CC BY
409
УДК 577.151
Н. А. Югина, А. И. Хабибрахманова, Е. О. Михайлова, М. В. Шулаев
ПРОТЕОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ АКТИВНОГО ИЛА ОЧИСТНЫХ СООРУЖЕНИЙ МУП «ВОДОКАНАЛ» Г. КАЗАНИ
Ключевые слова: протеолитический фермент, активный ил, протеолитическая активность.
Была произведена оценка протеолитической активности микроорганизмов, выделенных из активного ила очистных сооружений МУП «Водоканал» г. Казани. Нами были выделены 20 штаммов микроорганизмов микрофлоры активного ила и произведена морфологическая характеристика выбранных микроорганизмов. Для определения протеолитической активности были выбраны 3 штамма микроорганизмов с наибольшей зоной лизиса при росте на молочном агаре. Максимальная протеолитическая активность показана для штамма №3. Микрофлора активного ила была охарактеризована, как обладающая высокой протеолитической активностью.
Keywords: protease, activated sludge, proteolytic activity.
It was the proteolytic activity of microorganisms isolated from activated sludge waste water treatment plants municipal unitary enterprises "Vodokanal", Kazan. We have allocated 20 strains of microorganisms of the activated sludge microflora and produced morphological characteristics of selected microorganisms. To determine the proteolytic activity were selected 3 strains of microorganisms with the greatest area of lysis when grown on milk agar. Maximum proteolytic activity is shown for strain №3. The microflora of the activated sludge has been characterized as having high proteolytic activity.
Введение
Роль ферментов в жизнедеятельности животных, растений и микроорганизмов колоссальна. Благодаря каталитической функции разнообразные ферменты обеспечивают быстрое протекание в организме или вне его огромного числа химических реакций. Будучи выделены из организма, ферменты не утрачивают способность осуществлять каталитическую функцию. На этом основано их практическое применение в химической, пищевой, легкой и фармацевтической промышленности.
Протеолитические ферменты (протеазы) представляют собой одну из наиболее многочисленных групп ферментов и синтезируются практически всеми живыми существами. Наиболее широким и перспективным источником протеиназ являются микроорганизмы. Активными
продуцентами протеиназ являются бактерии родов Bacillus, Micrococcus, Pseudomonas,
микроскопические грибы родов Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Keratinomyces и актиномицеты (р.р. Streptomyces, Actinomyces) [1]. Потребность в протеолитических ферментах выдвигает на первый план проблему увеличения их производительности [2]. Широчайший мир микробного разнообразия предоставляет возможность выявить обширный генетический и биохимический потенциал микроорганизмов для получения биотехнологически значимых продуктов.
Целью данной работы была оценка протеолитической активности микроорганизмов, выделенных из активного ила очистных сооружений МУП «Водоканал». Представлялось интересным выделение микроорганизмов активного ила, секретирующих протеолитические ферменты, поскольку активный ил представляет собой
сложную экосистему, в которой протеолитические ферменты играют не последнюю роль.
Экспериментальная часть
В качестве объектов исследования были выделены чистые культуры бактерий, входящих в состав микрофлоры активного ила очистных сооружений МУП «Водоканал».
Активный ил для экспериментов отбирался из регенератора секции биологической очистки сточных вод МУП «Водоканал».
Для выращивания микроорганизмов были использованы следующие питательные среды: пептон-содержащая среда: пептон - 10 г/л, агар - 20 г/л, молочный агар: агар - 25 г/л, 0,5 % молоко добавляли в соотношении 1:2 по объему, агар и молоко стерилизовали отдельно.
Для морфологической характеристики объекта определяли размер колонии (измеряли в миллиметрах), форму колонии, край колонии, цвет, поверхность, каталазную активность,
принадлежность к Грам «+/-», прозрачность, профиль и рост бактерий по штриху.
Протеолитическая активность микроорганизмов, выращенных на молочном агаре: на поверхность застывшей твердой молочной среды в чашки Петри высевали культуры микроорганизмов. Культуры выращивали в термостате при температуре 30°С, посев осуществляли «штрихом». Рост культур проводили в течение суток. Протеолитическую активность определяли по появлению светлых зон вокруг колоний («зон лизиса»).
Протеолитическую активность отобранных микроорганизмов определяли на жидкой пептон-содержащей питательной среде: пептон - 10 г/л Для этого выращивали микроорганизмы в колбах на
вибростенде в течение 52 ч. Пробы отбирали на 24, 28, 48 и 52 ч роста.
Определение казеинолитической активности: протеолитическую активность определяли, используя в качестве субстрата казеин по методу Каверзневой: Казеин в концентрации 2% растворяли в 0,1 М Трис-НС1 буфере, рН 9,0. Смесь из 1 мл казеина и 1мл культуральной жидкости инкубировали 15 мин при 37°С, затем добавляли 2 мл 5%-ной ТХУ и инкубировали при той же температуре еще 20 мин. Смесь пропускали через фильтр. К 1 мл фильтрата добавляли 5 мл 6%-ной №2С03 и 1 мл реактива Фолина. Смесь ставили на 20 мин в темноту для полного проявления окраски, а затем измеряли оптическую плотность при длине волны 670 нм на фотоколориметре. Параллельно ставили контроль на свободный тирозин следующим образом: смешивали 1 мл культуральной жидкости и 2 мл 5%-ной ТХУ и инкубировали 20 мин при 37°С, после чего добавляли 1 мл 2%-ного казеина и выдерживали еще 15 мин при той же температуре. С фильтратом поступали, как описано выше [3].
Контроль за ростом культуры осуществляли, определяя изменение оптической плотности (Бопт) культуры. Прирост биомассы определяли нефелометрически на ФЭК-56 ПМ со светофильтром 9 при длине волны 590 нм. За единицу биомассы принимали поглощение в 1-см кювете.
Белок определяли спектрофотометрически, считая, что концентрация белка 1 мг/мл соответствует А280 = 1 оптической единице (опт. ед.) в кювете толщиной 1 см.
Результаты и обсуждение
На первом этапе работы были выделены 20 штаммов микроорганизмов микрофлоры активного ила. Выделение чистых культур производилось на чашках с плотной питательной средой, а также в пробирках на скошенном агаре. Для культивирования была выбрана пептонсодержащая среда. В результате были получены 20 чистых культур микроорганизмов [4].
Второй этап работы предполагал морфологическую характеристику выбранных микроорганизмов [5, 6]. Было показано, что размер колоний в среднем составляет 0,5 ~ 0,8 мм, преобладающая форма - круглая, преобладающий цвет - белый, непрозрачный, практически все штаммы обладают каталазной активностью, за исключением № 4, так же все микроорганизмы за исключением № 9 грамположительны, рост бактерий по штриху - у всех сплошной с ровным либо волнистым краем (результаты не представлены).
Интересным фактом, характеризующим штаммы № 4, 19 и 20, является продукция ярких пигментов (желтого, оранжевого и розового), что может иметь важное практическое значение. Многие пигменты проявляют антибиотические свойства. Между пигментацией и образованием вторичных
метаболитов существует тесная корреляция, поэтому при наличии пигментов можно с большой долей вероятности ожидать образования антибиотиков и других БАВ. При этом именно продуценты пигментов играют важную роль в очистке промышленных сточных вод. Полученные результаты не противоречат данным о «классической» бактериальной микрофлоре активного ила [7].
В качестве белковых субстратов наиболее широко используют желатин, казеин, гемоглобин, сывороточный альбумин, кератин, эластин. Эти субстраты доступны и чувствительны к протеолитическим ферментам микробного происхождения [8].
Наиболее простым и доступным способом выявления протеолитической активности микроорганизмов является их посев на молочном агаре. Протеолитические бактерии вокруг колоний образуют зону просветления за счет расщепления молочного белка - казеина. Результаты оценивали, измеряя размер (ширину) зоны лизиса вокруг колоний микроорганизмов. Посев для наглядности осуществлялся штрихом, зона лизиса составляла от 0,1 до 0,6 мм.
Для дальнейшего определения протеолитической активности были выбраны 3 штамма микроорганизмов с наибольшей зоной лизиса при росте на молочном агаре, т. е. максимальной протеолитической активностью.
Определение протеолитической активности проводили по методу Каверзневой. Максимальная протеолитическая активность бактерий
наблюдается, как правило, в период стационарной фазы, поэтому отбор проб осуществлялся на 24, 28, 48 и 52 ч роста микроорганизмов, параллельно для оценки продуктивности определяли общее количество внеклеточного белка и рост культуры (рис. 1, табл. 1).
ПА, мкг/мл*мин
Рис. 1 - Протеолитическая активность штаммов микроорганизмов, выделенных из активного ила
Полученные данные свидетельствуют, что пик протеолитической активности для штамма №3 приходится на 48 ч роста, в то время как для
штаммов №7 и №9 максимум наблюдался на 52 ч роста. Максимальная протеолитическая активность показана для штамма №3. В тоже время удельная активность штаммов (в пересчёте на единицу белка) также достаточна велика, что говорит о высоком потенциале данных микроорганизмов как продуцентов протеаз.
Таблица 1 - Значения протеолитической активности, количества белка и удельной активности для штаммов № 3, 7, 9 на разных ч роста микроорганизмов
Таким образом, микрофлору активного ила очистных сооружений МУП «Водоканал» г. Казани можно охарактеризовать как обладающую высокой протеолитической активностью. Представленные в работе данные являются как характеристикой
работы микроорганизмов активного ила, так и могут найти непосредственное практическое применение для интенсификации процессов разложения белка в системах очистки сточных вод для улучшения ее качества, а дальнейшие исследования в данной области помогут выявить и полно охарактеризовать бактерии для получения биотехнологически значимых продуктов.
Литература
1. Современная микология в России (Москва, Россия, Апрель 16- 18, 2008) Национальная академия микологии, Москва, 2008. 548 с.
2. Г. В. Полыгалина, В. С.Чередниченко, Л. В. Римарева Определение активности ферментов: справочник, ДеЛи принт, Москва, 2003. 375 с.
3. Е.Д. Каверзнева Прикладная биохимия и микробиология, 7, 2, 225-228 (1971).
4. А.И.Нетрусов, М.А.Егорова, Л.М. Захарчук Практикум по микробиологии, Издательский центр «Академия», Москва, 2005. 608 с.
5. Н.С. Егоров Руководство к практическим занятиям по микробиологии, Издательство Московского университета, Москва, 1995. 224 с.
6. Е.Г. Инешина , С.В. Гомбоева Методические указания к лабораторному практикуму по курсам «Санитарная микробиология», «Санитарно-микробиологический контроль на производстве», Издательство ВСГТУ, Улан-Удэ, 2006. 90 с.
7. Б.С. Ксенофонтов Методы биотехнологии в процессах очистки воды, воздуха и почвы, МГТУ им. Баумана, Москва, 2010. 72 с.
8. А. А. Имшецкий Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз, Наука, Москва, 1979, С. 125-148.
\ м/о № 3 № 7 № 9
час\ < н с о а Кол. < ч < н с о а Кол. < Ч < н с о а Кол. < ч
24 о 5,65 4,03 о 0,12 6,43 5,74 0,02 о 5,42 3,79 о
28 о 4,848 8,32 о 0,037 6,198 7,77 0,0048 о 5,41 5,91 о
48 2,765 5,423 9,19 on 0,767 4,615 9,01 0,085 о 5,71 5,41 о
52 0,06 5,09 3,31 0,02 2,44 3,87 00 on 0,64 2,65 5,65 3,66 0,72
© Н. А. Югина, аспирант кафедры химической кибернетики КНИТУ, tashka_ugi@mail.ru, А. И. Хабибрахманова, аспирант кафедры химической кибернетики КНИТУ, alsu_khisa@mail.ru, Е. О. Михайлова, канд. биол. наук, доцент кафедры бизнес-статистики и математических методов в экономике КНИТУ, katyushka.glukhova@gmail.com, М. В. Шулаев, д-р. техн. наук, профессор кафедры химической кибернетики КНИТУ, mshulaev@mail.ru.
© N. A. Yugina, postgraduate student of the Department of chemical Cybernetics, KNRTU, tashka_ugi@mail.ru, A. 1 Khabibrakhmanova, postgraduate student of the Department of chemical Cybernetics, KNRTU, alsu_khisa@mail.ru, E. O. Mikhailova, associate professor of business statistics and mathematical methods in Economics, katyushka.glukhova@gmail.com, M. V. Shulaev, Ph.D., Professor of the Department of chemical Cybernetics, mshulaev@mail.ru.
