CC BY
23ВИРУСОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
С.И.Сыромятникова, В.Б.Пантюхов, И.В.Шатохина, В.А.Маркин, А.П.Пирожков, М.А.Тимофеев, Т.Е.Сизикова, И.Г.Румянцева, С.В.Борисевич
ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ ВОЗБУДИТЕЛЯ АРГЕНТИНСКОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ
НИЦ 33 Центрального научно-исследовательского испытательного института МО РФ, Сергиев Посад, Московская обл.
Цель. Оптимизация условий количественной оценки возбудителя Аргентинской геморрагической лихорадки. Материалы и методы. Вирус Хунин (штамм XJ P37) получен из Национальной коллекции возбудителей вирусных геморрагических лихорадок I группы патогенности 33 ЦНИИИ. В опытах была использована культура вируса Хунин (штамм XJ P37) с биологической активностью 5,2 lg БОЕхмл-1. Культуры клеток Vera B, 6619-1(Д) и GMK-AH-1^) получены из коллекции культур клеток НИЦ 33 ЦНИИИ. Расчет биологической активности вируса Хунин при титровании на культурах клеток проводили методом Кербера в модификации И.П. Ашмарина. Результаты. При инкубировании в течение 4 — 7 суток после инфицирования клеточного монослоя определяемая биологическая активность вируса Хунин составляла от 4,4 до 6,4 lg БОЕхмл-1; размер образуемых негативных колоний — (1,5±0,5) мм. Заключение. Оптимизированы условия количественной оценки возбудителя Аргентинской геморрагической лихорадки методом негативных колоний (использование пяти-семисуточного монослоя культуры клеток Vera В, покраска монослоя на пятые сутки вторичного инкубирования, учет результатов на седьмые сутки от момента инфицирования).
Журн. микробиол., 2013, № 2, С.51—55
Ключевые слова: вирус Хунин, Аргентинская геморрагическая лихорадка, культура клеток, титрование, агаровое покрытие
S.I.Syromyatnikova, V.B.Pantyukhov, I.V.Shatokhina, V.A.Markin, A.P.Pirozhkov, M.A.Timofeev, T.E.Sizikova, I.G.Rymyantseva, S.V.Borisevich
OPTIMIZATION OF CONDITIONS OF QUANTITATIVE EVALUATION OF ARGENTINE HEMORRHAGIC FEVER CAUSATIVE AGENT
Research Scientific Centre of the 33rd Central Research Testing Institute of the Ministry of Defense of the Russian Federation, Sergiev Posad, Moscow Region, Russia
Aim. Optimization of conditions of quantitative evaluation of Argentine hemorrhagic fever causative agent. Materials and methods. Junin virus (XJ P37 strain) was obtained from National collection of viral hemorrhagic fever causative agents of the 1st pathogenicity group of the 33rd Central Research Testing Institute. Junin
virus (XJ P37 strain) culture with biological activity of 5.2 lg PFUxml-1 was used in the experiments. Vero B, 6619-1(D) and GMK-AH-l(D) were obtained from collection of cell culture of the Research Scientific Centre of the 33rd Central Research Testing Institute. Calculation of biological activity of Junin virus during titration in cell cultures was carried out by Kerber method with modification by I.P. Ashmarin. Results. During incubation for 4 — 7 days after the infection of cell monolayer the determined biological activity was 4.4 — 6.4 lg PFUxml-1; the size of the formed negative colonies — (1.5+0.5) mm. Conclusion. The conditions of quantitative evaluation of Argentine hemorrhagic fever were optimized by negative colonies method (using 5 — 7 day Vero B cell culture monolayer with staining of monolayer on day 5 of secondary incubation, recording of results at day 7 after the infection).
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 2, P. 51—55
Key words: Junin virus, Argentine hemorrhagic fever, cell culture, titration, agar coating
ВВЕДЕНИЕ
Аргентинская геморрагическая лихорадка (АГЛ) — особо опасная вирусная инфекция, характеризующаяся лихорадкой, симптомами общей интоксикации, геморрагическим синдромом и летальностью до 30% (при отсутствии лечения) [2 — 4, 8].
С середины 90-х годов XX века технический прогресс привел к значительному увеличению объема и интенсивности перемещения товаров между многими странами мира, масштабному перемещению людей, которые активно путешествуют или выезжают на работу в Южную Америку авиационным, железнодорожным и водным видами транспорта. Это может способствовать возникновению завозных (заносных) случаев АГЛ.
Поэтому для разработки современных диагностических наборов реагентов и изучения эффективности экспериментальных образцов вакцин и иммуноглобулина необходимо наличие надежных методов количественной оценки вируса Хунин — возбудителя АГЛ.
В литературе описаны методы титрования вируса Хунин по цитопати-ческому действию в различных культурах клеток (МС-5, Vero, L, ВНК-21) [5, 7]. Выявлена способность культуры клеток Vero формировать негативные колонии возбудителя АГЛ под агарозой [6].
Авторы в составе агарового покрытия использовали среду Игла с 5% эмбриональной сыворотки КРС, 1% смеси незаменимых аминокислот, 1% буфера Hepes и L-глутамин. Однако полученные ими негативные колонии вируса Хунин штамм XJCI3 были очень мелкие, что затрудняло дать точную количественную характеристику возбудителя.
Целью настоящей работы являлась оптимизация условий количественной оценки возбудителя Аргентинской геморрагической лихорадки.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В эксперименте использовали вирус Хунин штамм XJ P37, полученный из института вирусологии им. Д.И.Ивановского. В Центре культура возбудителя прошла два дополнительных пассажа через мозг мышей. Для проведения исследований из Национальной коллекции вирусов геморрагических лихорадок I группы патогенности была получена исходная культура с биологической активностью 3,0 lg БОЕхмл-1. После освежения исходной культуры вируса Хунин путем однократного пассирования в культуре клеток Vero B использовали вируссодержащую культуру с биологической активностью 5,2 lg БОЕхмл-1.
Работу проводили на постоянных линиях клеток Vero B, 6619-1(Д), GMK-AH 1(Д), полученных из почек взрослой зеленой мартышки (Cercopithecus aethiops). Инфицирующие дозы вируса Хунин составляли от 0,0001 до 1,0 БОЕ кл-1.
Разведения культуры вируса готовили на поддерживающей среде с 7,5% эмбриональной сыворотки крови КРС. Во флаконы вносили по 1 мл соответствующего разведения культуры вируса. Время адсорбции вируса на клетках составляло 1 час при 36,5 — 37,5°С. Первичное агаровое покрытие вносили при температуре от 37 до 40°С, вторичное — при той же температуре в разные сроки: на 3, 4, 5 и 7 сутки. Инкубировали инфицированный монослой клеток при 36,5 — 37,5°С. На вторые сутки после окраски клеток подсчитывали количество негативных колоний и определяли их размер с помощью масштабного клина «ВАМ».
Расчет биологической активности вируса Хунин при титровании на культурах клеток проводили по методу Кербера в модификации И.П.Ашмарина [1].
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
В результате проведенных исследований влияния различных сроков инкубирования перевиваемых культур клеток на образование негативных колоний вируса Хунин в монослое выявлено, что количественную оценку культур штаммов вируса Хунин в пробах по методу негативных колоний возможно проводить в культурах клеток почек обезьян с внесением вторичного агарового покрытия с 4 по 7 сутки (табл. 1). В пределах этого срока чувствительность метода была одинакова и достоверно выше, чем при окраске на третьи сутки инкубирования.
На пятые и более поздние сроки в клетках Vero B и GMK-AH-ЦД) образовывались более крупные бляшки вируса Хунин, чем в клетках 6619-1(Д). Средний размер негативных колоний составлял 1,5±0,5 и 1,0±0,3 мм соответственно. Аналогичные результаты титрования были получены при окраске монослоя клеток нейтральным красным, внесенным в эти же сроки в разведении 1:1000 в объеме 0,5 мл на флакон. Негативные колонии имели четко очерченные неровные (звездчатые) края на розовом фоне живых клеток.
При исследовании влияния возраста перевиваемой культуры клеток
Таблица 1. Результаты определения биологической активности вируса Хунин при титровании в культурах клеток почек обезьян при различных сроках вторичного инкубирования
Культура клеток Биологическая активность вируса (lg БОЕхмл-1, Х+с) на ... сутки культивирования
3 4 5 7
Vero B 2,7+0,5 4,4+0,2 5,0+0,2 6,0+0,2
GMK-AH-ЦД) 3,4+1,2 6,4+0,3 5,6+0,5 5,5+0,3
6619-1(Д) 4,8+0,2 4,3+0,2 4,3+0,2 4,3+0,4
Таблица 2. Результаты определения биологической активности вируса Хунин при титровании в культуре клеток Vero B различного возраста
Возраст монослоя клеток, сутки Биологическая активность, (lg БОЕхмл-1, Х+с) на ... сутки внесения вторичного покрытия
3 4 5
3 4,3±0,2 4,3±0,2 4,5±0,5
5 5,0±0,3 5,0+0,1 5,0+0,3
7 5,0+0,3 5,3+0,3 5,3+0,2
Vero B на чувствительность метода установлено (табл. 2), что чувствительность метода титрования культур вируса Хунин по методу негативных колоний на клетках Vero B достоверно зависит от возраста используемого клеточного монослоя. Средняя выявляемая активность на трехсуточном монослое составляла (без учета срока внесения вторичного покрытия) 4,4 lg, пятисуточного — 5,0 lg, а семисуточного — 5,2 lg БОЕхмл-1.
ОБСУЖДЕНИ Е
Известно, что эффективность бляшкообразования различных вирусов (даже при использования одной и той же стандартизованной культуры клеток) зависит от ряда регулируемых факторов постановки эксперимента, в частности, возраста монослоя клеток, продолжительности первичного (до окрашивания монослоя) и вторичного инкубирования.
При оценке влияния возраста перевиваемой культуры клеток Vero B на чувствительность метода установлено достоверное влияние этой характеристики на определяемую биологическую активность вируса Хунин. Данный показатель при использовании 3, 5- и 7-суточного монослоя составлял соответственно 4,4; 5,0 и 5,2 lg БОЕхмл-1. Возможно, что данный факт связан с повышенной сорбционной способностью более «старого» монослоя клеток вследствие активации поверхностных клеточных рецепторов закисленной питательной средой.
Количественную оценку культур штаммов вируса Хунин в пробах по методу негативных колоний возможно проводить в культурах клеток почек обезьян с внесением вторичного агарового покрытия с 4 по 7 сутки. В
пределах этого срока чувствительность метода была одинакова и достоверно выше, чем при окраске на третьи сутки инкубирования.
На пятые и более поздние сроки в клетках Vero B и GMK-AH-1^) образовывались более крупные бляшки вируса Хунин, чем в клетках 6619-1(Д). Средний размер негативных колоний составлял 1,5+0,5 и 1,0+0,3 мм соответственно. В практическом плане при титровании культур вируса по методу негативных колоний вторичное агаровое покрытие целесообразно вносить на пятые сутки инкубирования, а учет результатов титрования проводить на седьмые сутки.
Проведенные экспериментальные исследования позволили предложить следующие оптимальные условия титрования культур вируса Хунин по методу негативных колоний: использование монослойных культур клеток Vero B 5 — 7 сут. возраста, покраска монослоя на пятые сутки вторичного инкубирования и учет результатов на седьмые сутки. В зависимости от целей работы допустимо варьирование указанных параметров, однако чувствительность метода при этом будет снижена.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л., Гос. изд. мед. лит., 1962.
2. Маркин В.А., Пантюхов В.Б., Марков В.И., Бондарев В.П. Аргентинская геморрагическая лихорадка. Журн. микробиол. 2012, 2: 78-87.
3. Маркин В.А., Марков В.И. Вирусные геморрагические лихорадки — эволюция эпидемического потенциала. Журн. микробиол. 2002, 2: 91-98.
4. Мельникова О.В., Титенко А.М., Андаев Е.И. Санитарная охрана территории от завоза и распространения особо опасных вирусных инфекций. Аргентинская и Боливийская геморрагические лихорадки. Пробл. особо опасных инф. 2010, 104 (2): 29-34.
5. Ambrossio A.M., Enria D.A. Junin virus isolation from lymphomononuclear cells of patients wich Argentine hemorrhagic fever. Intervirology. 1986, 25 (20): 97-102.
6. Bushar G., Sagripanti J.L. Method for improving accuracy of virus titration: Standardization of plague assay for Junin virus. J. Virol. Meth. 1990, 30: 99-108.
7. Lascano E.F., Birria M.L. Diagnosis of Junin virus in cell cultures by immunoperoxi-dase staining. Arch. Virol. 1981, 70 (1): 79-82.
8. Viral hemorrhagic fevers: Current, comprehensive information on pathogenesis, microbiology, epidemiology, diagnosis, treatment and prophylaxis. CDC: 2004 CTDRAP / JDSA. URL: http://www.idsociety.org. (дата обращения: 20.05.12).
Поступила 19.06.12
Контактная информация: Сыромятникова Светлана Ивановна, к.б.н., 141306, Сергиев Посад-6, р.т. (496)552-12-06
