CC BY
29
УДК 001.57:577.15:579.22 Романова М.В., Белодед А.В.
ОПТИМИЗАЦИЯ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ СИНТЕЗА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ШТАММАМИ ТЕРМОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ
Романова Мария Васильевна, студентка 4 курса факультета биотехнологии и промышленной экологии, email: romanovamariav@gmail.com:
Белодед Андрей Васильевич, к.б.н., доцент кафедры биотехнологии;
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия
125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20
Изучено влияние двух факторов - концентрации глюкозы и пептона - на протеолитическую активность штаммов термофильных бактерий при помощи ортогонального центрального композиционного планирования эксперимента. В ходе статистической обработки результатов эксперимента были получены уравнения регрессии второго порядка и рассчитаны оптимальные значения концентраций указанных компонентов.
Ключевые слова: термофильные бактерии; протеолитические ферменты; оптимизация питательных сред; ортогональный центральный композиционный план
OPTIMIZATION OF NUTRIENT MEDIUM COMPOSITION FOR SYNTHESIS OF PROTEOLYTIC ENZYMES BY THERMOPHILIC BACRERIA STRAINS
Romanova M.V., Beloded A.V.
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia.
The influence of two factors (concentration of glucose and peptone) on proteolytic activity of thermophilic bacteria strains by central composite design of experiment was studied. During statistical processing of experiment the second order regression equations were obtained and the optimal concentrations of these components were calculated.
Key words: thermophilic bacteria; proteolytic enzymes; optimization of culture media; central composite design
Протеазы являются одними из важнейших промышленных ферментов и находят широкое применение в фармацевтике, пищевой промышленности и производстве моющих средств. Микробные ферменты, в том числе и протеазы, представляют большой интерес из-за невысокой себестоимости, доступности и стабильности [1]. Кроме того, современные методы генетической инженерии позволяют достичь большой продуктивности и получить ферменты с заданными свойствами [2]. Термостабильные ферменты являются перспективными для использования в различных процессах и по сравнению с ферментами мезофильных организмов обладают некоторыми преимуществами, например, лучшей кинетикой за счет повышения температуры процесса, повышения растворимости субстрата, а сам процесс характеризуется снижением риска контаминации [3]. Ферменты, выделенные из термофильных микроорганизмов, обладают значительной устойчивостью к высоким температурам, а также действию растворителей, окислителей и поверхностно-активных веществ [4]. Микробные протеазы различны по своей структуре и функциям,
протеазы, цистеиновые протеазы, аспартатные протеазы, металлопротеазы и другие [1]. Сериновые протеазы являются самыми распространенными среди протеаз микроорганизмов. Термостабильные щелочные протеазы используются в таких областях, как кожевенная и текстильная промышленность, биоремедиация, синтез пептидов, производство стиральных порошков [3].
Целью данной работы являлась оптимизация состава среды для синтеза внеклеточных протеаз с использованием методологии ортогонального центрального композиционного планирования эксперимента.
В качестве продуцента протеаз использовали штаммы Кб.1.Гл.8 и К6.15.Г.38, показавшие высокую протеолитическую активность в предыдущих экспериментах и предварительно отнесенные к роду Bacillus. Культивирование проводили при 50oC в течение 26 часов на питательной среде с постоянной основой следующего состава (г/л): K2HPO4 - 10, дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 4, MgSO4*7H2O - 0,2, MnSO4*5H2O - 0,05. Концентрации глюкозы и пептона варьировались в соответствии с табл. 1
среди них выделяют отдельные классы: сериновые
Таблица 1. Факторы и уровни их варьирования, используемые в ОЦКП.
Фактор Переменная Уровни варьирования факторов
-а (-1,21) -1 0 +1 +а (+1,21)
Глюкоза, г/л Xi 0,76 10 54 98 107,24
Пептон, г/л X2 0,48 3 15 27 29,52
Для определения протеолитической активности биомассу отделяли от культуральной жидкости путем центрифугирования при 8500 об/мин в течение 10 минут, полученный супернатант использовали в качестве источника ферментов. Супернатант инкубировали с 1% раствором казеина в калий-фосфатном буфере (1/15 M, pH 7,6) при 50°С в течение 30 минут. Реакцию останавливали добавлением 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Пробы выдерживали 15 минут и центрифугировали при 8500 об/мин в течение 10 минут, затем измеряли поглощение надосадочной жидкости, разведенной в 3 раза дистиллированной водой, при длине волны 280 нм. В качестве контроля использовали пробы, содержащие раствор казеина, обработанный исходной питательной средой вместо культуральной жидкости, которые готовились параллельно с опытными пробами. По измеренной оптической плотности судили о содержании ароматических аминокислот, которые образовались в ходе гидролиза казеина.
Планирование эксперимента и обработку полученных данных осуществляли по плану второго порядка в соответствии с методологией, представленной в [5]. Статистическую обработку результатов эксперимента проводили с использованием пакета программ MATLAB. Для определения значимости коэффициентов уравнения
регрессии параллельно проводили п опытов в центре плана и рассчитывали дисперсию
воспроизводимости по формуле (1):
_ = ^гр) (1)
п-1
Значимость каждого коэффициента ц определяли с помощью общего неравенства и
г . табл
сравнивали с табличным значением tp по
формуле (2):
гР*~ = _Ы=>Ета6л (2)
где С - диагональные элементы корреляционной матрицы С.
Остаточная дисперсия, характеризующая точность уравнения, при общем числе опытов N и числе значимых коэффициентов р определяли по
формуле (3):
о —
к И-р
, (3)
Адекватность полученного уравнения регрессии проверяли с использованием критерия Фишера, сравнивая с табличным значением ¥р
формуле (4):
табл
по
= ^ < Па0л, (4)
Результаты ортогонального центрального композиционного планирования эксперимента представлены в табл. 2.
Таблица 2. Матрица планирования ОЦКП и результаты определения протеолитической активности КЖ для двух штаммов Кб.1.Гл.8 и Кб.15.Г.38, выраженной через ОП продуктов гидролиза при длине волны 280 нм.
№ Х2 Х| *Х2 ХДБ х22-Б уэксп урасч уэксп урасч
Для Кб.1.Гл.8 Для Кб.15.Г.38
1 -1 -1 1 0,423 0,423 0,172 0,148 0,121 0,101
2 1 -1 -1 0,423 0,423 0,050 0,025 0,078 0,088
3 -1 1 -1 0,423 0,423 0,103 0,082 0,177 0,155
4 1 1 1 0,423 0,423 0,059 0,036 0,084 0,092
5 -1,210 0 0 0,887 -0,577 0,167 0,198 0,105 0,138
6 1,210 0 0 0,887 -0,577 0,063 0,096 0,107 0,091
7 0 -1,210 0 -0,577 0,887 0,136 0,169 0,124 0,131
8 0 1,210 0 -0,577 0,887 0,106 0,136 0,156 0,166
9 0 0 0 -0,577 -0,577 0,383 0,359 0,202 0,192
10 0 0 0 -0,577 -0,577 0,356 0,359 0,193 0,192
11 0 0 0 -0,577 -0,577 0,363 0,359 0,196 0,192
12 0 0 0 -0,577 -0,577 0,369 0,359 0,185 0,192
В ходе обработки результатов эксперимента были получены уравнения регрессии второго порядка, функцией отклика У в которых является оптическая плотность раствора (ОП), содержащего
аминокислоты, которые образовались в ходе гидролиза казеина протеолитическими ферментами, для Кб.1.Гл.8 (5) и Кб.15.Г.38 (6) соответственно:
= 0,01892 + 0,00659 * Х1 + 0,02626* Х2 + 0,00004* Х1*Х2- 0,00008 * Х\ - 0,00098 * Х\, (5) У2 = 0,05173 + 0,00287 * Х1 + 0,00870 * Х2 — 0,00002 * Х±* Х2 — 0,00003* Х\ — 0,00021* ^2, (6)
С использованием необходимого условия существования экстремума функции многих переменных, были рассчитаны координаты экстремальных точек функции отклика, которые соответствуют оптимальным условиям проведения эксперимента. Для штамма Кб. 1.Гл. 8 оптимальные
концентрации глюкозы и пептона составили 47,44 и 14,28 г/л, а для штамма Кб.15.Г.38 - 44,50 и 18,47 г/л соответственно. На рис. 1 показаны поверхности отклика протеолитической активности исследуемых штаммов, звездочкой отмечены максимальные значения функции отклика.
ОП
Ca. е/з
№
т Of. г/7
Сл. г/л
Рисунок 1. Поверхности отклика протеолитической активности для штаммов Кб.1.Гл.8 (а) и Кб.15.Г.38 (б). ОП -оптическая плотность, Сгл - концентрация глюкозы, г/л, Сп - концентрация пептона, г/л.
В результате проведенных исследований было изучено влияние концентраций глюкозы и пептона в питательной среде на протеолитическую активность штаммов термофильных бактерий. При помощи методологии ортогонального центрального композиционного планирования эксперимента были получены уравнения, описывающие данную зависимость. Уравнения регрессии являются адекватными и включают в себя значимые коэффициенты. Рассчитаны оптимальные значения концентраций указанных компонентов, которые можно использовать для дальнейшего изучения синтеза протеолитических ферментов штаммами Кб.1.Гл.8 и К6.15.Г.38.
Список литературы
1. Banerjee G., Ray A. Impact of microbial proteases on biotechnological industries // Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 2017. Vol. 33. № . 2. P. 119-143.
2. Rigoldi F, Donini S., Redaelli A. et al. Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications // APL Bioengineering. 2018. Vol. 1. № 1. P. 1-17.
3. Kamran A., Ur Rehman H., Ul Qader S. et al. Purification and characterization of thiol dependent, oxidation-stable serine alkaline protease from thermophilic Bacillus sp. // Journal of Genetic Engineering and Biotechnology. 2015. Vol. 13. № 1. P. 59-64.
4. Barzkar N., Homaei R., Hemmati R. et al. Thermostable marine microbial proteases for industrial applications: scopes and risks // Extremophiles. 2018. Vol. 22. № 3. P. 335-346.
5. Гартман Т. Н., Клушин Д. В. Основы компьютерного моделирования химико-технологических процессов: Учебное пособие для вузов. - М.:ИКЦ «Академкнига», 2008. - 416 с.
