CC BY
49
ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ ДОЗРЕВШИХ IN VITRO ООЦИТОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
© Коробкова М.Ю.*, Корниенко Е.В.Ф, Черненко Е.Ю.*, Нестеров И.И., Косовский Г.Ю.*, Маленко Г.П.*
Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий Российской академии сельскохозяйственных наук, г. Москва
Оплодотворение ооцитов in vitro (IVF) является одним из наиболее важных этапов технологии получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro (IVP). Подбор оптимальных условий оплодотворения, в первую очередь факторов, влияющих на капацитацию сперматозоидов, может существенно повысить выход бластоцист, пригодных для трансплантации. Данные факторы, а также оптимальную концентрацию сперматозоидов, следует подбирать индивидуально для каждого донора спермы.
Введение. Использование современных репродуктивных технологий в воспроизводстве крупного рогатого скота может способствовать ускорению селекционного процесса, позволяя достигать желаемые результаты в меньшие сроки, сохранять генетический потенциал исчезающих пород. В частности, метод получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro (in vitro production, IVP) используется как с целью быстрого увеличения поголовья ценных пород скота, так и при проведении фундаментальных исследований в области биологии развития. Исследования в области клонирования и получения трансгенных животных также основываются на технологии IVP. В этих работах источником женских гамет являются яичники половозрелых телок и коров, получаемые при убое рядовых животных на мясокомбинате, а в качестве источника сперматозоидов используется криоконсервированное семя быков. Для осуществления пенетрации ооцитов in vitro сперматозоиды предварительно должны пройти стадию капацитации в среде оплодотворения, при этом условия капацитции для семени разных быков могут существенно различаться. Целью данной работы являлось стандартизировать условия этапа оплодотворения дозревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота для обеспечения его высокой эффективности.
* Младший научный сотрудник.
* Научный сотрудник. " Научный сотрудник.
* Директор, кандидат биологических наук.
* Заведующий отделом, доктор биологических наук.
Материалы и методы. В работе, кроме оговоренных случаев, были использованы реактивы фирмы «Sigma-Aldrich» (США), воду очищали на установке Barnstead EASYpure II RF/UV (Thermo Scientific, США). Среды были приготовлены на основе маточных растворов компонентов [1], хранящихся при 4 или -20 °С. Перед использованием во все рабочие среды и растворы был добавлен гентамицин в количестве 40-50 мкг/мл. Дозревание ооцитов проводили в среде 199 («ПанЭко», Россия) с добавлением 0.66 мМ Na пирувата, 1 мМ L-глутамина, 0.6 мМ L-цистеина, 5 ЕД/мл гонадотропи-на хорионического (Московский эндокринный завод, Россия), 5 мкг/мл фол-ликулостимулирующего гормона («ФСГ-супер», ООО «Агробиомед», Россия), 1 мкг/мл эстрадиола-17р и 10 % фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота (FCS; HyClone, США). Манипуляции с ооцитами, сперматозоидами и эмбрионами на воздухе проводили в модифицированной среде TALP-HEPES [2] (TH). Для оплодотворения использовали модифицированную среду TALP-Fert [3,4] (TF). Приготовленные среды TH и TF хранили при -20°С. Аликвоты сред размораживали однократно и использовали в течение недели. Аликвоты растворов PHE (penicillamine, hypotaurine, epinephrine; [5] и гепарина хранились при -20°С и размораживались перед использованием.
Яичники крупного рогатого скота получали на мясокомбинате и доставляли в лабораторию при температуре 26-30 °С в течение 3-5 часов. Ооциты выделяли из поверхностных антральных фолликулов диаметром 2-8 мм при помощи специального устройства [6]. Ооциты с равномерно гранулированной ооплазмой, окруженные многослойным кумулюсом (КОК), помещали по 30-40 штук в 0.5 мл предварительно эквилибрированной среды дозревания. Дозревание ооцитов проводили в CO2-инкубаторе при температуре 38.5 °С в течение 22-23 часов. Для оплодотворения использовали криоконсервирован-ное семя быков № 1 и № 2. Выделение фракции подвижных сперматозоидов проводили в среде TH по методу swim up. После дозревания ооцитов in vitro КОК переносили в заранее эквилибрированную среду оплодотворения, по 30-40 КОК на 0,4 мл среды TF. Затем в каждую лунку добавляли гепарин, PHE и подготовленные сперматозоиды. Совместное инкубирование ооцитов и сперматозоидов проводили в течение 18-20 часов в СО2-инкубаторе при температуре 38.5 °С.
По завершении этапа оплодотворения предполагаемые зиготы освобождали от клеток кумулюса при помощи Vortex в растворе гиалуронидазы и размещали на культивирование в предварительно эквилибрированную среду mSOF [7]. Культивирование эмбрионов проводили при температуре 38,5 °С в атмосфере 5,6 % СО2, 5,7 % О2, 88,7 % N2 в течение 10 дней. День постановки на оплодотворение считали нулевым (Day 0). Часть зигот в возрасте 1620 часов фиксировали в фиксаторе Карнуа по методу тотальных препаратов, окрашивали ацето-орсеином и оценивали под микроскопом с фазовым кон-
трастом. Наличие в цитоплазме двух нормально развитых пронуклеусов и одного хвоста сперматозоида считали показателями нормального оплодотворения ооцитов, присутствие нескольких хвостов сперматозоидов в сочетании с несколькими пронуклеусами и / или головками сперматозоидов считалось полиспермией.
В серии экспериментов изучалось влияние ряда факторов на эффективность оплодотворения ооцитов крупного рогатого скота in vitro таких, как наличие PHE, концентрация гепарина и сперматозоидов в среде оплодотворения, уровень очистки альбумина (fatty acid free, FAF, или очищенный при помощи фракционирования, Fr V), используемого при приготовлении среды TF. Задачей данной серии являлось определение оптимальных условий оплодотворения in vitro при использовании семени быка № 2. Кроме того, сравнивались уровни развития эмбрионов, полученных при оплодотворении в ранее принятых стандартных условиях и вновь подобранных условиях. Результаты представлены в виде среднего процента от числа одноклеточных эмбрионов (бластоцисты) или от числа бластоцист (вылупившиеся бласто-цисты) ± стандартное отклонение.
Результаты.В нашей предыдущей работе в 2012 году в качестве стандартных условий оплодотворения использовалась среда TF с альбумином BSA А-6003 FAF (fatty acid free; 6 мг/мл), 10 мкг/мл гепарина, 1 х 106 сперматозоидов/мл и PHE. При этом использовалось семя быка № 1. При этих условиях в среднем по 11 экспериментам выход бластоцист в возрасте десяти суток составил 31,37 ± 9,32 % (табл. 3). Из блестящей оболочки в этом возрасте в среднем вылуплялось 69,75 ± 16,51 % бластоцист. При переходе к использованию семени быка № 2 в этих условиях был выявлен высокий, до 63 %, уровень полиспермии. Так как предполагалось в дальнейшем использовать семя быка № 2, применительно к нему была изучена зависимость уровня нормального оплодотворения и полиспермии от отдельных составляющих системы оплодотворения. В зависимости от содержания PHE в среде оплодотворения значительное снижение уровня полиспермии наблюдалось только в случае отсутствия BSA в среде TF (варианты 5 и 6, табл. 1).
В процессе работы произошла замена использовавшегося ранее в составе среды TF альбумина BSA А-6003 FAF (Sigma) на BSA А-3311 Fr V (Sigma). Уровень полиспермии при этом снизился с 87,5 до 25,0 %, соответственно, однако при этом снизился и показатель общей оплодотворяемости ооцитов со 100,0 до 62,5 %, соответственно.
Было изучено влияние соотношения количества гепарина и концентрации сперматозоидов на уровень оплодотворения ооцитов в среде TF, содержащей альбумин А-3311 Fr V (Sigma) в присутствии PHE. При содержании гепарина 0,4 мкг/мл полиспермия не наблюдалась, но при этом показатели общего уровня оплодотворения и нормального оплодотворения оказались низкими - 45,4 и 27,3 %, соответственно (вариант 6, табл. 2).
Таблица 1
Показатели оплодотворения дозревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота при разном сочетании концентрации сперматозоидов, наличия BSA и / или PHE в среде TF
№ Концентрация сперматозоидов 106/мл BSA Количество PHE, мкл Оплодотворено ооцитов
Всего Нормально n (%) Полиспермия n (%) Общий уровень оплодотворения, %
1 1 + 4 24 11 (45,8) 12 (50,0) 95,8
2 0,5 + 4 20 11 (55,0) 5 (25,0) 80,0
3 1 + 2 23 8 (34,8) 8 (34,8) 69,6
4 0,5 + 2 27 8 (29,6) 17 (62,9) 92,5
5 0,5 - 4 19 6 (31,6) 9 (47,4) 84,3
6 0,5 - 0 19 9 (47,4) 3 (15,8) 73,7
7 1 + 4 18 2(11,1) 4 (22,2) 61,1
8 0,5 + 4 21 7 (33,3) 1 (4,8) 71,4
Таблица 2
Влияние содержания гепарина и концентрации сперматозоидов в среде TF с BSA А-3311 и PHE на уровень оплодотворения ооцитов
№ Содержание Сперматозоидов в 1 мл, х 106 Концентрация гепарина, мкг/мл Всего ооцитов Оплодотворено ооцитов
Нормально n (%) Полиспермия n (%) Всего, %
1 0,5 10 21 7 (33,3) 1 (4,8) 71,4
2 1,0 10 18 2(11,1) 4 (22,2) 61,1
3 0,5 2 16 9 (56,2) 6 (37,5) 99,9
4 0,5 2 17 8(47,1) 0 (0,0) 88,2
5 1,0 2 21 5(23,8) 2 (9,5) 71,4
6 0,5 0,4 11 3 (27,3) 0 (0,0) 45,4
В этой серии экспериментов по уровню общего оплодотворения и выходу зигот с двумя нормально развитыми пронуклеусами и наличию одного хвоста сперматозоида в цитоплазме, т.е. с показателями нормального оплодотворения, оптимальным оказалось сочетание содержание в среде оплодотворения гепарина 2 мкг/мл и концентрации сперматозоидов 0,5 х 106 сперматозоидов/мл. При этом общий уровень оплодотворения составлял 88-100 %, а выход нормальных зигот 47-56 % (варианты 3 и 4, табл. 2).
На основании полученных результатов стандартной схемой оплодотворения дозревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота при использовании BSA А-3311 Fr V (Sigma) в среде TF и подготовленных методом swim up сперматозоидов замороженного-оттаянного эякулята быка № 2 в 2013 году было принято:
1. Содержание гепарина в среде оплодотворения 2 мкг/мл.
2. Добавление PHE в конечной концентрации D-пеницилламин 20 mkM, гипотаурин 10 mkM, эпинефрин 1 mkM.
3. Концентрация сперматозоидов в среде оплодотворения 0,5 х 106 сперматозоидов/мл.
При этих условиях в среднем по 13 экспериментам выход бластоцист в возрасте десяти суток составил 43,14 ± 9,00 %. Из блестящей оболочки в этом возрасте в среднем вылуплялось 69,93 ± 9,93 % бластоцист (табл. 3).
Таблица 3
Уровень развития эмбрионов крупного рогатого скота при использовании стандартных условий оплодотворения ооцитов in vitro 2012 года (семя быка № 1) и 2013 года (семя быка № 2)
Условия оплодотворения Количество повторов, n Всего эмбрионов, n Бластоцисты
7 суток 8 суток 10 суток
n (%) Всего n (%) Hatching / hatched, % Всего n (%) Hatched, %
Стандартные условия 2012 года 11 373 89 (23,91±4,77) 109 (29,10±7,66) 40,06±20,95 119 (31,37±9,32) 69,75±16,51
Стандартные условия 2013 года 13 488 140 (29,49±5,62) 190 (39,52±8,28) 27,97±8,69 207 (43,14±9,00) 69,93±9,93
Обсуждение. В среду оплодотворения дозревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота нередко включают раствор, содержащий D-пеницилла-мин, гипотаурин и эпинефрин, PHE. Эти компоненты являются обязательными в системе оплодотворения ооцитов хомяка in vitro [8, 9]. Считается, что гипотаурин и эпинефрин действуют независимо и последовательно для поддержания жизнеспособности и обеспечения оплодотворяющей способности сперматозоидов хомяка in vitro. При оплодотворении ооцитов крупного рогатого скота in vitro гипотаурин и эпинефрин не повысили уровень пе-нетрации сперматозоидов, однако способствовали увеличению зигот с нормально развитыми пронуклеусами [10], повышению уровня развития эмбрионов in vitro[11]. В наших экспериментах включение PHE в среду TF также не являлось определяющим фактором в высоком уровне полиспермии, с которым мы столкнулись при использовании семени быка № 2. На основании этих данных в стандартную систему оплодотворения мы включили PHE.
Для приобретения способности к оплодотворению сперматозоиды быка должны пройти ряд биохимических изменений, так называемый процесс капацитации, который в естественных условиях происходит в репродуктивном тракте самки. В результате сперматозоиды приобретают повышенную подвижность, а изменения свойств мембран головки делают возможными акросомную реакцию и слияние с мембраной ооцита [12-14]. В условиях in vitro эти изменения происходили под воздействием хондроитин сульфата [15]. Затем было показано, что гепарин, другой представитель гликозами-ногликанов, присутствующих в женском репродуктивном тракте, способствует прохождению этапа капацитации сперматозоидов как свежего, так и
замороженного-оттаянного семени быка [3, 16], приводя к повышению внутриклеточного рН, концентрации Ca2+ и цАМФ [17, 18]. Необходимая концентрация гепарина подбирается индивидуально для каждого донора сперматозоидов и может варьировать от 0,2 до 20 мкг/мл, а максимальная активность обычно проявляется при содержании 5-10 мкг/мл в среде [4]. В свою очередь BSA способствует процессу капацитации путем удаления холесте-рола из мембран сперматозоида, что повышает текучесть мембран, приводит к перераспределению мембранных белков и делает возможными точечные слияния акросомной и внешней плазматической мембран во время ак-росомной реакции. В процессе работы мы перешли с альбумина марки BSA А-6003 FAF (Sigma) в составе среды оплодотворения на BSA А-3311 Fr V (Sigma). Был проведен опыт при использовании среды TF, включавшей ту или другую марку BSA, при оплодотворении ооцитов одной партии. При включении в среду TF BSA А-3311 Fr V уровень полиспермии оказался существенно ниже по сравнению с альбумином BSA А-6003 FAF. Однако при этом снизился и показатель общей оплодотворяемости ооцитов (62,5 против 100,0 %, соответственно). Так как предполагалось в дальнейшем использовать в работе именно BSA А-3311 Fr V (Sigma) и криоконсервированное семя быка № 2, при этих условиях было изучено влияние других составляющих на оплодотворение ооцитов in vitro. Наиболее важными факторами могли быть содержание гепарина и концентрация сперматозоидов в среде оплодотворения. При содержании гепарина 0,4 мкг/мл и 0,5 х 106 сперматозоидов/мл полиспермия не наблюдалась, но при этом показатели общего уровня оплодотворения и нормального оплодотворения оказались низкими - 45,4 и 27,3 %, соответственно. Однако при увеличении содержания гепарина до 2 мкг/мл общий уровень оплодотворения составлял 88-100 %, а выход нормальных зигот 47-56 %. Таким образом, сочетание уровня гепарина 2 мкг/мл в среде оплодотворения и содержания сперматозоидов 0,5 х 106 сперматозоидов/мл оказалось подходящим для оплодотворения дозревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота. Это же подтверждается высоким уровнем развития полученных in vitro эмбрионов.
Заключение. В нашей работе было показано, что ключевыми факторами при подборе оптимальных условий оплодотворения ооцитов крупного рогатого скота in vitro являются концентрация гепарина и сперматозоидов в среде оплодотворения, а также качество альбумина, входящего в состав среды. Также была подтверждена необходимость подбора индивидуальных условий оплодотворения для каждого донора спермы.
Список литературы:
1. Whittingham D.G. Culture of mouse ova. J. Reprod. Fertil. 1971. Suppl. 14: 7-21.
2. Bavister B.D., Yanagimachi R. The effects of sperm extract and energy sources on the motility and acrosome reaction of hamster sperm in vitro. Biol. Reprod. 1977; 16: 228-237.
3. Parrish J.J., Susko-Parrish J.L., Leibfried-Rutledge M.L. et al. Bovine in vitro fertilization with frozen-thawed semen. Theriogenology. 1986; 25: 591-600.
4. Parrish J.J., Susko-Parrish J.L., Winer M.A., First N.L. Capacitation of bovine sperm by heparin. Biol. Reprod. 1988; 38: 1171-1180.
5. Bavister B.D. A consistently successful procedure for in vitro fertilization of golden hamster eggs. Gamete Res. 1989; 23: 139-158.
6. Malenko G.P. Device to recover bovine cumulus-oocyte complexes (COCs) without destroying their cumulus layers from antral ovarian follicles. In: Proceedings 15th Meeting European Embryo Transfer Association, Lyon. 1999. P. 198.
7. Tervit H.R., Whittingham D.G., Rowson L.E.A. Successful culture in vitro of sheep and cattle ova. J. Reprod. Fertil. 1972; 30: 493-497.
8. Mrsny R.J, Waxman L, Meizel S. Taurine maintains and stimulates motility of hamster sperm during capacitation in vitro. J Exp Zool. 1979; 210: 123-128.
9. Leibfried M.L., Bavister B.D. Effects of epinephrine and hypotaurine on in vitro fertilization in the golden hamster. J. Reprod. Fert. 1982; 66: 87-83.
10. Ball G.D., Leibfried M.L., Lenz R.W. et al. Factors affecting successful in vitro fertilization of bovine follicular oocytes. Biol. Reprod. 1983; 28: 717-725.
11. Miller GF., Gliedt D.W., Rakes J.M., Rorie R.W. Addition of penicilla-mine, hypotaurine and epinephrine (PHE) or bovine oviductal epithelial cells (BOEC) alone or in combination to bovine in vitro fertilization medium increases the subsequent embryo cleavage rate. Theriogenology. 1994; 41: 689-695.
12. Stewart-Savage J. Effect of bovine serum albumin concentration and source on sperm capacitation in the golden hamster. Biol. Reprod. 1993; 49: 74-81.
13. Osheroff J.E., Visconti P.E., Valenzuela J.P. et al. Regulation of human sperm capacitation by a cholesterol efflux-stimulated signal transduction pathway leading to protein phosphorylation. Mol. Human Reprod. 1999; 5: 1017-1026.
14. Xia J., Ren D. The BSA-induced Ca(2+) influx during sperm capacitation is CATSPER channel-dependent. Reprod. Biol. Endocrinol. 2009; 7: 1-9.
15. Lenz R.W., Ball GD., Lohse J.K. et al. Chondroitin sulfate facilitates an acrosome reaction in bovine spermatozoa as evidenced by light microscopy, electron microscopy and in vitro fertilization. Biol. Reprod. 1983; 28: 683-690.
16. Parrish J.J., Susko-Parrish J.L., First N.L. Effect of heparin and chondroitin sulfate on the acrosome reaction and fertility of bovine sperm in vitro. Theriogenology. 1985; 24: 537-549.
17. Cordoba M., Santa-Coloma T.A., Beorlegui N.B., Becon M.T. Intracellu-lar calcium variation in heparin-capacitated bovine sperm. Biochem. Mol. Biol. International Pages. 1997; 41: 725-733.
18. Dapino D.G, Marin P.E., Cabada M.O. Effect of heparin on in vitro capacitation of boar sperm. Biol. Res. 2006; 39: 631-639.
