № 9.
4 Левченко В. М., Гвоздецкий Н. А. Разработка современной методики культивирования аутологичных дермальных фибробластов // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. - 2016.
- № 2 (58). - С. 88-90.
