CC BY
101
УДК 627.8
ББК 28.072.527 А.А. Раднагуруева, Е.В. Лаврентьева, Я.Е. Дунаевский
ПРОТЕОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ АЛКАЛОФИЛЬНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
ВОДНЫХ СИСТЕМ ЗАБАЙКАЛЬЯ
Была изучена динамика накопления протеолитической активности в процессе роста культур бактерий 2а, За, 10а, Х4, С1К на различных источниках азота. Штаммы активно продуцировали протеазы, гидролизующие специфичный для субтилизинподобных протеиназ синтетический субстрат GlpAALpNA, наибольшая активность отмечена на Зб-9б ч. культивирования. Протеазы стабильны при температуре 23-50РС и рН 7,98-11,3. Данные субстратной специфичности наиболее активных внеклеточных протеаз штаммов указали на их принадлежность к классу сериновых протеаз субтилизин-подобного типа.
Ключевые слова: субстратная специфичность, сериновые протеазы субтилизин-подобного типа, щелочные водные системы, алкалофильные, алкалотолерантные бактерии.
A.A. Radnagurueva, E.V. Lavrentieva, Ya.E. Dunaevsky
PROTEOLYTIC ACTIVITY OF THE ALKALIPHILIC MICROORGANISMS OF WATER SYSTEMS OF ZABAIKALIE REGION
The dynamic of accumulation of proteolytic activity during growth of bacteria cultures 2 а, За, 10а, Х4, С1К on various sources of nitrogen was studied. Strains actively produced proteases hydrolizing specific for subtilizin-like pro-teinases synthetic substratum GlpAALpNA, the greatest activity is noted on 3б-9б h. of cultivation. Proteases are stable at temperature 23-50оС and рН 7,98-11,3. Data substrate specificity of the most active extracellular proteases of the strains have indicated to their accessory to a class for serine proteases of subtilizin-like type.
Key words: alkaline, water systems, alkalotolerant bacterium.
Щелочные водные системы широко распространены в Забайкалье и представляют значительный интерес как для фундаментальных исследований, так и практического использования. Они представляют собой уникальные экосистемы, в которых экстремально высокие значения рН сочетаются с высокими концентрациями солей вплоть до насыщающих [1]. В этих условиях широко развиваются ал-калофильные и алкалотолерантные бактерии, представляющие интерес как продуценты внеклеточных ферментов. Среди ферментов, которые они синтезируют, важная роль принадлежит протеазам, принимающим активное участие в использовании микроорганизмами органических субстратов. Производство ферментов занимает одно из ведущих мест в современной биотехнологии и относится к отраслям, объем продукции, которых постоянно растет, а сфера применения неуклонно расширяется. Такое быстрое развитие связано с тем, что ферменты являются высокоактивными, нетоксичными биокатализаторами белкового происхождения, которые широко распространены в природе, без которых невозможно осуществление многих биохимических процессов и жизнь в целом [2].
Целью нашей работы было изучение внеклеточной протеолитической активности алкалофильных и алкалотолерантных культур, выделенных из содово-соленых озер Забайкалья.
Объекты и методы исследования
В работе были использованы алкалофильные культуры 2а, 8а, 10а, Х4, С1К из коллекции ИОЭБ СО РАН, выделенные из содово-соленых озер Забайкалья.
Штаммы были исследованы на способность секретировать внеклеточные протеазы, активные на различных пара-нитроанилидных субстратах 4 групп сериновых протеиназ - трипсиноподобных, хи-мотрипсиноподобных, субтилизиноподобных и цистеиновых (BAPA, GlpFpNA, GlpAALpNA и glpFheAlapNA соответственно), методом Эрлангера и др. [3] и на белковом субстрате азоказеин для определения общей активности. Изучена динамика накопления протеолитической активности в процессе роста этих культур (12-108 ч. культивирования) в зависимости от источника азота (неорганический азот - NaNO3, органический азот - казеин и пептон). Протеолитическую активность определяли спектрофотометрическим методом при 410 нм, активность по азоказеину при 440 нм.
Результаты и обсуждение
Определение общей активности по азоказеину. Штаммы были исследованы на способность секре-тировать внеклеточные протеазы для определения общей активности на азоказеине.
По результатам определения активности на азоказеине было отмечено, что культуры 2А, 8 А, 10А, Х4 показали высокую активность на среде с минеральным источником азота (NN03). Максимум активности (рис. 1) у культуры 2А (0,211 ед/мл) на 36 ч, 8А (0,41 ед/мл) на 96 ч, 10А (0,386 ед/мл) и Х4 (0,08 ед/мл) на 84 ч культивирования. Культура С1К показала высокое значение (0,479 ед/мл) на 108 ч культивирования на среде с пептоном.
Активность по азоказеину
—♦—2а
10а
х4
Рис. 1. Изменение протеазной активности по азоказеину в процессе культивирования у культур 2а, 8а, 10а, С1К
Изучение внеклеточной протеолитической активности на синтетических субстратах и определение молекулярной массы фермента. Данные показали, что из ряда культур: 2А, 8А, 10А, Х4 и С1К наибольшая активность обнаружена у культуры 2 А и С1К. Остальные активности, присутствующие в среде, имели заметно более низкие значения. Показано, что культуры 2а, С1К обладают высокой протеолитической активностью по субстрату GlpAALpNA, активности по GlpFpNA, GlpFheAlapNA отсутствовали практически полностью. Пик активности по субстрату GlpAALpNA наблюдался на среде с неорганическим азотом (рис. 2) на 36 ч культивирования у культур 2а и С1К, на среде с казеином (рис. 3) высокую активность показала культура 2а (0,48 ед) через 24 ч культивирования, на среде с пептоном (рис. 4) культура С1К показала максимум активности через 108 часов и составила 1,38 ед.
Протеазная активность (№N03)
Рис. 2. Изменение протеазной активности культуральной жидкости в процессе культивирования на среде с №N63
Протеазная активность (казеин)
2а
-с1к
24 36 48 84 96 108
Время отбора, ч
Рис. 3. Изменение протеазной активности культуральной жидкости в процессе культивирования на среде с казеином
Рис. 4. Изменение протеазной активности культуральной жидкости в процессе культивирования на среде с пептоном
По результатам проведенных исследований можно заключить, что протеолитическая активность зависит от природы источника азота (органический, минеральный азот), концентрации азота и времени культивирования штаммов. Показано, что наибольшая активность протеаз обнаружена на минеральном источнике азота (3,209 ед/мл) при концентрации азота 1,5% на 3 сутки культивирования.
Полученные данные показали, что существенный вклад в протеолитическую активность культур 2а, С1К, по-видимому, вносят протеиназы с субтилизинподобной специфичностью, гидролизующие GlpAALpNA.
Использованный метод определения молекулярных масс - гель-фильтрация на Superdex G-75 показал, что молекулярная масса фермента 2а составляет 28000 Да, что характерно для субтилизинпо-добных ферментов.
Определение рН-оптимума и стабильности фермента. Определение рН-оптимума проводили в диапазоне рН 3,24 - 11,3. Исходя из полученных данных, показано, что протеазы активны в широком диапазоне значений рН. Наибольшая активность (рис. 5) проявляется в щелочной среде (рН 6,94 -10,1), и стабильность (рис. 6) сохранялась в интервале рН 7,98 - 11,3.
Рис. 5. рН-оптимум культур 2а, 8а,10а, Х4,С1К
Рис. 6. рН-стабильность культур 2а, 8а,10а, Х4,С1К
Таким образом, секретируемые внеклеточные протеиназы алкалофильных бактерий относятся к субтилизинподобным протеазам, которые сохраняют свою активность при высоких значениях рН.
Определение температурной стабильности фермента.Температурную стабильность фермента (рис. 7) определяли в диапазоне температур от 23 до 80оС, выдерживая реакционную смесь в течение 20 мин.
Термостабильность
—2А СІК
Рис. 7. Температурная стабильность культур 2а, 8а,10а, Х4,С1К
Все культуры сохраняют свою активность до 50оС, причем максимум активности наблюдается при 40оС, дальнейшее повышение температуры ведет к полной потере активности фермента.
Анализ природы функциональных групп активного центра. В работе использовались ингибиторы сериновых протеаз - фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), цистеиновых протеаз - йодацетамид (ИАА), металлопротеаз - этилендиаминтетраацетат (ЭДТА). Активность исследуемых ферментов культур 2а, 8а, С1К ингибировалась ФМСФ - специфическим ингибитором сериновых протеаз. Данные ингибиторного анализа показали, что при добавлении ФМСФ до 1 мМ наблюдается практически полное ингибирование (у культур 2а, 8а, С1К - 27,3%, 34%, 52,5%, соответственно) внеклеточной протеолитической активности по отношению к субстрату GlpAALpNA.
Исходя из результатов ингибиторного анализа и субстратной специфичности, можно предположить, что секретируемые ферменты изученных культур относятся к классу сериновых протеаз субти-лизин-подобного типа.
Литература
1. Zeikus J., Vielle C., Savchenko A. Thermozymes: Biotechnology and structure-function relationship // Extremophiles, 1998.- V.1.-P. 2-13.
2. Грачева И.М., Кривова А.Ю. // Технология ферментных препаратов. - М. 2000. - 3-е изд., перераб. и доп. - С.5-9.
3. Erlanger B.F., Kokowsky N., Cohen W. // Arch. Biochem. Biophis. 1961.- V. 95.- P. 271-278.
Literature
1. Gracheva I.M., Krivova A.Yu. // Technology of ferment preparation. - Moscow, 2000.- 3d ed, reworked and added.- P.5-9.
Сведения об авторах
Раднагуруева Арюна Арсалановна - аспирант Института общей и экспериментальной биологии СО РАН. 670047, Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, 8(3012)43-49-02. mail: aryuna rg@mail.ru
Лаврентьева Елена Владимировна - канд. биол. наук, науч. сотр. Института общей и экспериментальной биологии СО РАН, старший преподаватель кафедры экспериментальной биологии биолого-географического факультета БГУ, 670047, Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, ИОЭБ СО РАН, 8(3012)43-49-02, факс: 8(3012)43-30-34. E-mail: lena l@mail.ru
Дунаевский Яков Ефимович - д-р биол. наук, проф. НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова.119991, Москва, Ленинские горы, строение А 40. 8(495) 938-55-51. E-mail: dun@belozersky.msu.ru
Data on authors
Radnagurueva Aryuna Arsalanovna, post-graduate student of ICEB SD RAS.
Lavrentieva Elena Vladimirovna, cand. of biology science, scientific worker of ICEB SD RAS., senior teacher of experimental biology department of biology-geographical faculty BSU.
Dunaevskiy Yakov Efimovich, doctor of biology science, professor of SRI of physical-chemical biology named by A.N. Belozerskiy of MSU named by M.V. Lomonosov.
