CC BY
0
SCIENCE TIME
ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССА И РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА ВОДНО-СПИРТОВОГО ИЗВЛЕЧЕНИЯ СБОРА «FITOFRUFOL»
Муллажоиова Маизура Тохировна, Файзуллаева Нодира Султоновна, Муллажонов Тошкенбой Акмал угли, Рудъ Наталья Кареновна, Шамсиев Шерамон Шокирович, Ташкентский фармацевтический институт, г. Ташкент, Узбекистан E-mail: robiya1903@gmail.com
Аннотация. В результате исследования найдены оптимальные условия процесса экстракции математическим планированием по Боксу-Уилсону: это экстракция измельченного растительного сырья с размерами частиц 3-5 мм 40%-ным этиловым спиртом при температуре 25°С, продолжительность экстракции 9 ч, при этом выход БАВ составил 54,9%> при первом контакте фаз и в последующем увеличением до 85%.
Ключевые слова: сбор «Fitofrufol», водно-спиртовое извлечение, аскорбиновая кислота (Vit С), рутин, УФ-спектрофотометрия.
Нами разработана технология производства водно-спиртового извлечения на основе местного растительного сырья - сбора «Fitofrufol», которая исключает применение сложных технологий и дефи-цитных, дорогих растворителей. Экологичность и безопасность технологии обеспечены сокращением нескольких, многоэтапных стадий технологии до единого - способа «перколяции».
Экстрагирование биологически активных веществ - главная и основная стадия переработки лекарствен-ного сырья как растительного, так и животного происхождения.
В фармацевтической технологии в качестве избирательных растворителей при экстракции используют воду, этилового спирта, органические растворители и их смеси, а также водные растворы кислот и щелочей [1]. В последнее время преобладает экстракция в сверхкритическом состоянии и экстракция в докритическом состоянии углекислым газом. И такой способ, хотя является одним из эффективных, но по сложности технических решений и дороговизны метода производственные предприятия еще не отказались от традиционных методов экстракции. Согласно вышеизложенному, авторы изучали оптимальную возможности извлечения АФИ из сбора традиционными методами.
Как известно эффективность процесса экстрагирования зависит от факторов таких как, гидродинамические условия, давление на поверхность ■раздела фаз, разность концентраций, продолжительность процесса, вязкость
I
5
1 SCIENCE TIME 1
экстрагента, температура, применение ПАВ и т.п. Поэтому изучение процесса экстракции биологических активных веществ из растительного сырья является определяющей в технологическом процессе.
Для разработки технологии экстракта растительного сырья важным моментом является подбор оптимальных растворителей и условия экстрагирования.
Материалы и методы. Объектом исследования служили образцы сбора «^кой^Ы», включающего листья смородины черной, траву мелиссы лекарственной и плоды шиповника собачьего, обеспеченных достаточной сырьевой базой и разрешенные к медицинскому применению [2].
Цель работы - оптимизация процесса водно-спиртовой экстракции получения АФИ из сбора <^йо&иАо1» традиционными методами.
Для подбора оптимального метода получения водно-спиртового извлечения из трехкомпонентной растительной композиции, были изучены следующие факторы: степень измельчения сырья, концентрация и вид экстрагента, метод экстракцию и разность концентраций, которые влияют на экстракцию биологически активных веществ. Поэтому для оценки степени их влияния на экстракцию, а также определение условий максимального выхода суммы флавоноидов из сбора мы применяли метод математического планирования эксперимента по Боксу-Уилсону. Для оптимизации процесса экстракции использовали метод математического планирования эксперимента, имеющий широкое применение в фармации.
Экспериментальная часть
Известно, что экстрагирование природных соединений зависит от многих факторов, каждый из которых в большей или меньшей степени влияет на выход конечного продукта. Исследования проводили на основе однофакторных экспериментов с целью сбора априорной информации, т.е. в каждом опыте изменяли параметры только одного из факторов, влияющих на процесс, остальные оставляли неизменными. Переменные факторы, влияющие на выход суммы экстрактивных веществ явились: концентрация экстрагента, степень измельчения сырья, продолжительность экстракции и температура настаивания. Для установления оптимальных значений переменных факторов был использован метод математического планирования эксперимента (результаты математического планирования приводится ниже).
При выборе экстрагента учитывались растворимость действующих веществ во взятых лекарственных растениях. Для определения максимального выхода экстрактивных веществ необходимо подобрать оптимальный экстрагент. Из литературы известно, что флавоноиды хорошо растворяются в спирте и витамин С растворимы в воде. Учитывая выше сказанное, для экстрагирования был выбран этиловый спирт. В качестве экстрагента использовали спирт этиловый различных концентраций (40, 60, 80%). Экстрагирование проводили методом перколяции. Сначала экстракцию проводили раздельно: 1 часть - для
1 SCIENCE TIME 1
трав Ribes negrum L. и 1 часть - Melissae officinalis и 2 часть - для fructus Rosae canina.
На основании проведённых исследований установлено, что максимальный выход водно-спиртового извлечения из трав Ribes negrum L. и Melissae officinalis получен при использовании 70% спирта, а для плоды Rosae canina при 20% этиловым спирте. Из полученных результатов можно сделать заключение, что оптимальная величина измельчения для трёх видов сырья составила 3-5 мм, т.к. при этом выход водно-спиртового извлечения был наибольшим, чем при измельчении до размеров 1-3 мм и 5-7 мм.
Для обеспечения разности концентраций экстрагента и сырья экстракцию проводили в соотношении 5:1, которое выбрано по результатам проведённых исследований и учитывались расход экстрагента и энергозатраты. После выбора оптимальных факторов, влияющих на процесс экстракции и метода перколяции полученные результаты использовались для разработки технологии водно-спиртового извлечения из трехкомпонентной композиций лекарственного растительного сырья. Параметром оптимизации служил выход фармакологически-активных веществ (флавоноиды, аскорбиновая кислота) сбора при первом контакте фаз. Во всех опытах количество взятого сбора «Fitofrufol», а также методы выделения, и количественного определения были идентичными. В опытах всего использовали 0.5 кг воздушно-сухое сырье сбора в статических условиях.
10 г измельченное сбора «Фиторуфол» помешали в посуде, залили 48 мл спирта этилового и оставили на 4 часа.
Предварительно замоченное 40% этиловым спиртом сырье загружали в перколятор. Затем заливали в перколятор 40% спирт до образования "зеркального слоя" и оставили на 12 часа. После истечения времени экстрагировали методом перколяции до истощения сырья. Собранные извлечения оставили для очистки от балластных веществ на 1-2 дня, фильтровали через слой бязи через нутч-фильтр.
Жидкий экстракт с содержанием БАВ составил 54,9% при первом извлечении, чтобы получить остаточные части БАВ, к оставшейся части сырья в перколяторе добавили 40% спирта и оставили на 4 часов. По истечении времени экстрагировали. Процедуру повторяли несколько раз до истощения сырья. Полученный жидкий экстракт оставляли на 1-2 дня для отчистки и фильтровали. Затем все извлечения смешивали. Этот смесь является готовым продуктом. Полученный ГП представляет собой темно-коричневую жидкость со специфическим запахом, слабого, немного жгучего вкуса.
Оценка качества. Качество водно-спиртового извлечения оценивали в соответствии с требованиями ГФ XI и Ts 24442623-001:2023 по следующим показателям: описание, подлинность, концентрация этилового спирта (определенного по температуре кипения), количество сухого остатка (экстрактивные вещества). Основные результаты полученных данных представлены в таблице 1.
1 SCIENCE TIME 1
Таблица 1
Результаты изучения технологических свойств водно-спиртового извлечения, полученного из трехкомпонентного растительного сырья
№ опыта Концентрация спирта, % (после перегонки) Плотность, г/см3 Подлинность Экстрактивные вещества, % Вывод
Флавоноиды (с AlCl3, циани-диновая реакция) Витамин С (с 2,6-дихлориндо-фенолинфенолят Na)
1 40 0,9361 + + 3,2 Соотв.
2 60 0,9001 + + 2,9 Соотв.
3 80 0,8438 + + 2,7 Соотв.
Из таблицы 1 установлено, что жидкий экстракт, полученный из трехкомпонентного растительного сырья отвечает всем требованиям НД.
Исходя из требований ГФ XI нами была проведена стандартизация водно-спиртового извлечения <^йо£та&1» по следующим показателям: описание, подлинность, количественное определение, тяжёлые металлы, сухой остаток, содержание спирта.
Препарат по внешнему виду - густая жидкость тёмно-коричневого бурого цвета, со специфическим приятным запахом, слабого, немного жгучего вкуса.
Установление подлинности проводили по качественным реакциям на основные действующие вещества: флавоноиды (рутин), витамин С.
Флавоноиды. 0,25 (т.н) ГП переносили в мерную колбу объёмом 50 мл, доводя объём 96% спиртом этиловым до метки. Далее поступают как указано в методике [3]. Спектр поглощения полученного раствора в присутствии хлорида алюминия (А1С13) от 300 до 500 нм имел основной выраженный максимум при длине волны (436±3пт), что доказывало наличие флавоноидов в препарате (таблица 2).
Витамин С. Количественного определения аскорбиновой кислоты проводили по следующей методике [4]: измельченного сбора берут навеску массой 20 г, помещают в фарфоровую ступку, где тщательно растирают со стеклянным порошком (около 5 г), постепенно добавляя 300 мл воды, и настаивают 10 мин. Затем смесь размешивают и извлечение фильтруют. В коническую колбу вместимостью 100 мл вносят 1 мл полученного фильтрата, 1 мл 2 % раствора хлористо-водородной кислоты, 13 мл воды, перемешивают и титруют из микробюретки раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (0,001 моль/л) до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30-60 с. Титрование продолжают не более 2 мин. В случае интенсивного окрашивания фильтрата или высокого содержания в нем аскорбиновой кислоты [расход раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (0,001 моль/л) более 2 мл], обнаруженного пробным титрованием, исходное извлече-ние разбавляют водой в 2 раза или более.
Содержание аскорбиновой кислоты в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:
1 SCIENCE TIME 1
V х 0.0088 х 300 х 100 x 100 m x 1 x (100—WO
где:
0,000088 - количество аскорбиновой кислоты, соответствующее 1 мл раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (0,001 моль/л), в граммах; V -объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (0,001 моль/л), пошедшего на титрование, в миллилитрах; т- масса сырья в граммах; Ж -потеря в массе при высушивании сырья в процентах.
Таблица 2
Результаты качественного анализа для определение подлинности водно-спиртового извлечения сбора <^йо£та&1»
Номер опыта Витамин С Флавоноиды
№1 + +
№2 + +
№3 + +
№4 + +
№5 + +
Содержание аскорбиновой кислоты в готовом продукте наряду с представленным выше методом, определяли УФ-спектрофотометрическим методом. Анализ проводили, используя следующую методику: ГП массой 0,25 г (т.н.) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, в которую прибавляют 40 мл воды, перемешивают, после растворения доводят объем водой до метки. 1 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят водой до метки. Измерение оптической плотности полученного раствора проводят на спектрофотометре при длине волны 244 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Параллельно измеряют оптическую плотность раствора рабочего стандартного образца аскорбиновой кислоты (приготовление раствора см. ниже).
Содержание аскорбиновой кислоты (Х) вычисляют по формуле:
^ _ В1ха0х100х1х100хр _ ¿^ХйоХР
где:
В1 - оптическая плотность испытуемого раствора; Б0 - оптическая плотность рабочего стандартного образца аскорбиновой кислоты; а0 - масса навески аскорбиновой кислоты рабочего стандартного образца, в г; Р -содержание аскорбиновой кислоты в стандартном образце, в %; 1 - объем испытуемого раствора.
I SCIENCE TIME Щ
Приготовление раствора рабочего стандартного образца аскорбиновой кислоты. Около 27,2 мг аскорбиновой кислоты (т .н.) рабочего стандартного образца аскорбиновой кислоты помещают в колбу вместимостью 100 мл, добавляют 40 мл воды и растворяют. Доводят водой до метки. 1,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и далее поступают также, при приготовлении испытуемого раствора.
Количественное определение проводили по сумме флавоноидов. 1 мл препарата помещали в мерную колбу объёмом 25 мл, прибавляли 5 мл 96% спирта этилового, 5 мл 5% раствора алюминия хлорида на 70% спирте этиловом, через 10 минут прибавляли 2 мл 5% раствора уксусной кислоты на 70% спирте этиловом, доводя объём раствора 70% спиртом этиловом до метки и перемешивали и оставляли на 30 минут. Оптическую плотность полученного раствора измеряли на спектрофотометре при длине волны 408 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя как компенсационный раствор - раствор, приготовленный аналогичным образом, но без добавления 5% раствора алюминия хлорида на 70% спирте этиловом.
Параллельно измеряли оптическую плотность раствора рабочего стандартного образца (РСО) рутина, приготовленный аналогично испытуемому раствору, который содержит 1 мл раствора РСО рутина и 2 мл 5% раствора уксусной кислоты в 70% спирте этиловом [3-5].
Количественное содержание суммы флавоноидов в пересчёте на рутин_в процентах (%) рассчитывали по следующей формуле:
D * т0 * Р * 1 * 25 D * т0 * Р
Х= ...............................=.................
D0 * 100 * 25 * 1 D0 * 100
где:
D - оптическая плотность испытуемого раствора; D0 - оптическая плотность компенсационного раствора; т0 - масса навески стандартного образца рутина, в мг; Р - содержание рутина в стандартном образце, отмеченный в сертификате качества, в процентах.
Примечание. Приготовление раствора РСО рутина. 25 мг (точная навеска) рутина, высушенного при температуре 135°С до постоянного веса, помещают в мерную колбу объёмом 100 мл, растворяют в 80 мл 96% спирта этилового при нагревании на водяной бане, после охлаждения объём раствора доводят этим же 96% спиртом этиловым до метки при перемешивании. Срок хранения раствора 1 месяц при хранении в хорошо укупоренной таре в прохладном, защищённом от света месте.
Полученные результаты количественного определения флавоноидов в препарате были подвергнуты статистической обработке, которые приведены в таблице 3.
10
I
SCIENCE TIME
I
Рис. 1 Калибровочный график для спектрофотометрического определение флавоноидов в водно-спиртовом извлечении сбора <^йойгийо1», где, раствор водно-спиртового извлечения сбора <^йойгайо1» (синий), раствор РСО рутина (красный)
Метрологические характеристики результатов количественного определения флавоноидов
Dct x%
0,84707 0,38375 3,00
0,88201 0,38375 3,13
0,84803 0,38375 3,01
0,85713 0,38375 3,04
0,87798 0,38375 3,11
Таблица 3
Метрологические характеристики
Хср=3,06%, S2=0,003443, S=0,058678, Sx=0,02624, t(95%,4)=2,78, AX=0,1631, ДХср=0,0729, E,%=5,33%, E,%cp=2,38%
На основании серии проведённых опытов было установлено, что содержание суммы флавоноидов в пересчёте на рутин должно быть не менее 2,0 %.
Выводы. Таким образом, найдены оптимальные условия процесса экстракции математическим планированием по Боксу-Уилсону: это экстракция измельченного растительного сырья с размерами частиц 5 мм, 40%-ным этиловым спиртом при температуре 25°С, продолжительность экстракции 9 ч. При этом выход БАВ составил 54,9%> при первом контакте фаз и в последующем увеличением до 85%, от общего содержания в водно-спиртового извлечения сбора <^йойгийо1». А также разработан метод оценки качества водно-спиртового извлечения.
1 SCIENCE TIME 1
Литература:
1. Чуешов В.И. и др. Технология лекарств промышленного производства. IBSN 978-966382-537-3. - 2014. - С. 696.
2. Mullajonova M.T., Urmanova F.F., Pulatova D.K., Duschanova G.M. Morphological and anatomical study of the new plant collection PHYTOFRUFOL // Cardiometry (diagnostics and therapy). - 2022. - Issue 22. - P. 173-175.
3. Сорокина О.Н., Сумина Е.Г., Петракова А.В., Барышева С.В.. Спектрофотометрическое определение суммарного содержания флавоноидов в лекарственных препаратах растительного происхождения // Известия Саратовского ун-та. Новая серия. Сер. Химия. Биология. Экология. - 2013. - Т. 13. - Вып. 3.
4. Государственная Фармакопея СССР, XI изд., вып. 2. Медицина. -Москва, 1990. - 392 с.
5. Абдуллаева Н.К., Хусаинова Р.А., Юнусходжиева Н.Э. валидация аналитических методов количественного определения кальция фолината методом спектрофотометрии // Science Time. - 2022. - №. 8 (104). - С. 36-40.
12
