Выявление РНК вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей в биологических пробах методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

Л ИТЕРАТУРА

1. Владыко А.С., Зайцева В.Н., Трофимов Н.М. Ложноположительные реакции при лабораторной диагностике вирусных геморрагических лихорадок Ласса, Марбург, Эбола и СПИДа. Вопр. вирусол. 1997, 3: 232-234.

2. Генес В.С. Некоторые простые методы кибернетической обработки данных диагностических и физиологических исследований. М., 1967.

3. Лакин Г.Ф. Биометрия. М., Высшая Школа, 1990.

4. Ответные меры системы общественного здравоохранения на угрозу применения биологического и химического оружия. Руководство ВОЗ. ВОЗ, Женева, 2004.

5. Bernard P.S., Pritham G.H., Wittwer C.T. Color multiplexing hybridization probes using the apoli-popratein E locus as a model system for genotyping. Analytical Biochemistry. 1999, 273: 221228.

6. Coutlee F, He Y, Saint-Antoine P. et al. Coamplification of HIV type 1 and beta-globin gene DNA sequences in a nonisotopic polimerase chain reaction assay to control for amplification efficiency. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1995, 11: 363-371.

7. Heid C.A. Real-time quantitative PCR. Genome Res. 1996, 6: 986-994.

8. Higuchi R. Kinetic PCR Analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology. 1993, 11: 1026-1030.

9. Sambrook J., Russel D.W Molecular cloning. СSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, 2001.

Поступила 17.02.15

Контактная информация: Борисевич Сергей Владимирович, д.б.н., проф.,

141306, Московская обл., Сергиев Посад-6, ул. Октябрьская,11

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015

A.А.Петров, Н.С.Пышная, В.Н.Лебедев,

B.С.Кулиш, Л.Ф.Стовба, А.В.Казанцев, С.В.Борисевич

ВЫЯВЛЕНИЕ РНК ВИРУСА ВЕНЕСУЭЛЬСКОГО ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА ЛОШАДЕЙ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБАХ МЕТОДОМ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ-ПОЛИМЕРАЗ-НОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

48 Центральный НИИ МО РФ, Сергиев Посад, Московская обл.

Цель. Выявление и идентификация РНК вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ) в биологических пробах методами обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) и ОТ-ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ). Материалы и методы. Исследованы вирусы ВЭЛ, Синдбис, Западного Нила, японского и клещевого энцефалита. В экспериментах использовали культуру клеток куриных фибробластов, беспородных мышей и крыс, яванских макаков. Определение биологической активности использованных в экспериментах рабочих культур возбудителей проводили методом негативных колоний на монослой-ной культуре клеток под агаровым покрытием и с помощью внутримозгового инфицирования мышей. При проведении экспериментов по выявлению РНК вируса ВЭЛ методами ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ в биологических пробах использовали разработанные в 48 Центральном НИИ и Институте аналитического приборостроения наборы реагентов. Результаты. Выявлен вирус ВЭЛ в биологических пробах различными методами. Данные ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ согласуются с результатами выявления вируса в пробах с использованием чувствительных животных. Заключение. Использование методов молекулярной диагностики для выявления в биологических пробах возбудителя опасного инфекционного заболевания имеет важное значение для обеспечения биологической безопасности РФ.

Журн. микробиол., 2015, № 6, С. 82—86

Ключевые слова: вирус ВЭЛ, РНК, обратная транскрипция, ПЦР, биологическая проба, лабораторные животные, экспериментальная инфекция

A.A.Petrov, N.S.Pyshnaya, V.N.Lebedev, V.S.Kulish, L.F.Stovba, A.V.Kazantsev, S.V.Borisevich

DETECTION OF VENEZUELAN EQUINE ENCEPHALOMYELITIS VIRUS RNA IN BIOLOGICAL SAMPLES BY REVERSE-TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION

48th Research Institute of the Ministry of Defense of Russian Federation, Sergiev Posad, Moscow Region, Russia

Aim. Detection and identification of Venezuelan equine encephalomyelitis (VEE) virus RNA in biological samples by reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and RT-PCR in real time (rRT-PCR). Materials and methods. VEE, Sindbis, West Nile, Japanese and tick-borne encephalitis viruses were studied. Cell culture of chicken fibroblasts, outbred mice and rats, Javanese macaques were used in the experiments. Biological activity determination of the running culture of causative agents used in the experiments was carried out by negative colony method in monolayer cell culture under agar coating and using intra-cerebral infection of mice. Reagent kits developed in the 48th Central Research Institute and Institute of Analytical Instrument Engineering were used during execution of experiments of VEE virus RNA detection by RT-PCR and rRT-PCR. Results. VEE virus was detected in biological samples by various methods. Data from RT-PCR and rRT-PCR are in accordance with the results of virus detection in samples using sensitive animals. Conclusion. Use of molecular-diagnostics methods for detection in biological samples of a causative agent of a dangerous infectious disease is important for procuring biological safety of Russian Federation.

Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 6, P. 82—86

Key words: VEE virus, RNA, reverse transcription, PCR, biological sample, laboratory animals, experimental infection

ВВЕДЕНИЕ

Вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ) — арбовирус, относящийся к роду Alphavirus семейства Togaviridae. Комплекс вируса ВЭЛ содержит 13 подтипов, включающих 8 различных вирусов. Подтипы IAB и IC вируса ВЭЛ вызывают эпидемии и эпизоотии [4, 14, 15].

С момента первого выявления (1938 г.) вируса ВЭЛ [5] имеются сведения о многочисленных эпизоотиях и эпидемиях на территории Колумбии, Венесуэлы, Мексики, США и других стран Западного полушария, во время которых были зарегистрированы многочисленные случаи заболевания людей и лошадей. Развитие транспортных связей делает возможным завоз возбудителя на неэндемичные территории [3, 7, 9 — 12].

Несмотря на имеющееся разнообразие биологических методов диагностики вирусных инфекций, проблема быстрого и высокочувствительного выявления и идентификации этиологического агента заболевания остается актуальной. Выделение вируса в культуре клеток и реакция нейтрализации типоспецифическими сыворотками, традиционно считающиеся «золотым стандартом» диагностики, обладают рядом недостатков, главными из которых является высокая трудоемкость и продолжительность анализа. Кроме того, для верификации результатов серологических методов необходимо располагать сертифицированными сыворотками. Следует подчеркнуть, что именно эти методы до настоящего времени занимали ведущее положение при диагностике ВЭЛ.

Общей тенденцией проводимых в последние годы диагностических исследований с возбудителями опасных и особо опасных вирусных инфекционных заболеваний является преобладание молекулярно-биологических методов, специфичность которых основана на уникальности нуклеотидных последовательностей вирусных геномов. Среди этих методов ведущее положение занимает ПЦР для возбудителей с ДНК-геномом и ОТ-ПЦР для возбудителей с РНК-геномом.

В настоящее время в области диагностики опасных и особо опасных инфекционных заболеваний человека широко используется ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) [8]. Применение ПЦР-РВ и ОТ-ПЦР-РВ позволяет проводить выявление продуктов амплификации в процессе реакции и вести количественный учет вирусных нуклеиновых кислот. Этот метод дает возможность минимизировать влияние так называемого человеческого фактора.

За рубежом разработаны наборы реагентов для выявления РНК вируса ВЭЛ методом ОТ-ПЦР [6, 8, 13]. При этом чувствительность данных методов варьировала и значительно различалась (2 - 70, 150, 5000 ЛДзоМИЦ-мл-1).

В Российской Федерации наборы реагентов для выявления РНК вируса ВЭЛ методами ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ не разработаны, что определяет актуальность данной работы.

Целью данной работы является выявление и идентификация РНК вируса ВЭЛ в биологических пробах методами ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирусы: вирус ВЭЛ, штамм Тринидад; вирус Синдбис, штаммы AR-339 и Аз-574; вирус Западного Нила (ЗН), штамм Eg-101; вирус японского энцефалита (ЯЭ), штамм Пекин-1; вирус клещевого энцефалита (КЭ), штамм Софьин. Были получены из государственной коллекции вирусов 48 ЦНИИ. Для получения биомассы вирусов ВЭЛ и Синдбис использовали 11-суточные развивающиеся куриные эмбрионы (РКЭ), возбудители лихорадки Западного Нила, ЯЭ, КЭ накапливали в головном мозге мышей.

В экспериментах использовали беспородных мышей массой 7 — 9 г, беспородных крыс массой 50 — 100 г, яванских макаков массой 4 — 5 кг, полученных из вивария института. Работу с животными проводили в соответствии с требованиями правил проведения работ с использованием экспериментальных животных.

Культуру клеток куриных фибробластов (КФ) получали из отдела культур клеток.

Определение биологической активности использованных в экспериментах рабочих культур возбудителей проводили методом негативных колоний на монослойной культуре клеток КФ под агаровым покрытием [2] и с помощью внутримозгового инфицирования мышей [2].

Крысам (подкожно) и яванским макакам (внутримышечно) вводили возбудитель ВЭЛ в дозе 1х103 БОЕ. Кровь у инфицированных животных в количестве 1 мл от каждой особи отбирали на 1 — 7 сутки после заражения.

При проведении экспериментов по выявлению РНК вируса ВЭЛ методами ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ в биологических пробах использовали разработанные в 48 ЦНИИ и Институте аналитического приборостроения наборы реагентов. Для пробоподготовки использовали 100 мкл сыворотки. Был выбран наиболее быстрый и широко используемый метод выделения нуклеиновых кислот, основанный на лизисе образцов высоко концентрированным хаотропным веществом — гуанидинидин тиоционатом в смеси с этилендиаминте-трауксусной кислотой с одновременной сорбцией нуклеиновых кислот на микрочастицах стекла.

РЕЗУЛ ЬТАТЫ

На первом этапе исследований провели выравнивание секвениро-ванных геномных последовательностей штаммов вируса ВЭЛ и выбрали наиболее консервативную область генома — последовательность, кодирующую неструктурный белок №р1 вируса ВЭЛ. Для соответствующей области гена ВЭЛ была выбрана и обоснована структура видоспецифических праймеров.

В дальнейшем при оценке аналитической чувствительности наборов реагентов методами ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ для выявления РНК вируса ВЭЛ использовали 10-кратные разведения рабочей культуры возбудителя, содержащие от 0,1 до 1х104 ЛД50МИЦхмл-1. Результаты, представленные в табл. 1, свидетельствуют, что чувствительность разрабо-

Таблица 1. Результаты оценки аналитической чувствительности наборов реагентов для выявления РНК ВЭЛ методами ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ

Биологическая активность возбудителя в исследуемой пробе, ЛД50МИЦхмл-1 Определение доли положительных результатов в экспериментах (п/Ы, Х±о, процент)

ОТ-ПЦР ОТ-ПЦР-РВ

1,0х104 Пол. (10/10, 100-10) Пол. (10/10, 100-10)

1,0х103 Пол. (10/10, 100-10) Пол. (10/10, 100-10)

1,0х102 Пол. (10/10, 100-10) Пол. (10/10, 100-10)

10,0 Пол. (7/10, 70±15) Пол. (8/10, 80±13)

1,0 Пол. (3/10, 30±15) Пол. (4/10, 40±13)

0,1

Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10)

Примечание. N — общее количество проб; п — количество проб, давших положительный результат; Х±о — среднее значение доли положительных проб и его ошибка, рассчитанные по [1]; Пол. — положительный, Отр. — отрицательный (здесь и в табл. 2).

Таблица 2. Результаты оценки аналитической специфичности наборов реагентов для выявления РНК ВЭЛ методами ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ

Исследуемый материал Биологическая активность возбудителя в исследуемой Определение доли положительных результатов в экспериментах (п/^ Х±о, процент)

пробе ОТ-ПЦР ОТ-ПЦР-РВ

Вирус ВЭЛ штамм Тринидад Вирус ЯЭ штамм Пекин 1 Вирус ЗН штамм Eg-101 Вирус Синдбис штамм AR-339 Вирус Синдбис штамм Аз-574 Вирус КЭ штамм Софьин Неинф. РКЭ

Головной мозг неинф. мышей

1,0х102 ЛДзоМИЦхмл-1 1,0х105 ЛД50МИЦхмл-1 1,0х105 ЛД50МИЦхмл-1 1,0х105 БОЕхмл-1 1,0х105 БОЕхмл-1 1,0х105 ЛД50МИЦхмл-1

Пол. (10/10, 100-10) Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10)

Пол. (10/10, 100-10) Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10)

Таблица 3. Результаты выявления возбудителя ВЭЛ в сыворотках крови инфицированных крыс и яванских макаков методами ОТ-ПЦР, ОТ-ПЦР-РВ и с помощью биопробы

Исследуемые сыворотки Сутки после инфицирования Результаты выявления возбудителя с помощью... (доля положительных проб, процент)

ОТ-ПЦР ОТ-ПЦР-РВ Биопробы

Инф. крыс 3 100 100 100

5 100 100 100

7 50 50 50

9 0 0 0

Неинф. крыс — 0 0 0

Инф. яванских макаков 3 100 100 100

5 100 100 100

7 50 50 50

9 0 0 0

Неинф. яванских макаков — 0 0 0

Примечание. Биопроба — выявление вируса ВЭЛ с помощью интрацеребрального заражения мышей с последующим подтверждением специфичности гибели.

танных наборов реагентов находится в диапазоне 1 — 10 ЛД50МИЦхмл-1, что превышает чувствительность разработанных за рубежом тест-систем.

Результаты оценки аналитической специфичности наборов реагентов для выявления РНК вируса ВЭЛ, представленные в табл. 2, свидетельствуют, что разработанные наборы реагентов обладают видовой специфичностью — определяют только РНК вируса ВЭЛ.

С учетом того, что наиболее распространенным видом биологических проб, исследуемых на содержание инфекционного агента, является кровь заболевших, в последующем была оценена возможность выявления возбудителя ВЭЛ в сыворотках крови инфицированных лабораторных животных, взятых в различное время после заражения. В экспериментах были использованы крысы и яванские макаки, у которых заболевание не сопровождается летальным исходом. Уровень вирусемии у животных данных видов (1,0х103 — 1,0х107 ЛД50МИЦхмл-1) соответствует таковому у больного ВЭЛ человека [3, 4]. Определение возбудителя в пробах проводили одновременно с помощью ОТ-ПЦР, ОТ-ПЦР-РВ и титрования на мышах при внутримозговом способе инфицирования с последующим подтверждением специфичности гибели животных.

Результаты выявления РНК вируса ВЭЛ в сыворотках крови инфицированных животных, представленные в табл. 3, свидетельствуют, что данные ОТ-ПЦР совпадают с таковыми ОТ-ПЦР-РВ, а уровень чувствительности обоих методов позволяет выявлять РНК вируса ВЭЛ в сыворотках крови животных уже на 3 сутки после инфицирования. Результаты обеих реакций хорошо согласуются с уровнем накопления вируса в головном мозге мышей, инфицированных исследуемыми пробами интрацеребрально (минимальная концентрация вируса ВЭЛ, определяемая при подобном способе инфицирования ~7 ЛД50МИЦхмл-1). Коэффициент соответствия, рассчитанный по [1], составляет (100-5)%.

ОБСУЖДЕНИ Е

Общей тенденцией проводимых в последние годы диагностических исследований с возбудителями опасных инфекционных заболеваний является преобладание молекулярно-биологических методов, специфичность которых основана на уникальности нуклеотидных

последовательностей геномов микроорганизмов. Среди этих методов ведущее положение занимает ОТ-ПЦР для возбудителей с РНК-геномом.

Применение ОТ-ПЦР-РВ позволяет проводить выявление продуктов амплификации в процессе реакции и вести количественный учет нуклеиновых кислот микроорганизмов. Этот метод дает возможность минимизировать влияние так называемого человеческого фактора.

Наиболее распространенным видом биологических проб при выявлении инфекционного агента является кровь заболевших. Нами была проведена оценка возможности выявления возбудителя ВЭЛ с помощью ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ в сыворотках крови инфицированных крыс и яванских макаков.

Установлено, что на 5 сутки после инфицирования вирус выявлялся у всех животных тремя методами, а на 7 — только у 50% животных, что, видимо, связано с индивидуальными особенностями организма. На 9 сутки, когда происходит элиминация вируса из организма, вирус не определялся ни одним из указанных методов. Следует отметить, что затраты времени при проведении указанных методов являются несопоставимыми — 4 часа при постановке ОТ-ПЦР, 2 часа — для ОТ-ПЦР-РВ (без учета пробоподготовки) и 10 суток — при выявлении активности возбудителя, а с учетом необходимости подтверждения специфичности гибели животных — 14 суток [2].

Таким образом, данные результаты подтверждают возможность использования ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ в диагностических целях для выявления РНК вируса ВЭЛ не только в биологических, но и в клинических пробах, в частности, в сыворотках крови больных людей.

Л ИТЕРАТУРА

1. Генес В.С. Некоторые простые методы кибернетической обработки данных диагностических и физиологических исследований. М., Медицина, 1967.

2. Здродовский П.Ф., Соколов М.И. Руководство по лабораторной диагностике вирусных и риккетсиозных болезней. М., Медицина, 1965.

3. Bowen G.S., Fashinell T.R., Dean P.B., Gregg M.B. Clinical aspects of human Venezuelan equine encephalitis in Texas. Bull. Pan. Am. Health Organ. 1976, 10: 46-57.

4. Johnson K.M, Martin D.H. Venezuelan equine encephalitis. Adv. Vet. Sci. Comp. Med. 1974, 18

(I): 79-116.

5. Kubes Y, Rios F.A. The causative agent ofinfectious equine encephalomyelitis in Venezuela. Science. 1939, 90 (1): 20-21.

6. Linnsen B., Kinney R.M., Agnilar P. et al. Development of reverse-transcription-PCR assay specific for detection of equine encephalitis viruses. J. Clin. Microbiol. 2000, 38(15): 1527-1535.

7. Oberste M.S., Fraire M., Navarro R. Association of Venezuelan equine encephalitis virus subtype IE with two equine epizootics in Mexico. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1998, 59 (1): 100-107.

8. Pisano M.B., Seco M.P.S., Re YE. et al. Specific detection of all members ofVEE complex development of a RT-nested PCR. J. Virol. Met. 2012, 185 (1): 203-206.

9. Rico-Hesse R., Weaver S.C., de Siger J. et al. Emergence of a new epidemic/epizootic Venezuelan equine encephalitis virus in South America. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995, 92 (16): 52785281.

10. Rivas F., Diaz L.A., Cardenas YM. Epidemic Venezuelan equine encephalitis in La Guajira, Colombia, 1995. J. Infect. Dis. 1997, 175 (4): 828-832.

11. Salas R.A., Garcia C.Z., Liria J. Ecological studies of enzootic Venezuelan equine encephalitis in north-central Venezuela 1997 — 1998. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2001, 64 (1): 84-92.

12. Walton T.E., Grayson M.A. Venezuelan equine encephalomyelitis. In: Monath T.P. (ed.). The Arboviruses: Epidemiology and Ecology. Boca Raton Florida, CRC Press, 1988, р. 203-231.

13. Wang E., Paessler S., Agnilar P. et al. Reverse transcription-PCR-enzyme linked immunosorbent assay for rapid detection and differentiation of alpha virus infection. J. Clin. Microbiol. 2006, 44

(II): 4000-4008.

14. Weaver S.C., Ferro C., Barrera R. Venezuelan equine encephalitis. Ann. Rev. Entomol. 2004, 49 (1): 141-174.

15. Weaver S.C., Pfeffer M., Marriott K. et al. Genetic evidence for the origins of Venezuelan equine encephalitis virus subtype IAB outbreaks. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1999, 60 (2): 441-448.

Поступила 17.02.15

Контактная информация: Петров Александр Анатольевич, к.м.н., 141306, Московская область, Сергиев Посад-6, ул. Октябрьская, 11