CC BY
106
Е.В. Лаврентьева, А.А. Раднагуруева, Б.Б. Намсараев ПРОТЕАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ Bacfflus hemi'ce//u/osofyt/cum*
* Работа выполнена при поддержке грантов МО РФ РНП 2.1.1/2165,
НОЦ «Байкал», Программ президиума СО РАН 38 и 95.
Изучены характеристики протеаз у культуры Ur-6, выделенного из горячего источника Уро. Показано, что культура обладает высокой субтилизиноподобной, аминопептидазной активностями. Протеаза очищена с выходом 10%.
Ключевые слова: внеклеточные протеазы, Bacillus hemicellulosolyticum.
УДК 576.807.8
E.V. Lavrentieva, A.A. Radnagurueva, B.B. Namsaraev
PROTEASE ACTIVITY OFBad/us ftemi'ce/u/osofyti'cum
Protease characteristics of strain Ur-6 are studied. It is shown, that culture possess high subtilizin-like and amin-opeptidase activities. Protease was cleared with the release of 10%.
Key words: extracellular activities, Bacillus hemicellulosolyticum.
Щелочные гидротермы Байкальского региона являются экстремальными экосистемами, в которых активно развиваются термофильные аэробные алкалофильные и алкалотолерантные бактерии [2].
В естественных условиях обитания бактериям, как правило, необходимо секретировать разнообразные внеклеточные ферменты, которые разрушают сложные природные органические вещества. Большинство секретируемых ферментов бактерий являются гидролазами, действующими на полисахариды, белки, липиды и нуклеиновые кислоты. Секретируемые гидрола-зы бактерий в последние годы вызывают все больший интерес как модельные объекты при исследовании отдельных регуляторных процессов и как перспективные для промышленного использования ферменты. В частности, протеазы широко используются в биотехнологии, в молекулярной биологии, находят применение в различных биохимических исследованиях и медицине [3]. Особенно перспективным является применение ферментов бактерий, так как бактерии обладают широким набором различающихся по субстратной специфичности протеаз.
Целью данного исследования явилось изучение протеазной активности культуры иг-6, выделенной из щелочного источника Уро (Северное Прибайкалье).
Объекты и методы исследования
В качестве источника секретируемых протео-литических ферментов использовали культуральную жидкость культуры Ur-б, выделенную из микробного мата горячего источника Уро. Выделенный штамм Ur-б относится к представителю рода Bacillus. Наибольшее сходство у культуры Ur-б выявлено с Bacillus hemicellulosolyticum C-11 (99%).
Определение внеклеточной протеазной активности в культуральной жидкости у изученных культур проводили по методу Эрлангера с соавт. [4], используя 5 мМ пара-
нитроанилидные субстраты протеаз-
трипсиноподобных, химотрипсиноподобных, субтилизиноподобных, цистеиновых и амино-пептидаз (BAPA, GlpFpNA, GlpAALpNA, GlpFApNA и TpNA, ApNA, LpNA, соответственно), и на белковом субстрате азоказеине, используемом для определения общей активности. Для изучения влияния различных белков на секрецию протеаз к среде Пфеннига добавляли следующие белки (в конечной концентрации 1%): казеин, желатин, пептон, чтобы изучить зависимость секреции ферментов от суток культивирования культуральную жидкость отбирали через 12, 24, 36 и 48 ч. В работе использовались ингибиторы металлопротеаз - этилендиаминтетра-ацетат Na (ЭДТА), цистеиновых протеаз - иод-ацетамид (ИАА) и сериновых протеаз - фенил-метилсульфонилфторид (ФМСФ) [1].
Результаты исследования
Культура Ur-б была исследована на способность секретировать внеклеточные протеазы на различных синтетических субстратах. Была изучена динамика накопления протеолитической активности в процессе роста культуры. Определение субстратной специфичности показало, что
изученный штамм не гидролизует субстраты, специфичные для химотрипсинподобных и цис-теиновых протеиназ, независимо от времени культивирования (до 60 ч) и источников органического азота (триптон, казеин и желатин). Результаты исследования зависимости активности протеиназ от температуры культивирования показали, что наиболее высокая активность на субстрате для субтилизиноподобных протеиназ обнаружена при 500С. При этой температуре максимальная удельная активность у культуры Иг-6 обнаружена на 12 ч культивирования и составила 3,24 ед/мг.
В целом отмечено, что культура Иг-6, кроме субтилизиноподобной, обладает высокой ами-нопептидазной активностью. Характерно, что наибольшая активность по субстрату для субти-лизиноподобных протеиназ обнаружена на среде с триптоном. Добавление в среду желатина или казеина приводило к слабой индукции суб-тилизиноподобных протеиназ.
Выделение протеолитических ферментов проводили из культуральной жидкости, процедура очистки внеклеточных протеаз у штамма Ur-6 включала несколько последовательных стадий.
На первой стадии белки культуральной жидкости осаждали сульфатом аммония (80% насыщения). На следующей стадии очистки использовали метод ионообменной хроматографии с использованием колонки Mono Q. Предварительно перед нанесением на колонку белки обессоливали и концентрировали в ячейке «Амикон» с мембраной РМ-10 при 40С (рис. 1). Третьей стадией очистки стала гель-хроматография на колонке Superdex-75. Активность фермента определяли по субстрату субти-лизиноподобных протеиназ - GlpAALpNA. В результате внеклеточная протеиназа штамма Ur-6 была очищена с выходом 10%.
Степень очистки протеазы из культуральной жидкости на различных стадиях выделения представлена в таблице 1.
Рис. 1. Гель-фильтрация культуры Иг-6 на Сефадексе 0-50
Таблица 1
Степень очистки протеазы, активной по БАПА, секретируемой A.alternata
на 5 сутки культивирования
Стадия очистки Кол-во белка в 1 мл Кол-во белка, мг во всем материале Общий объем после процедуры, мл Общая активность, ед Удельная активность Ст. очи- стки Выход, %
Культуральная жидкость 10,9 10900 1000 18 1,65 1 100
КЖ после осаждения сульфатом аммония 3,43 37,7 11 869 253,4 153 53
Концентрирование на ячейке Ami-con (Ионообменная хроматография МоноQ) 0, 229 2,26 9,9 188,1 821 497 45,1
Г ель-фильтрация 0,027 1,35 49,9 36 1333 807 9,98
Проведенный нами анализ функциональных ОІрЛЛЬрКЛ у культуры Иг-6 подавляется спе-
групп активного центра показал, что активность цифическим ингибитором сериновых протеиназ
внеклеточных протеиназ по субстрату - фенилметилсульфонилфторидом (ФМСФ).
Таблица 2
Ингибиторный анализ функционального центра
Ингибитор Ур-6
ФМСФ 1 (ст.) 9,7
ЕДТА 94
IAA 100
ДТТ 96
Спирт 98
Ингибиторы цистеиновых протеиназ - йод-ацетамид (ИАА) и металлопротеиназ - этилен-диаминтетраацетат (ЭДТА) либо совсем не оказывали влияния на активность, либо подавляли активность в незначительной степени (табл. 2). Представленные данные вместе с данными о предпочтительном субстрате исследуемых ферментов позволяют отнести их к классу серино-вых протеиназ субтилизиноподобного типа.
Литература
1. Досон Р., Эллиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика: пер. с англ. - М.: Мир, 1991. - 544 с.
2. Кевбрин В.В. Термофильные алкакофильные микроорганизмы // Тр. Ин-та микробиологии им. С.Н. Виноградского. Вып. 14: Алкалофильные микробные сообщества. - М.: Наука, 2007.- С. 374-396.
3. Ward O.P. Proteolytic enzymes. In. M. Moo-Young Editor. Comprehencive Biotechnol. - 1985. - V.3. - P. 789-818.
4. Erlanger B.F., Kokowsky N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin // Arch. Biochem. Biophis. - 1961. - V.95. - P. 271-278.
Лаврентьева Елена Владимировна - кандидат биологических наук, научный сотрудник Института общей и экспериментальной биологии СО РАН, старший преподаватель кафедры экспериментальной биологии БГУ, 670047, Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, ИОЭБ СО РАН, тел. (раб.): 8(3012)43-49-02, факс: 8(3012)43-30-34; 670000, Улан-Удэ, ул. Смолина, 24а, БГУ, тел. (деканат): 8(3012)21-15-93, факс: 8(3012)21-05-88, е-mail: lena l@mail.ru
Раднагуруева Арюна Арсалановна - аспирант Института общей и экспериментальной биологии СО РАН. 670047, Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, тел. (раб.): 8(3012)43-49-02, е-mail: aryuna rg@mail.ru
Намсараев Баир Бадмабазарович - доктор биологических наук, зав. лабораторией микробиологии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН, зав. кафедрой экспериментальной биологии БГУ, 670047, Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, ИОЭБ СО РАН, тел. (раб.): 8(3012)43-49-02, факс: 8(3012)43-30-34; 670000, Улан-Удэ, ул. Смолина, 24а, БГУ, тел. (деканат): 8(3012)21-15-93, факс: 8(3012)21-05-88, е-mail: bair n@mail.ru
Lavrentieva E/ena Vladimirovna - candidate of biological sciences, research worker of ICEB SD RAS, microbiology laboratory, tel.: 8(3012)43-49-02, lena_l@mail.ru
RadnaguruevaAryunaArsa/anovna- post-graduate student of microbiology laboratory of ICEB SD RAS, tel.: 8(3012)43-49-02, e-mail: aryuna_rg@mail.ru
Namsaraev Bair BadmabazarovicA - professor, doctor of biological sciences, head of department of experimental biology, BSU, head of microbiology laboratory of ICEB SD RAS, tel.: 8(3012)43-49-02, tel.: 8(3012)21-15-93.
УДК 582.28: 577.15 И.П. Осипова, А.Б. Инкежинова, Э.В. Данилова
ПРОТЕАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ БАКТЕРИЙ МИНЕРАЛЬНЫХ ИСТОЧНИКОВ
ВОСТОЧНЫХ САЯН*
* Работа выполнена при финансовой поддержке грантов МО РФ РНП.2.1.1./2165,
СО РАН № 58 и № 95, РФФИ № 10-04-01185а
Определена протеазная активность бактерий минеральных источников Восточных Саян. Показано, что внеклеточная протеаза активизируется на 3 и 4 сутки в матах и на в 2 сутки в иле.
Ключевые слова:минеральные источники, маты, ил, внеклеточная протеаза, бактерии.
I.P. Osipova, A.B. Inkezhinova, E.V. Danilova
PROTEASE ACTIVITY OF MINERAL SPRINGS OF THE EASTERN SAYANS
