CC BY
29
МЕДИ^у
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
ОПЫТ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ MALDI TOF МИНИСЕКВЕНИРОВАНИЯ
ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ БЕТА-ЛАКТАМАЗ ТИПА ТЕМ ШТАММОВ K. PNEUMONIAE,
ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В ПЕДИАТРИЧЕСКИХ СТАЦИОНАРАХ
А. Г. Точилина, И. В. Соловьева, И. В. Белова, В. А. Жирнов, С. Б. Молодцова,
ФБУН «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной», г. Н. Новгород
Точилина Анна Георгиевна - e-mail: lab-lb@yandex.ru
Дата поступления 01.10.2020
Изучение природы антибиотикорезистентности K. pneumoniae и анализ структуры ß-лактамаз расширенного спектра типа являются одним из важнейших аспектов современной клинической микробиологии и эпидемиологии. Актуальным является вопрос изучения генного контекста данных ферментов с целью поиска точечных мутаций, приводящих к формированию БЛРС. Цель исследования: проанализировать нуклеотидные последовательности генов, кодирующих ß-лактамазы типа ТЕМ штаммов K pneumoniae на наличие SNP с использованием MALDI TOF минисеквенирования. Материалы и методы. Исследовали гены blaTEM 36 штаммов K. pneumoniae, выделенных в течение эпизодов эпидемического неблагополучия в педиатрических стационарах. Идентификацию штаммов проводили с помощью времяпролетного MALDI масс-спектрометра Autoflex. Выделение ДНК производили с использованием набора «ДНК-экспресс», детекцию генов blaTEM осуществляли методом ПЦР. Реакцию минисеквенирования для выявления SNP проводили с использованием олигонуклеотидных зондов, описанных в научной литературе. Снятие спектров осуществляли с использованием MALDI TOF масс-спектрометра Autoflex и программы FlexControl в ручном режиме. Результаты. В ходе проведенной работы было установлено, что SNP в последовательности гена blaTEM в позициях 104, 240 и 238 и приводящих к замене глутаминовой кислоты на лизин - Glu104Lys, Glu240Lys, а также глицина на серин - Gly238Ser отсутствуют у всех исследованных штаммов. У 67% штаммов обнаружена мутация, приводящая к замене аланина на треонин в позиции 237 (Ala237Thr), что приводит к изменению субстратной специфичности белка и формированию БЛРС, устойчивых к действию ингибиторов. Выводы. У 67% штаммов обнаружены однонуклеотидные замены, приводящие к изменению субстратной специфичности фермента и формированию БЛРС. Это подтверждает необходимость мониторинга частоты значимых мутаций генов антибиотикорезистентности госпитальных штаммов с целью прогнозирования эпидемической ситуации.
Ключевые слова: K. pneumoniae, антибиотикорезистентность, ß-лактамазы типа
ТЕМ, blaTEM, SNP, MALDI TOF минисеквенирование.
EXPERIENCE OF USING MALDI TOF MINISEQUENCING FOR STUDING TEM BETA-LACTAMASES IN K. PNEUMONIAE STRAINS CIRCULATING IN PEDIATRIC HOSPITALS
A. G. Tochilina, I. V. Solovieva, I. V. Belova, V. A. Zhirnov, S. B. Molodcova,
Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Nizhny Novgorod, Russian Federation
Tochilina Anna Georgievna - e-mail: lab-lb@vandex.ru
Study of the nature of K. pneumoniae antibiotic resistance and analysis of the structure of extended-spectrum p-lactamases (ESBL) are one of the most important aspects of modern clinical microbiology and epidemiology. The issue of studying the gene context of these enzymes in order to search for point mutations that lead to ESBL formation is urgent. Research objective: to analyze and search for SNPs in nucleotide sequences of genes encoding TEM p-lactamases in K. pneumoniae strains using MALDI TOF minisequencing. Materials and methods: blaTEM genes of 36 K. pneumoniae strains isolated during episodes of epidemic trouble in pediatric hospital settings were studied. The strains were identified using an Autoflex MALDI TOF mass spectrometer. DNA isolation was performed using
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
a DNA-express kit, blaTEM genes were detected by PCR. The minisequencing reaction for SNP detection was performed using oligonucleotide probes described in the academic literature. The spectral data were taken using an Autoflex MALDI TOF mass spectrometer and FlexControl software in the manual mode. Results. In the course of the work it was found that SNPs in the blaTEM gene sequence at positions 104, 240 and 238 and those ones leading to the substitution of glutamic acid by lysine - Glu104Lys, Glu240Lys, as well as glycine substitution by serine - Gly238Ser were absent in all studied strains. In 67% strains, a mutation was found that led to alanine substitution by threonine at position 237 (Ala237Thr), which led to a change in the proteins substrate specificity and to formation of ESBLs resistant to inhibitors. Conclusions. In 67% strains, single nucleotide substitutions were found, leading to a change in the enzyme substrate specificity and to formation of ESBLs. This confirms the need to monitor the frequency of significant mutations in antibiotic resistance genes in hospital strains in order to ensure epidemic forecasting.
Key words: K. pneumoniae, antibiotic resistance, TEM p-lactamases, blaTEM, SNP, MALDI TOF minisequencing.
ВВЕДЕНИЕ
Представители семейства Enterobacteriaceae, в том числе K. pneumoniae, являются одними из основных возбудителей госпитальных инфекций в России, причем на сегодняшний день наибольшее клиническое значение имеет рост резистентности штаммов энтеробактерий к современным пенициллинам и цефалоспоринам [1-3]. Согласно современным данным, их устойчивость к цефалоспоринам в России превышает 80% и, главным образом, связана с эпидемическим распространением штаммов, продуцирующих бета-лактамазы расширенного спектра (БЛРС), то есть бета-лактамазы, способные гидро-лизовать пенициллины, в том числе ингибиторозащищен-ные и цефалоспорины III-IV поколений [1].
К формированию БЛРС приводят точечные нуклеотид-ные мутации (single nucleotide polymorphism - SNP), приводящие к замене нескольких аминокислот в белковой последовательности фермента и изменению его структуры. Причем мутации могут возникать достаточно быстро - известны случаи, когда микроорганизмы становились нечувствительными к антибиотику в течение одного курса лечения [4]. Большинство бета-лактамаз принадлежит к трем основным ферментативным группам молекулярного класса А: ТЕМ, SHV и CTX-M, все они содержат остаток серина в активном центре и имеют молекулярную массу около 29 кДа. У эпидемически значимых представителей семейства Enterobacteriaceae чаще всего встречаются бета-лактамазы типа ТЕМ [4, 5].
Первичная последовательность исходного фермента бета-лактамазы типа ТЕМ включает 288 аминокислотных остатков, все остальные ферменты данного типа являются мутантными формами исходного фермента и содержат от одной до семи точечных мутаций, на настоящий момент описано уже более 200 представителей ферментов данного типа (http://www.lahey.org/studies). Необходимо отметить, что данная бета-лактамаза мутирует чаще ферментов других типов, на настоящий момент описаны мута-
ции для 92 аминокислотных остатков, что составляет 32% первичной последовательности, частота мутаций в каждом положении варьирует. Согласно современным данным мутации чаще всего встречаются в положениях 21, 39, 69, 104, 164, 182, 237, 238, 240, 244, 265 и 275, а ключевыми, то есть приводящими к расширению профиля субстратной специфичности и формированию БЛРС (фенотип 2be) являются мутации в положениях 104, 237, 238 и 240 [6].
С точки зрения современной эпидемиологии актуальным представляется вопрос изучения геномного контекста генов blaTEM у госпитальных штаммов K. pneumoniae в точках ключевых мутаций для установления фенотипа фермента и мониторинга циркуляции штаммов, несущих данные ферменты в дальнейшем.
На сегодняшний день известны следующие методы анализа генов на предмет наличия SNP: метод анализа длин рестрикционных фрагментов, полученных в ходе полиме-разной цепной реакции (ПЦР); ДНК-гибридизация с синтетическими олигонуклеотидными зондами, комплементарными области полиморфизма в виде ПЦР в реальном времени или в формате биочипов; таргетное секвениро-вание. Указанные технологии обеспечивают высокую точность анализа, однако не отличаются высокой производительностью, сложны технически и экономически затратны, так как предполагают использование трудоемких гибридизационных технологий и дорогостоящих рестрик-таз [7]. В свою очередь, метод SNP генотипирования, основанный на принципе минисеквенирования ДНК, выгоден экономически, отличается высокой производительностью, быстротой, при необходимости процесс может быть автоматизирован [5, 8].
Фактически метод MALDI TOF минисеквенирования максимально приближен к «золотому стандарту» - методу секвенирования по Сэнгеру, так как реализует тот же аналитический принцип - ферментативное достраивание и последующий анализ синтезированных цепей ДНК [8]. После проведения ПЦР выполняют дефосфорилирование
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
реакционной смеси с использованием фосфатазы арктической креветки (SAP) и переходят к ключевому этапу SNP генотипирования - собственно реакции минисеквенирования, суть которой заключается в проведении реакции амплификации с использованием олигонуклеотидного зонда, конец которого «отжигается» непосредственно перед нуклеотидом, в котором происходит замена (полиморфизм). В реакции используется определенный набор дезокси- (dNTP) и дидезоксирибонуклеотидов (ddNTP), причем ddNTP являются терминаторами амплификации, так как неспособны создавать фосфодиэфирную связь со следующим нуклеотидом. В ходе реакции высокоточная полимераза, например, полимераза TermiPol, удлиняет зонд комплиментарно матрице, в роли которой выступает ПЦР-продукт нужного участка гена. Заключительным этапом является регистрация массы «достроенного» зонда с помощью, MALDI TOF масс-спектрометра, на основании чего делается вывод о наличии того или иного генетического полиморфизма в исходной последовательности (рис. 1) [8].
Благодаря своим преимуществам метод MALDI TOF минисеквенирования активно используется для решения задач прикладной микробиологии и вирусологии, молекулярной биологии и медицинской генетики в России и за рубежом [5, 9-13].
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: проанализировать нуклеотид-ные последовательности генов, кодирующих бета-лакта-мазы типа ТЕМ госпитальных штаммов K. pneumoniae на наличие SNP с использованием MALDI TOF минисеквени-рования.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследовали гены blaTEM 36 штаммов K. pneumoniae, выделенных от больных (фекалии, мазки из зева и др.) и объектов внешней среды (медицинское оборудование, предметы ухода) в течение эпизодов эпидемического неблагополучия в педиатрических стационарах. Все штаммы обладали выраженной антибиотикорезистентностью, установленной с использованием бактериологического анализатора: были устойчивы к защищенным пеницилли-нам и цефалоспоринам III и IV поколения и содержали в составе генома ген blaTEM.
Культуры выращивали на среде Плоскирева (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск) в течение 22 ч при 37±1°С. Идентификацию проводили с помощью времяпролетно-го MALDI масс-спектрометра Autoflex и программно-аппаратного комплекса BioTyper (Bruker Daltonics, Германия), пробоподготовка суточных культур исследуемых микроорганизмов проводилась методом прямого нанесения по стандартному протоколу, представленному в руководстве пользователя. Идентификация, запись, обработка и анализ масс-спектров производилась
с помощью программно-аппаратного комплекса BioTyper. Выделение суммарной ДНК для последующей детекции генов бета-лактамаз производили с использованием набора «ДНК-экспресс» (Литех, Россия). Детекцию генов blaTEM осуществляли методом ПЦР с использованием специфичных праймеров, описанных в научной литературе [5] и стандартных реагентов фирмы «Синтол» в реакционной смеси следующего состава: ПЦР-буфер - 11,0 мкл, смесь dNTP - 2,5 мкл, Forward-праймер - 0,5 мкл, Reverse-праймер - 0,5 мкл, Taq-полимераза - 0,5 мкл, ДНК - 10,0 мкл.
Амплификацию осуществляли с помощью амплифика-тора BIS М111-05-30 (Россия), имеющего функцию «горячая крышка» по следующей программе: 94°С - 2 мин; 94°С - 20 с, 55°С - 30 с, 72°С - 45 с х 35 циклов; заключительная элонгация при 72°С - 2 мин.
Дефосфорилирование продуктов реакции проводили добавлением 1 мкл фосфатазы арктических креветок (SAP) (Литех, Россия) в течение 20 минут при 37±1°С, затем фермент деактивировали прогреванием при 85±1°С в течение 10 минут.
Гены были проанализированы на наличие SNP, обуславливающих мутации в «ключевых точках»: Glu104Lys, Ala237Thr, Gly238Ser, Glu240Lys с использованием олиго-нуклеотидных зондов, разработанных ранее и указанных в научной литературе - TEM104f, TEM237f1, TEM238f2, TEM240r1 [5] (таблица). Зонды синтезировали в фирме «Синтол» (Россия).
Реакцию минисеквенирования проводили с использованием реагентов производства «Литех» (Россия) путем добавления к дефосфорилированному продукту, полученному на предыдущих этапах, реакционной смеси следующего состава: ПЦР-буфер - 0,5 мкл, Смесь ddNTP - 0,1 мкл, олигонуклеотидный зонд - 0,1 мкл, TermiPol-полимераза - 0,2 мкл, ddH2O - 4,1 мкл. Амплификацию осуществляли с помощью амплификатора BIS М111-05-30 (Россия) по следующей программе: 94°С - 5 мин; 94°С - 20 с, 48-55°С - 20 с, 72°С - 15 с х 70 циклов; заключительная элонгация при 72°С - 2 мин.
На заключительном этапе была произведена очистка продуктов реакции с помощью катион-обменной смолы (Литех, Россия).
На мишень AnchorChip (Bruker Daltonics, Германия), наносили матрицу (3-гидроксипиколиновая кислота, 3-HPA (Bruker Daltonics, Германия)), высушивали на воздухе в течение 2 минут, затем наслаивали очищенную пробу в количестве 0,5 мкл. Далее осуществляли снятие спектров с использованием времяпролетного MALDI масс-спектрометра Autoflex и программы FlexControl в ручном режиме. Подсчет ожидаемой молекулярной массы зонда осуществляли с использованием программы «Олиго Калькулятор» (http://www.bio.bsu.by/molbiol/oligocalc.html).
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
РИС. 1.
Основные этапы технологии MALDI TOF минисеквенирования.
РИС. 2.
Примеры масс-спектров продуктов реакции минисеквенирования штаммов K. pneumoniae ssp. pneumoniae 3247, 3248 с использованием зондов TEM104f, ТЕМ237Й, TEM238f2, TEM240r.
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
По наличию в масс-спектрах продуктов реакции мини-секвенирования пиков, соответствующих ионам определенной ожидаемой молекулярной массы, делали вывод о нуклеотидном контексте в данном положении (таблица).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
На первом этапе работы с использованием MALDI TOF масс-спектрометрии все штаммы были идентифицированы как K. pneumoniae ssp. pneumoniae, с использованием специфичных праймеров были наработаны фрагменты генов blaTEM.
Затем с использованием метода MALDI минисеквени-рования были исследованы последовательности гена blaTEM на наличие однонуклеотидных замен, обуславливающих мутации в «ключевых точках»: Glu104Lys (GAG-AAG), Ala237Thr (GCC-ACC), Gly238Ser (GGT-AGT), Glu240Lys (GAG-AAG).
При анализе на наличие мутации в положении Glu104Lys с использованием зонда TEM104f масса зонда после реакции минисеквенирования составила 5511 Да, в то время как масса нативного зонда составляет 5198 Да. То есть молекулярная масса нуклеотида, присоединившегося к зонду, равна 313 Да, что соответствует массе гуанина и указывает на наличие у штаммов аллеля «дикого типа» (рис. 2А). Аналогично было установлено отсутствие однонуклеотидных замен и в позициях Gly238Ser и Glu240Lys, массы зондов TEM238f2 и ТЕМ240г1 после реакции минисеквенирования соответствовали аллелям «дикого типа» (рис. 2D, E).
При исследовании гена blaTEM на наличие мутации Ala237Thr она была обнаружена у 67% штаммов, масса зонда после реакции минисеквенирования при этом составила 5835 Да, масса нативного зонда - 5538 Да. Масса терминирующего нуклеотида составила 297 Да, что соответствует аденину и указывает на наличие SNP (рис. 2B, C).
ОБСУЖДЕНИЕ
Метод MALDI TOF минисеквенирования, использованный в работе, характеризуется методической простотой, хорошей воспроизводимостью и позволяет быстро получить результат. Минисеквенирование не предусматривает проведения сложных манипуляций с использованием
гибридизационных технологий и рестриктаз, что находит отражение в его экономической доступности и позволяет использовать его как рутинный метод для исследования SNP в генах антибиотикорезистентности.
В ходе проведенной работы было установлено, что SNP в последовательности гена blaTEM в позициях 104, 240 и 238 и приводящих к замене глутаминовой кислоты на лизин - Glu104Lys, Glu240Lys, а также глицина на серин -Gly238Ser, отсутствуют у всех исследованных штаммов. Установлено, что у 33% штаммов гены blaTEM вообще не содержат однонуклеотидных замен в «ключевых точках», то есть ферменты, продуцируемые ими, относятся к классу пенициллиназ, обладающих узким спектром субстратной специфичности и активных только против пени-циллинов, незащищенных ингибиторами, и цефалоспо-ринов I и II поколений. Однако, это не согласуется с характеристикой штаммов, которые обладают устойчивостью к защищенным пенициллинам и цефалоспоринам последних поколений, указывающей на наличие БЛРС. Это может быть связано с наличием в геноме других детерминант, обладающих свойствами БЛРС, например бета-лактамаз
b|aSHv и blaCTX-M.
У 67% штаммов K. pneumoniae ssp. pneumoniae обнаружена мутация, приводящая к замене аланина на треонин в позиции 237 (Ala237Thr). По данным научной литературы, это приводит к изменению субстратной специфичности белка и формированию БЛРС, устойчивых к действию ингибиторов [6]. Наличие мутантного фермента у штаммов, циркулирующих в стационаре, может говорить о возможности формирования эпидемически опасного мультирезистентного клона и подтверждает необходимость продолжения данного исследования.
ВЫВОДЫ
В ходе анализа генов blaTEM штаммов K. pneumoniae на наличие SNP с использованием MALDI TOF минисеквенирования у 67% штаммов обнаружены однонуклеотид-ные замены, приводящие к изменению субстратной специфичности фермента и формированию БЛРС. Установлено, что метод MALDI-TOF минисеквенирования может быть успешно использован в эпидемиологическом
ТАБЛИЦА.
Компоненты реакции и ожидаемые молекулярные массы продуктов
Кодон Триплет-мишень SNP Зонд Масса продукта (Да) Нуклеотиды, используемые в реакции
104 wt - GAG Glu TEM104f 5514 ddA
mut - AAG Glu104Lys 5498 ddG
237 wt - GCC mut - ACC Ala Ala237Thr TEM237f1 5851 5835 ddA ddG
238 wt - GGT Gly TEM238f2 6141 ddA
mut - AGT Gly238Ser 6125 ddG
240 wt - GAG mut - AAG Glu Glu240Lys ТЕМ240Г1 6360 6375 ddC ddT
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
надзоре для мониторинга частоты значимых мутаций генов антибиотикорезистентности штаммов, циркулирующих в стационарах, с целью прогнозирования эпидемической ситуации.
Конфликт интересов. Автор заявляет об отсутствии явного или потенциального конфликта интересов, связанного с публикацией статьи.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Сухорукова М.В., Эйдельштейн М.В., Склеенова Е.Ю. и др. Антибиотикорезистентность нозокомиальных штаммов Enterobacteriaceae в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования МАРАФОН в 2011-2012 гг. // КМАХ. 2014. Т. 16, № 4. С. 254-265.
Sukhorukova M.V., Ehjdel'shtejn M.V., Skleenova E.Yu. i dr. Antibiotikorezistentnost' nozokomial'nykh shtammov Enterobacteriaceae v statsionarakh Rossii: rezul'taty mnogotsentrovogo ehpidemiologicheskogo issledovaniya MARAFON v 2011-2012 gg. // KMAKH. 2014. T. 16, № 4. S. 254-265.
2. Эйдельштейн М.В., Журавлев В.С., Шек Е.А. Распространенность карба-пенемаз среди нозокомиальных штаммов Enterobacteriaceae в России // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2017. Т. 17 (1). С. 36-41.
Ehjdel'shtejn M.V., Zhuravlev V.S., Shek E.A. Rasprostranennost' karbapenemaz sredi nozokomial'nykh shtammov Enterobacteriaceae v Rossii// Izv. Sarat. un-ta. Nov. ser. Ser. KHimiya. Biologiya. EHkologiya. 2017. T. 17 (1). S. 36-41.
3. Молекулярно-генетический мониторинг в системе эпидемиологического надзора за инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи: федеральные клинические рекомендации, ноябрь, 2014; Нац. ассоциация специалистов по контролю инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (НП «НАСКИ»). Нижний Новгород: Ремедиум Приволжье, 2016. 48 с.
Molekulyarno-geneticheskij monitoring v sisteme ehpidemiologicheskogo nadzora za infektsiyami, svyazannymi s okazaniem meditsinskoj pomoshhi: federal'nye klinicheskie rekomendatsii, noyabr', 2014; Nats. assotsiatsiya spetsialistov po kontrolyu infektsij, svyazannykh s okazaniem meditsinskoj pomoshhi (NP «NASKI»). Nizhnij Novgorod: Remedium Privolzh 'e, 2016.48 s.
4. Рубцова М.Ю., Уляшова М.М., Бахман Т.Т., Шмид Р.Д., Егоров А.М. Мультипараметрическое определение генов и точечных мутаций в них для идентификации бета-лактамаз // Успехи биологической химии. 2010. Т. 50. С. 303-348.
Rubtsova M.YU., Ulyashova M.M., Bakhman TT, Shmid R.D., Egorov A.M. Mul'tiparametricheskoe opredelenie genov i tochechnykh mutatsij v nikh dlya identifikatsii beta-laktamaz // Uspekhi biologicheskoj khimii. 2010. T. 50. S. 303-348.
5. Ikryannikova L.N., Shitikov E.A., Zhivankova D.G., Il'ina E.N., Govorun V.M., Edelstein M.V. A MALDI TOF MS-based minisequencing method for rapid detection of TEM-type extended-spectrum beta-lactamases in clinical strains of Enterobacteriaceae // Journal of Microbiological Methods. 2008. Т. 75 (3). S. 385-391.
6. Григоренко В.Г., Рубцова М.Ю., Упоров И.В., Иштубаев И.В., Андреева И.П., Щербинин Д.С., Веселовский А.В., Егоров А.М. Бактериальные серино-вые бета-лактамазы ТЕМ-типа: структура и анализ мутаций // Биомедицинская химия. 2017. Т 63 (6). С. 499-507.
Grigorenko V.G., Rubtsova M.YU., Uporovl.V, Ishtubaev I.V., Andreeva I.P., SHHerbinin D.S., Veselovskij A.V., Egorov A.M. Bakterial'nye serinovye beta-
laktamazy TEM-tipa: struktura i analiz mutatsij // Biomeditsinskaya khimiya. 2017. T63 (6). S. 499-507.
7. Monavari S.H., Fateh R., Vaziri F., et al. A comparative study of various methods for detection of IL28B rs12979860 in chronic hepatitis C // Scand J Clin Lab Invest. 2017.77(4). 247-252.
8. Метод анализа точечных мутаций в онкогенах с использованием технологии масс-спектрометрического минисеквенирования: пат. 2008 140067А Рос. Федерация: МПК G01N 3/48,C12Q 1/68 / Генерозов Э.В., Захаржевская Н.Б., Костин П.А., Морошкина С.Ю. - 2008140067/13, заявл. 10.10.2008; опубл. 20.04.2010.
Metod analiza tochechnykh mutatsij v onkogenakh s ispol'zovaniem tekhnologii mass-spektrometricheskogo minisekvenirovaniya: pat. 2008 140067A Ros. Federatsiya: MPK G01N 3/48,C12Q 1/68 / Generozov Eh.V., Zakharzhevskaya N.B., Kostin P.A., Moroshkina S.Yu. - 2008140067/13, zayavl. 10.10.2008; opubl. 20.04.2010.
9. Ikryannikova L.N., Afanas'ev M.V., Akopian T.A., Il'ina E.N., Govorun V.M., Kuz'min A.V., Larionova E.E., Smirnova T.G., Chernousova L.N. Mass-spectrometry based minisequencing method for the rapid detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis // Journal of Microbiological Methods. 2007. Т. 70 (3). С. 395-405.
10. Хунхеева Ж.Ю., Миронова Л.В., Балахонов С.В., Афанасьев М.В. Использование MALDI-TOF минисеквенирования для детекции генетически измененных вариантов возбудителя холеры // Клиническая лабораторная диагностика. 2017. Т. 62 (2). С. 116-120.
KHunkheeva Zh.Yu., Mironova L.V., Balakhonov S.V., Afanas'ev M.V. Ispol'zovanie MALDI-TOF minisekvenirovaniya dlya detektsii geneticheski izmenennykh variantov vozbuditelya kholery // Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2017. T. 62 (2). S. 116-120.
11. Еременко Е.И., Воропаев В.В., Котенева Е.А., Рязанова А.Г., Аксенова Л.Ю., Цыганкова О.И., Буравцева Н.П., Куличенко А.Н. Разработка метода анализа единичных нуклеотидных полиморфизмов Bacillus anthracis с использованием минисеквенирования и масс-спектрометрии // Медицинский вестник Северного Кавказа. 2016. Т. 11 (4). С. 565-569.
Eremenko E.I., Voropaev V.V., Koteneva E.A., Ryazanova A.G., Aksenova L.Yu., TSygankova O.I., Buravtseva N.P., Kulichenko A.N. Razrabotka metoda analiza edinichnykh nukleotidnykh polimorfizmov Bacillus anthracis s ispol'zovaniem minisekvenirovaniya i mass-spektrometrii // Meditsinskij vestnik Severnogo Kavkaza. 2016. T. 11 (4). S. 565-569.
12. Вербенко Д.А., Честков А.В. Определение генетических детерминант устойчивости Neisseria gonorrhoeae к антимикробным препаратам методом минисеквенирования // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2019. Т. 21 (S1). С. 17.
Verbenko D.A., CHestkov A.V. Opredelenie geneticheskikh determinant ustojchivosti Neisseria gonorrhoeae k antimikrobnym preparatam metodom minisekvenirovaniya // Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya. 2019. T. 21 (S1). S. 17.
13. Костин П.А., Генерозов Э.В., Захаржевская Б.Н., Говорун В.М., Лапина Т.Л., Юрьева Е.Ю., Склянская О.А., Ивашкин В.Т., Маев И.В., Любезнова И.Ю., Голубев Н.Н., Кучерявый Ю.А. Спектр соматических мутаций в генах АРС, k-Ras и ТР53 у российских пациентов с колоректальным раком и предраковыми заболеваниями толстой кишки // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2008. Т. 18 (4). С. 53-62.
Kostin P.A., Generozov Eh.V., Zakharzhevskaya B.N., Govorun V.M., Lapina T.L., Yur'eva E.YU., Sklyanskaya O.A., Ivashkin V.T., MaevI.V., Lyubeznova I.Yu., Golubev N.N., Kucheryavyj Yu.A. Spektrsomaticheskikh mutatsij vgenakh ARS, k-Ras i TR53 u rossijskikh patsientov s kolorektal'nym rakom i predrakovymi zabolevaniyami tolstoj kishki // Rossijskij zhurnal gastroehnterologii, gepatologii, koloproktologii. 2008. T. 18 (4). S. 53-62.
