CC BY
32© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
Т.Е.Сизикова1, В.Н.Лебедев1, В.Б.Пантюхов1, С.В.Борисевич1, В.А.Меркулов2
ОПЫТ ИЗУЧЕНИЯ И ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ УСТРАНЕНИЯ ЛОЖНОПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ И ЛОЖНООТРИЦАТЕЛЬНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ НА ПРИМЕРЕ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК ВИРУСА ХУНИН
148 Центральный НИИ МО РФ, Сергиев Посад, Московская обл., 2НЦ экспертизы средств медицинского применения, Москва
Цель. Опыт изучения и возможные пути устранения ложноположительных и ложноотрица-тельных результатов при проведении полимеразной цепной реакции на примере выявления РНК вируса Хунин. Материалы и методы. Вирус Хунин — возбудитель Аргентинской геморрагической лихорадки (АГЛ) штамм XJpR37/5787 получен из Государственной коллекции возбудителей I группы патогенности 48 ЦНИИ. Набор реагентов для выявления РНК вируса Хунин методом ОТ-ПЦР разработан в институте и состоит из 4 комплектов: для выделения РНК, проведения реакции обратной транскрипции, проведения ПЦР и электрофоретической детекции продуктов ПЦР ОТ-ПЦР проводили по стандартной методике. Перевиваемые культуры клеток почки африканской зеленой мартышки Vera B, GMK-AH-ЦД) получены из музея отдела клеточных культур Центра. Результаты. Проведено экспериментальное изучение влияния различных факторов воздействия на исследуемую пробу («замораживание — оттаивание», наличие формальдегида, гепарина) на получние ложноотрицательных результатов при выявлении РНК вируса Хунин с помощью ОТ-ПЦР. Показано, что добавление в пробу 0,01% гепарина полностью ингибирует ПЦР Добавление 0,05% формальдегида достоверно снижает чувствительность метода. Показана возможность сокращения срока анализа с 15 до 5 суток при выявлении возбудителя в пробах с низкой концентрацией последнего путем подращивания проб и последующем анализом полученного материал с помощью ОТ-ПЦР Заключение. При выявлении возбудителей с помощью ОТ-ПЦР ложноотрицательные результаты могут возникать при наличии в пробе формальдегида и гепарина. На примере выявления РНК вируса Хунин выявлено, что ложноотрицательные результаты ПЦР вследствие концентрации возбудителя в исследуемой пробе ниже порога чувствительности метода могут быть устранены с помощью подращивания патогена в подходящей системе накопления с последующим анализом полученного материала с помощью метода ПЦР
Журн. микробиол., 2015, № 6, С. 78—82
Ключевые слова: полимеразная цепная реакция, Аргентинская геморрагическая лихорадка, вирус Хунин, ложноположительные результаты, ложноотрицательные результаты
T.E.Sizikova1, V.N.Lebedev1, V.B.Pantyukhov1, S.V.Borisevich1, V.A.Merkulov2
EXPERIENCE OF STUDY AND POSSIBLE WAYS OF ELIMINATION OF FALSE POSITIVE AND FALSE NEGATIVE RESULTS DURING EXECUTION OF POLYMERASE CHAIN REACTION ON AN EXAMPLE OF JUNIN VIRUS RNA DETECTION
148th Research Institute of the Ministry of Defense of Russian Federation, Sergiev Posad, Moscow Region, 2Scientific Centre of Medical Products Expertise, Moscow, Russia
Aim. Experience of study and possible ways of elimination of false positive and false negative results during execution of polymerase chain reaction on an example of Junin virus RNA detection. Materials and methods. Junin virus — causative agent ofArgentine hemorrhagic fever (AHF) strain XJpR37/5787 was obtained from the State collection of pathogenicity group I causative agents of the 48th Central Research Institute. Reagent kit for detection of Junin virus RNA by RT-PCR was developed in the Institute and consists of 4 sets: for isolation of RNA, execution of reverse-transcription reaction, execution of PCR and electrophoretic detection of PCR products. RT-PCR was carried out by a standard technique. Continuous cell cultures of African green monkey Vfero B, GMK-AH-1(D) were obtained from the museum of cell culture department of the Centre. Results. An experimental study of the effect of various factors of impact on the sample under investigation («thawing-freezing», presence of formaldehyde, heparin) on the obtaining of false negative results during Junin virus RNA detection by using RT-PCR was studied. Addition of 0.01% heparin to the samples was shown to completely inhibit PCR. Addition of 0.05% formaldehyde significantly reduces sensitivity of the method. A possibility of reduc-
tion of analysis timeframe from 15 to 5 days was shown during detection of the causative agent in samples with low concentration of the latter by growing the samples and subsequent analysis of the material obtained by using RT-PCR. Conclusion. During detection of causative agent by using RT-PCR false negative results could appear in the presence of formaldehyde and heparin in the sample. A possibility of elimination of false negative PCR results due to concentration of the causative agent in the sample under investigation at a level below sensitivity threshold was shown on the example of Junin virus RNA detection by using growing of the pathogen in appropriate accumulation system with subsequent analysis of the material obtained using PCR.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 6, P. 78—82
Key words: polymerase chain reaction, Argentine hemorrhagic fever, Junin virus, false positive results,
false negative results
ВВЕДЕНИЕ
Широкое внедрение ПЦР для выявления возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний обусловлено простотой ее выполнения, низкой себестоимостью, надежностью и возможностью использовать для проведения анализа предварительно инактивированные клинические пробы. В настоящее время создана научная и материально-техническая база для широкого внедрения в клиническую лабораторную диагностику новой генодиагностической технологии — количественного определения ДНК/РНК инфекционных агентов — ПЦР в реальном времени [1, 7, 8].
Достоверность метода ПЦР диагностики, по данным разных авторов, составляет от 95 до 100%, а информативность получаемого результата зависит от правильности выбора материала для исследования [1, 5 — 8]. Основными параметрами, характеризующими любой метод выявления и идентификации возбудителей опасных инфекционных заболеваний являются: чувствительность, специфичность и воспроизводимость. Известно, что специфичность и чувствительность ПЦР тест-системы прежде всего зависит от структуры праймеров [9]. При этом в диагностических наборах разных производителей используются праймеры различной структуры, что может обусловливать получение отличающихся результатов. Некоторые штаммы исследуемого возбудителя могут приобретать мутации в амплифицируемом (клонируемом) участке генома и, таким образом, становиться нераспознаваемыми при использовании выбранной пары праймеров. Для предотвращения ошибок подобного рода в настоящее время разработаны стандарты, регламентирующие объем испытаний (включая проверку на перекрестные реакции, а также тестирование известных штаммов определяемого возбудителя).
Существуют два вида ошибок при проведении ПЦР: ложноположительные, когда на самом деле возбудитель в пробе отсутствует, и ложноотрицательные, когда выявляется отрицательный результат при наличии возбудителя в пробе.
Необходимо отметить, что ПЦР может показать положительный результат даже в том случае, когда в организме больного уже нет жизнеспособного возбудителя. Причиной этого является то, что ПЦР не отличает живой микроорганизм от погибшего. Амплификация специфичной ДНК происходит и в том, и в другом случае. Однако в любом случае такой результат свидетельствует об имевшем место инфекционном процессе. Поэтому результаты ПЦР обязательно должны быть подтверждены данными других методов, в первую очередь, результатами выявления возбудителя в биопробе [4].
Большая часть ложноотрицательных результатов обусловлена загрязнением исследуемой пробы примесями, ингибирующими ПЦР. В частности, установлено, что гепарин и формальдегид способны ингибировать ПЦР. Именно поэтому при постановке ПЦР в качестве положительного контроля нельзя использовать формалинактивированные препараты возбудителей [4]. Еще одной возможной причиной ложноотрицательных результатов ПЦР может являться концентрация возбудителя в исследуемой пробе, находящаяся ниже порога чувствительности метода.
Важно отметить, что при диагностике особо опасных инфекционных заболеваний наибольшую опасность представляют ложноотрицательные результаты ПЦР. Поэтому в дальнейшем была экспериментально оценена возможность устранения некоторых лож-ноположительных и ложноотрицательных результатов на примере проведения ПЦР для выявления РНК вируса Хунин.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Вирус Хунин — возбудитель АГЛ штамм XJpR37/5787 получен из Национальной коллекции вирусов I группы патогенности 48 ЦНИИ. Набор реагентов для выявления РНК вируса Хунин методом ОТ-ПЦР, разработанный в Центре, состоит из 4 комплектов: для выделения РНК, проведения реакции обратной транскрипции, проведения ПЦР и электрофоретической детекции продуктов ПЦР. ОТ-ПЦР проводили по стандартной методике [9]. Перевиваемые культуры клеток почки африканской зеленой мартышки \fero B, GMK-AH-l(n) получали из музея отдела клеточных культур Центра. Статистическую обработку данных проводили в соответствии с [2, 3].
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Проведено экспериментальное изучение влияния различных факторов на получение ложноотрицательных анализов при постановке ПЦР при использовании разработанного в Центре амлификационного набора для выявления возбудителя АГЛ вируса Хунин методом ПЦР с электрофоретической детекцией. При проведении исследований была использована следующая методика. В пробирку с венозной кровью человека вносили вирус Хунин в концентрации, соответствующей аналитической чувствительности метода (1,0х103 БОЕхмл-1). Затем было изучено влияние различных факторов на получение ложноотрицательных результатов: трехкратное «замораживание — оттаивание» пробы; наличие в пробе формальдегида; наличие в пробе гепарина. Все исследования проводили в 10-кратной повторности. Результаты оценивали по доле положительных результатов в опыте и контроле. В результате исследований установлено (табл. 1), что изученные факторы оказывают различное воздействие на воспроизводимость результатов ПЦР по сравнению с
контролем (стандартная методика выявления РНК с помощью ОТ-ПЦР). Следует отметить, что абсолютно недопустимым является добавление в исследуемую пробу гепарина. Поскольку в настоящее время широко используют одноразовые устройства для взятия крови, предусматривающие получение гепаринизированного материала, это необходимо учитывать при взятии крови у пациента. В то же время, трехкратное «замораживание—оттаивание» исследуемой пробы не оказывает достоверного влияния на чувствительность ОТ-ПЦР.
Проведенные исследования позволили установить, что лож-ноотрицательные результаты ПЦР вследствие концентрации возбудителя в исследуемой пробе ниже порога чувствительности метода могут быть устранены с помощью подращивания возбудителя в подходящем субстрате накопления с последующим анализом полученного материала с помощью ПЦР. При анализе различных проб на предмет наличия в них того или иного возбудителя зачастую мы сталкиваемся с ситуацией, когда
Таблица 1. Влияние воздействия различных факторов на исследуемую пробу и получение ложноотрицательных результатов при выявлении РНК вируса Хунин с помощью ОТ-ПЦР
Кол-во Кол-во Доля
Исследуемая проба определений, полож. рез. полож. рез., %, р
n в ПЦР, n Х+о
Кровь человека, содер- 10 10 100-10 —
жащая вирус Хунин
(1,0х103 БОЕхмл-1)
То же при трехкратном 10 9 90+10 Нет
«замораживании — оттаи-
вании»
То же при наличии в про- 10 4 40+14 Р<0,01
бе 0,05% формальдегида
То же при наличии 10 0 0+10 Р<0,001
Примечание. — Вариант сравнения.
Таблица 2. Результаты выявления РНК вируса Хунин с помощью ОТ-ПЦР в пробах после подращивания исходной культуры возбудителя
Расч. конц. биол. акт. возб.
Выявление РНК вируса Хунин в пробах взятых на ... час
в исх. пробе, БОЕхмл-1 0 24 48 72 96 120 144
0,01 — — — — — + +
0,1 — — — — + + +
1 — — — + + + +
10 — — + + + + +
Примечание. + Положительный, — отрицательный результат выявления РНК вируса Хунин в пробе.
концентрация возбудителя ниже пороговой чувствительности метода. В этом случае обычно подращивают возбудитель в чувствительной системе накопления. Однако и в указанном случае ПЦР может быть эффективно использована для максимально более раннего выявления возбудителя. С этой целью были приготовлены рабочие культуры вируса Хунин штамм XJpR37/5787, расчетная концентрация биологически активного возбудителя в которых составляла 0,01; 0,1; 1,0 и 10 БОЕхмл-1, соответственно. Данные культуры были использованы для инфицирования монослойной культуры клеток GMK-AH-1 (Д), используемой в качестве субстрата подращивания.
С этой целью во флакон вносили 1,0 мл приготовленной культуры возбудителя. Расчетное количество клеток GMK-AH-1 (Д) во флаконе, исходя из расчетной концентрации клеток 2,0х105, составила 2,0x10е. Расчетная множественность инфицирования составляла от 5х10-9 до 5х10-6 БОЕ на клетку. После адсорбции в течение 1 часа при температуре 37°С неадсорбировавшийся инокулят удаляли пипеткой и во флаконы вносили поддерживающую среду. После этого флаконы делили на 7 групп. Флаконы группы 1 помещали в холодильник, а флаконы групп 2 — 7 инкубировали в термостате при температуре 37°С. Флаконы группы 2 инкубировали в течение 24 часов, 3 — 48 часов, 4 — 72 часа, 5 — 96 часов, 6 — 120 часов, 7 — 144 часа. В полученных пробах с помощью ОТ-ПЦР определяли наличие РНК вируса Хунин. Результаты исследований, представленные в табл. 2, свидетельствуют о том, что в зависимости от исходной концентрации возбудителя в анализируемой пробе с помощью ОТ-ПЦР удается выявить РНК вируса Хунин в пробах после подращивания в течение 48 — 144 часов, в зависимости от исходной концентрации возбудителя. Необходимо отметить, что минимальный период выявления вируса Хунин с помощью биопробы (инфицирование чувствительных лабораторных животных с последующей идентификацией возбудителя с помощью серологических тестов) составляет не менее 15 суток.
ОБСУЖДЕНИ Е
Существуют два вида ошибок при проведении ПЦР-анализа: ложноположительные, когда на самом деле возбудитель в пробе отсутствует и ложноотрицательные, когда выявляется отрицательный результат при наличии возбудителя в пробе. Причина этих ошибок может быть как на этапе исследования в лаборатории (лабораторная ошибка), так и на долабораторном или постлабораторном этапах. Ложноположительные результаты на долабораторных и постлабораторных этапах чаще всего обусловлены контаминацией пробы на стадии забора материала (при использовании нестерилизованного инструментария, пробирок, перчаток и др. материалов). Кроме того, существует опасность получения ложноположительных результатов в силу контаминации реагентов продуктами ПЦР-ампликонов, получаемых в данной лаборатории.
Ложноотрицательные результаты на долабораторном этапе обусловлены несоблюдением правил забора материала, выбором метода исследования без учета особенностей возбудителя. Большая часть ложноотрицательных результатов обусловлена загрязнением исследуемой пробы примесями, ингибирующими ПЦР. Другой распространенной причиной ложноотрицательных анализов на долабораторном этапе является деградация (распад) геномной нуклеиновой кислоты возбудителя при транспортировке и хранении пробы. Это может происходить при несоблюдении правил транспортировки и хранения проб. Наконец, возможной причиной получения ложноотрицательных результатов при постановке ПЦР является концентрация возбудителя в пробе ниже порога чувствительности метода.
При изучении влияния различных воздействий на пробу, содержащую вирус Хунин (трехкратное «замораживание — оттаивание», наличие в пробе 0,05% формальдегида или 0,01% гепарина), показано, что наиболее ингибирующее воздействие оказывает добавление гепарина. Данное обстоятельство необходимо учитывать при взятии крови у больных для дальнейшего проведения ПЦР с целью выявления возбудителя.
Нами показано, что ложноотрицательные результаты ПЦР вследствие низкой исходной концентрации возбудителя в исследуемой пробе могут быть устранены с помощью подращивания патогена в подходящей системе накопления с последующим анализом полученного материала с помощью метода ПЦР, что позволяет в динамике выявлять возбудитель и тем самым минимизировать влияние недостаточно высокого порога чувствительности метода, обеспечивая при этом значительный выигрыш во времени по сравнению с традиционными вирусологическими методами.
6. ЖМЭИ 6 № 16-2015
81
Л ИТЕРАТУРА
1. Владыко А.С., Зайцева В.Н., Трофимов Н.М. Ложноположительные реакции при лабораторной диагностике вирусных геморрагических лихорадок Ласса, Марбург, Эбола и СПИДа. Вопр. вирусол. 1997, 3: 232-234.
2. Генес В.С. Некоторые простые методы кибернетической обработки данных диагностических и физиологических исследований. М., 1967.
3. Лакин Г.Ф. Биометрия. М., Высшая Школа, 1990.
4. Ответные меры системы общественного здравоохранения на угрозу применения биологического и химического оружия. Руководство ВОЗ. ВОЗ, Женева, 2004.
5. Bernard P.S., Pritham G.H., Wittwer C.T. Color multiplexing hybridization probes using the apoli-poprotein E locus as a model system for genotyping. Analytical Biochemistry. 1999, 273: 221228.
6. Coutlee F, He Y, Saint-Antoine P. et al. Coamplification of HIV type 1 and beta-globin gene DNA sequences in a nonisotopic polimerase chain reaction assay to control for amplification efficiency. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1995, 11: 363-371.
7. Heid C.A. Real-time quantitative PCR. Genome Res. 1996, 6: 986-994.
8. Higuchi R. Kinetic PCR Analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology. 1993, 11: 1026-1030.
9. Sambrook J., Russel D.W Molecular cloning. CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, 2001.
Поступила 17.02.15
Контактная информация: Борисевич Сергей Владимирович, д.б.н., проф.,
141306, Московская обл., Сергиев Посад-6, ул. Октябрьская,11
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
A.А.Петров, Н.С.Пышная, В.Н.Лебедев,
B.С.Кулиш, Л.Ф.Стовба, А.В.Казанцев, С.В.Борисевич
ВЫЯВЛЕНИЕ РНК ВИРУСА ВЕНЕСУЭЛЬСКОГО ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА ЛОШАДЕЙ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБАХ МЕТОДОМ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ-ПОЛИМЕРАЗ-НОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
48 Центральный НИИ МО РФ, Сергиев Посад, Московская обл.
Цель. Выявление и идентификация РНК вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ) в биологических пробах методами обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) и ОТ-ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ). Материалы и методы. Исследованы вирусы ВЭЛ, Синдбис, Западного Нила, японского и клещевого энцефалита. В экспериментах использовали культуру клеток куриных фибробластов, беспородных мышей и крыс, яванских макаков. Определение биологической активности использованных в экспериментах рабочих культур возбудителей проводили методом негативных колоний на монослой-ной культуре клеток под агаровым покрытием и с помощью внутримозгового инфицирования мышей. При проведении экспериментов по выявлению РНК вируса ВЭЛ методами ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ в биологических пробах использовали разработанные в 48 Центральном НИИ и Институте аналитического приборостроения наборы реагентов. Результаты. Выявлен вирус ВЭЛ в биологических пробах различными методами. Данные ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ согласуются с результатами выявления вируса в пробах с использованием чувствительных животных. Заключение. Использование методов молекулярной диагностики для выявления в биологических пробах возбудителя опасного инфекционного заболевания имеет важное значение для обеспечения биологической безопасности РФ.
Журн. микробиол., 2015, № 6, С. 82—86
Ключевые слова: вирус ВЭЛ, РНК, обратная транскрипция, ПЦР, биологическая проба, лабораторные животные, экспериментальная инфекция
