CC BY
25
Серия «Биология. Экология»
2008. Т. 1, № 2. С. 3-6 Онлайн-доступ к журналу: Шр://ієи. гиЛэтеБЙа
И З В Е С Т И Я
Иркутского
государственного
университета
УДК 577.151.01
Термофильная и алкалофильная бактерии из экстремальных водных экосистем Бурятии -продуценты внеклеточных протеаз
Е. В. Лаврентьева1, А. П. Шагжина1, А. А. Раднагуруева 1,
Б. Б. Намсараев1, Я. Е. Дунаевский2
1Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ,
2НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского, МГУ им. М. В. Ломоносова, Москва Е-шаИ: [email protected]
Аннотация. Была изучена динамика накопления протеолитической активности в процессе роста культур П1 и Ц3 в зависимости от источника азота. Культуры выделены из донных осадков гидротермы пос. Горячинск и содово-соленого озера Соленое. Штаммы активно продуцируют протеазу, гидролизующую специфичный для субтилизинподобных протеиназ синтетический субстрат Г ААЛП, наибольшая активность наблюдается на 24-й час роста культур. Протеазы стабильны при температуре 40-50 оС и рН 6,0-11,3. Ингибиторный анализ показал, что при добавлении до 1 мМ ФМСФ наблюдается полное ингибирование протеолитической активности. Данные ингибиторного анализа и субстратной специфичности наиболее активных внеклеточных протеаз штаммов П1и Ц3 указывают на их принадлежность к классу сериновых протеаз субтилизинпо-добного типа.
Ключевые слова: протеазы, протеолитическая активность, субстратная специфичность, ингибиторный анализ.
Щелочные гидротермы и содово-соленые озера Бурятии являются экстремальными экосистемами, представляющими значительный интерес как для фундаментальных исследований, так и при решении ряда практических задач. Термофильные, алкалофильные и алкало-толерантные бактерии водных экосистем привлекательны повышенной устойчивостью промышленных штаммов к контаминации посторонней микрофлорой, что крайне важно в производстве стандартизованного ферментного препарата. Среди секретируемых внеклеточных ферментов важная роль принадлежит протеазам, принимающим активное участие в использовании микроорганизмами органических субстратов [7].
Выделенные протеазы находят применение в различных областях биотехнологии - от индустриального производства гидролитических ферментов для детергентов до использования в генетических и молекулярно-биологических исследованиях [6; 8].
Исследования, касающиеся внеклеточной протеолитической активности гетеротрофных термофильных и алкалофильных бактерий из экстремальных водных систем Бурятии, практически полностью отсутствуют. Целью работы являлось изучение термофильной и алкало-
фильной бактерий из экстремальных водных экосистем Бурятии - продуцентов внеклеточных протеаз
Материалы и методы
Источник выделения и условия культивирования. Из донных осадков гидротермы Горячинск и содово-соленого озера Соленое были выделены 2 аэробные гетеротрофные бактерии. Выделенные штаммы обозначены как П1 и Ц3, соответственно. Культивирование штамма П1 проводили на мясо-пептонном бульоне при 55 оС в статических условиях. Штамм Ц3 инкубировали на среде следующего состава (г/л): КН2РО4 - 1,0; МеСЬ • 7Н2О - 0,2; ^2С03 - 10; глюкоза - 10; пептон - 5; дрожжевой экстракт (ДЭ) - 5. рН среды устанавливали равной 9,5, концентрацию №С1 - 40 г/дм3. Пробы культивировали стационарно в течение 3 суток при температуре 30 оС.
Определение протеолитической активности. После инкубации клетки осаждали центрифугированием (13000 е, 15 мин); полученный супернатант использовали для определения активности протеаз. Общую активность измеряли по гидролизу 1 % раствора желатины при рН равное 8,0, с помощью метода тринит-рофенилирования [5]. Специфическую актив-
ность секретируемых протеаз определяли на 5 мМ п-нитроанилидных субстратах: N-бензоил-Ь-аргинил-п-нитроанилид (БАПА), пироглута-мил-аланил-аланил-лейцил-п-нитроанилид (ГААЛП). Протеолитическую активность по отношению к синтетическим субстратам определяли спектрофотометрически при 410 нм по количеству образовавшегося п-нитроанилида [4].
Определение оптимума pH-активности и pH-стабильности фермента. Для определения оптимума и стабильности pH секретируемой протеиназы по отношению к синтетическим субстратам были использованы 0,02 М растворы цитратно-фосфатного, трис-HCl и глицин-NaOH буферов в диапазоне pH от 2,9 до 11,6. Определение активности проводили как описано выше.
Определение температурного оптимума и температурной стабильности. Температурный оптимум и стабильность фермента определяли, измеряя активность фермента при значениях температуры от 30 до 90 оС. Активность определяли стандартным методом при 37 оС.
Ингибиторный анализ. Для выяснения природы функциональных групп активного центра использовали ингибиторы сериновых протеаз -фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), трипсиноподобных протеаз - хлорметилкетон то-зил-Ь-лизина (ТЛХК), химотрипсиноподобных протеаз - хлорметилкетон тозилфенилаланина (ТФХК), цистеиновых протеаз - йодацетамид (ИАА), металлопротеаз - этилендиаминтетра-ацетат (ЭДТА).
Результаты и обсуждение.
Из донных осадков гидротермы Горячинск и содово-соленого озера Соленое были выделены 2 аэробные гетеротрофные бактерии. Минеральный источник Горячинск характеризуется высокими значениями температуры (50,1 оС) и рН (9,0). В содово-соленом озере Соленое отмечены высокие значения рН (9,9) и общая минерализация (5,6 г/дм3).
Выделенные штаммы показали активный и стабильный рост при различных значениях температуры и рН:
- Штамм П1:
t min при 45 оС, t opt = 60 оС и t max = 70 °Q
- Штамм Ц3:
рН min при 7,0, рН opt = 9,0 и рНтах = 11,0.
Изучение физиологических параметров показало, что штамм П1 отнесен к группе умеренных термофилов. По отношению к рН штамм Ц3 является алкалофилом.
На основании данных неполного секвени-рования генов 16S рРНК штамм П 1 имеет сходство 99,3 % с представителями рода бацилл Anoxybacillus pushchimensis и A. bogrovi-ensis. Результаты анализа последовательности 16S рРНК штамма Ц3 показали 100 % гомологию с известным алкало- и галофильным видом р. Bacillus: B. krulwichiae.
Внеклеточная протеолитическая актив-
ность. Штаммы П1 и Ц3 были исследованы на способность секретировать внеклеточные про-теазы, активные на различных синтетических субстратах: БАПА, ГААЛП, ФПА, общая активность протеаз определена на желатине и азоказеине. Была изучена динамика накопления протеолитической активности в процессе роста этих культур и в зависимости от источника азота.
Изучение спектра протеаз, секретируемых различными штаммами, выявило, что как штамм П1, так и Ц3, активно продуцируют протеазу, гидролизующую специфичный для субтилизинподобных протеиназ синтетический субстрат ГААЛП. Остальные активности, присутствующие в среде, имели заметно более низкие уровни.
Анализ изменения активности внеклеточных протеаз в процессе роста выявил характерные особенности штаммов П1 и Ц3 в динамике роста культур и накоплении ферментов.
Следует отметить, что наибольшая активность внеклеточных протеаз наблюдается через 24 ч роста культур. При этом момент повыше -ния внеклеточной протеолитической активности совпадает с замедлением роста культур. Сходные результаты по динамике накопления протеаз были получены при изучении Bacillus pumilus КММ 62 [2].
Определение оптимумов pH и Т-активности и pH и Т-стабильности фермента. Было изучено влияние температуры и рН на активность и стабильность наиболее представленной внеклеточной протеазы, гидролизующей ГААЛП.
Протеиназы штамма П1 проявляют максимум активности при 55-70 оС. Протеиназы штамма Ц3 наиболее активны при 30-40 оС. Температурный оптимум фермента штамма П1 составил 60 оС, фермент сохранял более 70 % активности при температуре до 70 оС.
Исходя из полученных данных можно заключить, что культуры стабильны до 40-50 оС, при этом повышение до 70 оС (в течение 20 мин) приводит к практически полной потере ферментативной активности.
ТЕРМОФИЛЬНАЯ И АЛКАЛОФИЛЬНАЯ БАКТЕРИИ ИЗ ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМ БУРЯТИИ 5
Ранее другими авторами отмечалось, что высокая термостабильность присуща практически всем представителям семейства субтили-зиноподобных протеаз, в том числе бациллярным субтилизинам, например, субтилизину 72 и термитазе [1].
Исследование влияния рН на субтилизино-подобные протеиназы, секретируемые штаммами П1 и Ц3, показало, что протеиназы стабильны при рН 6,0-11,3. Протеиназа штамма П1 проявляла максимальную активность при рН 10,5 и была стабильна в интервале от 6,1 до 11,0. Штамм Ц3 активен при рН 8,17-8,8 и стабилен от 7,5 до 11,3. По данным литературы известно, что многие бактериальные субтили-зинподобные протеиназы сохраняют активность при высоких значениях рН. К ним относятся субтилизин Sendai из Bacillus sp G-825-6, который сохраняет стабильность при рН 12,0, AprP из Bacillus pumilus TYO-67 (pH 9,0) и другие. Такая стабильность, как правило, обусловлена более ригидной и гидрофобной поверхностной областью белковой глобулы субтилизи-нов [3].
Результаты сравнительного анализа функциональных групп активного центра показали, что активность исследуемых ферментов полностью ингибировалась ФМСФ - специфическим ингибитором сериновых протеаз. Данные ингибиторного анализа показали, что при добавлении ФМСФ до 1 мМ наблюдается полное ингибирование внеклеточной протео-литической активности по отношению и к белковому субстрату.
Дальнейшие исследования влияния ингибиторов активного центра выявили, что ТФХК и ТЛХК - ингибиторы химотрипсин- и трипсин-подобных ферментов оказались неэффективны по отношению к этой активности. Ингибиторы других классов протеаз - металлопротеаз, цис-теиновых протеаз - не действовали на изученные ферменты или действовали очень слабо. Исходя из результатов ингибиторного анализа и субстратной специфичности, можно предположить, что секретируемые ферменты штаммов П1 и Ц3 относятся к классу сериновых протеаз субтилизин-подобного типа.
Таким образом, в настоящем исследовании нами были выделены и охарактеризованы два штамма аэробных гетеротрофных бактерий. Филогенетически штамм П1 наиболее близок видам Anoxybacillus pushchimensis и Anoxyba-
cillus bogroviensis, а штамм Ц3 виду B. krul-wichia. Показано, что внеклеточная протеоли-тическая активность у штаммов П1 и Ц3 обладает высокой субстратной специфичностью. Активная секреция внеклеточных ферментов совпадает с замедлением роста культур во время пост-экспоненциальной фазы. Данные ингибиторного анализа и субстратной специфичности наиболее активных внеклеточных протеаз штаммов П1 и Ц3 указывают на их принадлежность к классу сериновых протеаз субтилизин-подобного типа. Штаммы П1 и Ц3 показали высокую активность и стабильность сериновых протеаз при высоких значениях температуры и рН.
Литература
1. Котлова Е. К. Сериновая тиолзависимая протеиназа Paecilomyces lilacinus: выделение и свойства / Е. К. Котлова [и др.] // Биохимия. - 2007. -Т. 72, вып. 1. - С. 137-144.
2. Маликова Л. А. Условия биосинтеза внеклеточной субтилизиноподобной протеиназы Bacillus pumilus KMM 62 / Л. А. Маликова [и др.] // Микробиология. - 2007. - Т. 76, вып. 3. -
С. 313-320.
3. Михайлова Е. О. Выделение и характеристика субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis AJ 73, на разных фазах роста бацилл / Е. О. Михайлова [и др.] // Биохимия. -2007. - Т. 72, вып. 2. - С. 228-235.
4. Erlanger B. F. Proteinases activity in biological substrats / B. F. Erlanger, N. Kokowsky, W. Cohen // Arch. Biochem. Biophis. - 1961. - Vol. 95. - P. 271-278.
5. Habeeb T. S. Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid / T. S. Habeeb // Analyth. Biochem. - 1966. - Vol. 14. -P. 328-336.
6. Sunna A. Identification of Bacillus kaustophi-lus, Bacillus thermocatennulatus and Bacillus strain HSR as members of Bacillus thermoleovorans / A. Sunna [et al.] // System. Appl. Microbiol. - 1997. -Vol. 20. - P. 232-237.
7. Ward O. P. Proteolytic enzymes / O. P. Ward // In. M. Moo-Young Editor. Comprehencive Biotechnol, 1985. - Vol. 3. - P. 789-818.
8. Zeikus J. Thermozymes: Biotechnology and structure-function relationship / J. Zeikus, C. Vielle, A. Savchenko // Extremophiles. - 1998. - Vol. 1. -P. 179-183.
Серия «Биология. Экология» 2008. Т. 1, № 2
Thermophilic and alkaliphilic bacteria isolated from extreme aqua ecosystems of Buryatia - producers of extracellular protease
Lavrentieva E. V.1, Shagzhina A. P.1, Radnagurueva A. A.1, Namsaraev B. B.1, Dunaevskiy Y. E.2
'Institute of General and Experimental Biology SB of RAS, Ulan-Ude,
2Belozersky Research Institute for Physical-Chemical Biology, MSU, Moscow
Abstract. Dynamics of accumulation of proteolytic activity during growth of cultures n1 and ^ depending on a source of nitrogen has been studied. Cultures are allocated from ground deposits of hydroterms Goryachinsk and soda-saline lake Solenoe. Strains actively produce protease, which hydrolyze a specific for subtilizinlike proteinases synthetic substratum GAALP, the greatest activity is observed on 24 h growth of cultures. Protease are stable at temperature 40-50 oC and pH 6,0-11,3. Inhibit analysis has shown, that at addition up to 1 mM FMSF the full inhibition of proteolytic activity is observed. Data of the inhibit analysis and substrate specificity of the most active extracellular protease of the strains n1n ^ indicate to their accessory to a class of serine protease of the subtilizinlike type.
Key words: protease, proteolytic activity, substrate specificity, inhibit analysis.
Лаврентьева Елена Владимировна Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН
670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6 кандидат биологических наук тел. (301 2) 43-49-02 Е-шаИ: [email protected]
Шагжина Айви Петровна
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН
кандидат биологических наук 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6 тел. (301 2) 43-49-02 Е-шail: [email protected]
Раднагуруева Арюна Александровна Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН аспирант
670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6 тел. (301 2) 43-49-02
Намсараев Баир Бадмабазарович
Институт общей и экспериментальной биологии
СО РАН
670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6 доктор биологических наук, профессор зав. лабораторией микробиологии тел: (301 2) 43-49-02 Е-шail: [email protected]
Дунаевский Яков Ефимович Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова
Научно исследовательский институт физикохимической биологии им. А. Н. Белозерского 119991, г. Москва, Ленинские горы, строение А 40 доктор биологических наук, профессор, ст. науч. сотр. отдела иммуномодуляторов тел. (495) 938-55-51 Е-шail: [email protected]
Lavrentieva Elena Vladimirovna
Institute of General and Experimental Biology of SB
RAS
670047, Ulan-Ude, 6, Sakhyanovoi St.
Ph. D. in Biology phone: (301 2) 43-49-02 Е-mail: [email protected]
Shagzhina Aiva Petrovna
Institute of General and Experimental Biology of SB RAS
670047, Ulan-Ude, 6, Sakhyanovoi St.
Ph. D. in Biology phone: (301 2) 43-49-02 Е-mail: [email protected]
Radnagurueva Aryuna Aleksandrovna
Institute of General and Experimental Biology of SB
RAS
670047, Ulan-Ude, 6, Sakhyanovoi St. doctoral student phone: (301 2) 43-49-02
Namsaraev Bair Badmabazarovitch
Institute of General and Experimental Biology SB RAS
670047, Ulan-Ude, 6, Sakhyanovoi St.
D. Sc. in Biology, Prof., Head of Laboratory of Microbiology
phone: (301-2) 43-42-11, fax: (301-2) 43-30-34 Е-mail: [email protected]
Dunaevskiy Yakov Efimovitch Moskov State University
Belozersky Research Institute for Physical-Chemical Biology, 125212, Moscow, b. A40, Vorobyevy Gory
D. Sc. in Biology,Prof leading research scientist, Department of Immunomodulators phone: (495) 938-55-51 Е-mail: [email protected]
