CC BY
209
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2004 Биология Вып. 2
УДК 581.165.7
ОПТИМИЗАЦИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ЭТАПОВ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ ГЕОРГИНЫ КУЛЬТУРНОЙ: СТЕРИЛИЗАЦИЯ ЭКСПЛАНТОВ
С. А. Шумихин
Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Рассмотрены особенности стерилизации первичных эксплантов при микроклональном размножении георгины культурной. Изучены варианты стерилизации, разработана оптимальная методика.
Современный этап развития цветоводства связан с переходом на промышленную основу. При этом возникла проблема получения с наименьшими затратами больших количеств однородного сортового материала, которое возможно при использовании методов размножения растений в культуре тканей. Клональное микроразмножение сегодня позволяет полнее все га реализовать потенциал растительного организма к размножению (Endress, 1994). Не является исключением и георгина культурная (Dahlia х cultorum Thorsr. et Reis.), у которой семенное размножение как способ получения селекционного материала удачно сочетается с возможностью его клонирования in vivo и in vitro.
При микроклонировании георгины нами использована модель размножения, основанная на пролиферации пазушных побегов при устранении апикального доминирования основной точки роста. Этот метод наиболее надежен при получении однородного клонового материала, имеет хорошую воспроизводимость результатов (Высоцкий, 1986). Вместе с тем эта модель потребовала разработки конкретной методики микроклонального размножения применительно к георгине, прежде всего, оптимизации его основных этапов (Шумихин, 1997).
При клональном размножении георгины in vitro можно выделить три основных этапа:
1) стерилизация материала и его выращивание in vitro до первого пассажа;
2) микроразмножение;
3) укоренение растений in vitro и высадка в грунт.
На протяжении всего процесса микроклонирования определяющую роль играет стерильность культуры, однако, особое значение она приобретает на начальном этапе (Высоцкий, 1986).
Задачами данного исследования являлись качественный и количественный подбор антисептиков и оптимизация режима стерилизации вводимого in
vitro материала.
В качестве первичных эксплантов использовали неодревесневшие части побегов с одним узлом, а также верхушки пасынков, взятые из нижней и средней частей растений, выращенных в грунте. Кроме того, на питательных средах проращивали семена, полученные при свободном опылении георгин.
Материал стерилизовали в следующей последовательности: 1,5% раствор нейтрального детергента (СМС “Лотос”) - 30 мин; промывка проточной водой - 10 мин; 5-6% раствор гипохлорита кальция - 15-25 мин. В условиях ламинар-бокса стерилизацию завершали погружением объектов в 70% этанол на 1 мин и в 3% раствор перманганата калия на 15 мин с последующей промывкой в трех порциях стерилизованной дистиллированной воды по 5 мин в каждой. В ряде случаев условия стерилизации изменяли, используя вместо гипохлорита кальция 10% раствор хлорной извести, а вместо 70% этанола - 96%. Всего испытано 10 режимов стерилизации (таблица). Перед высадкой на питательную среду места срезов у первичных эксплантов обновляли.
Простерилизованный материал высаживали в пробирки на наиболее часто используемую для культуры растительных тканей твердую питательную среду с минеральной основой по Т. Murashige, F. Skoog (1962), витаминами по Р.Г. Бутенко (1964), 2% сахарозой, 0,7-0,8% агар-агаром.
Стерилизацию питательной среды, культуральных сосудов, инструментов и оборудования осуществляли согласно общепринятым методикам (Бутенко, 1964). Экспланты высаживали на питательную среду в ламинар-боксе в соответствии с правилами работы со стерильным материалом (Бутенко, 1964).
Посаженные растения находились в условиях круглосуточного освещения люминесцентными
© С.А. Шумихин, 2004
62
С. А. Шумихин
лампами интенсивностью 1000-3000 лк при температуре +22-24°С.
Через 10-14 дней после очередного пассажа выбраковывали материал, имеющий признаки инфицирования. Одновременно вычисляли отношение числа стерильных объектов к общему числу подвергнутых стерилизации. Кроме того, учитывали жизнеспособность стерильного материала определением процента стерильных объектов с при-
Выход стерильного материала и его жизнеспособность в зависимости от условий стерилизации
знаками регенерации. В некоторых случаях экс-планты и растения-регенеранты подвергали повторной стерилизации.
Повторность опытов двухкратная.
Использование для стерилизации различных веществ или разных концентраций одного вещества существенно сказывается на выходе стерильного материала (таблица).
Объ-
ект
стери-
лиза-
ции
Пер-
вич-
ные
экс-
план-
ты
Ре-
жим
стери-
лиза-
ции
рас-
твор
детер-
гента
(30
мин)
+
+
+
+
+
про-
точ-
ная
вода
(30
мин)
+
+
+
хлорная
известь
10%
(15-25
мин)
Условия стерилизации
гипо-хлорит кальция 5% (15— 25 мин)
гипо-хлорит кальция 6% (15-25 мин)
+
+
этанол 70% (1 мин)
+
+
этанол 96% (5 с)
+
+
перманганат калия 3% (15 мин)
дистиллированная вода (3x15 мин)
+
+
+
+
+
Выход стерильного ма-териала, %
34.4
25.7 18,2
15.8
12.5
Жизне-спос. стерильного материала, %
87,7
16,3
35,1
21,5
100
Ин-
фици-
рован-
ные
реге-
неран-
ты
6
7
8
9
10 1
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
98,6
87.5 83,8 82,2
73.6 36,5
79.2 82,4
94.7
83.3
73.3
85.8
Семе-
на
+
+
+
+
+
+
23,8
42,3
100
84,5
Стерилизация первичных эксплантов дала положительные результаты в 12,5-34,4% случаев независимо от сортовой принадлежности материала. Наилучший антисептический эффект получен при использовании первого режима стерилизации, при котором наблюдался не только наибольший выход стерильного материала (34,4%), но и высокий показатель его жизнеспособности (87,7%).
Стерилизация эксплантов в режимах 2-5 оказалась менее эффективной, поскольку сильная зараженность эксплантированного материала часто вела к его гибели. Исключение составил пятый режим обработки, показавший наибольшую жизнеспособность стерильного материала (100%), хотя его выход был наименьшим (12,5%). Возможно, в данном случае стерилизующие вещества оказались качественно несовместимыми, а использованные концентрации и время обработки - неэффективными.
Жизнеспособность стерилизованных эксплантов зависела от токсичности того или иного стерилизующего вещества. Наименьшее повреждающее действие оказывают концентрации антисептиков и экспозиции при первом режиме обработки: 5% гипохлорит кальция (15-25 мин), 70% этанол (1 мин), 3% перманганат калия (15 мин). Увеличение концентрации первых двух компонентов (режимы 2 и
4) даже при значительном уменьшении экспозиции в 96% этаноле (5 с) резко снижает жизнеспособность эксплантов. Использование перманганата калия, как установлено, положительно сказывается как на выходе стерильных образцов, так и на их жизнеспособности, что подтверждается данными таблицы (режимы 1 и 2). В обоих случаях стерильность и жизнеспособность первичных эксплантов зависела, главным образом, от концентрации гипохлорита кальция. Более высокие показатели при первом режиме стерилизации можно объяснить совместным действием гипохлорита кальция и перманганата калия. Хотя перманганат калия довольно слабый антисептик, он, по-видимому, в последующем положительно влияет на жизнеспособность эксплантов.
Верхушки побегов оказались менее устойчивыми к разрушающему действию стерилизующих агентов, чем экспланты с пазушными почками. Вероятно, это объясняется высокой физиологической активностью и, следовательно, уязвимостью верхушечных апексов.
При стерилизации в режимах 2-4 часто наблюдалась гибель первичных эксплантов вследствие их постепенной некротизации. В конечном итоге
Оптимизация отдельных этапов микроклональногоразмножения георгины... 63
это отразилось на низкой жизнеспособности стерильного материала (16,3-35,1%).
При антисептической обработке семян более жесткий режим стерилизации (четвертый) обеспечивает лучшую асептику (42,3%), чем щадящий (первый - 23,8%). Однако их жизнеспособность в первом случае оказалась ниже, чем во втором -соответственно 84,5 и 100%. Результаты стерилизации первичных эксплантов и семян указывают на большую устойчивость последних к повреждающему действию антисептиков.
Заражение культуры проявляется обычно через 3-4 дня после высадки на питательную среду. Интенсивно развивающиеся колонии микроорганизмов вызывают гибель большинства эксплантов к 10-14-му дню культивирования. Однако в ряде случаев даже инфицированный материал успевает сформировать за 21-28 дней растения-регенераты высотой 50-100 мм, что позволяет подвергнуть их повторной стерилизации.
Асептический материал, полученный из расте-ний-регенерантов, отличается от первичных эксплантов большей жизнеспособностью. При использовании режимов 6-10 выход стерильных эксплантов составлял от 73,6 до 98,6%, а их жизнеспособность колебалась в пределах 73,3-94,7%. Даже наиболее жесткие условия стерилизации в режимах 6, 7, 10 существенно не повлияли на регенерационные способности стерильного материала. Растения-регенеранты, как правило, имеют прочные не полые внутри побеги, что отражается в их высокой устойчивости к разрушающему действию антисептиков. Оптимальное соотношение между выходом стерильных эксплантов и их жизнеспособностью получено при использовании восьмого режима, который мы считаем наилучшим при антисептической обработке инфицированных рас-тений-регенерантов.
При повторной стерилизации инфицированного материала первый режим оказался неэффективным. Из литературы известно, что раствор детергента и проточная вода на первом этапе антисептической обработки снижают численность сапрофитных микроорганизмов на поверхности стерилизуемого материала (Высоцкий, 1986). Когда мы исключили промывку материала детергентом и водой, выход стерильных растений составил 83,8%, что в два с лишним раза больше, чем при стерили-
зации в режиме 1 (36,5%). Результаты проведенных нами исследований выявили не только необязательность данных процедур при повторной стерилизации, но даже их отрицательное влияние. Одновременно не вызывает сомнений необходимость применения данных процедур при антисептической обработке первичных эксплантов и семян.
Таким образом, стерилизацию первичных эксплантов георгины на начальном этапе культуры in vitro следует осуществлять следующим набором антисептиков в порядке их использования: 1,5% раствор детергента - 30 мин, проточная вода - 10 мин, 5% гипохлорит кальция - 15-25 мин, 70% этанол - 1 мин, 3% перманганат калия - 15 мин, дистиллированная вода - трижды по 5 мин. Стерилизацию семян и инфицированных растений-регенерантов следует проводить при более жестких условиях, исключив во втором случае промывку материала в растворе детергента и проточной воде. Предложенная схема повторной стерилизации может быть использована как резервный случай при неудачных попытках первичной стерилизации эксплантов, взятых in vivo.
Исследования проведены при финансовой поддержке по гранту РФФИ и Департамента промышленности и науки Пермской области № 04-04-96069.
Библиографический список
Бутенко Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964. 272 с.
Высоцкий В.А. Клональное микроразмножение растений// Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986. С. 91-102.
Шумихин С.А. Клональное размножение Dahlia variabilis Desf. in vitro // Вестн. Перм. ун-та. 1997. Вып. 3. Биология. C. 65-71.
Endress R. Plant Cell Biotechnology. Berlin: Springer-Verlag, 1994. 354 p.
Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissued cultures// Physiol, plant. 1962. Vol. 15, № 3. P. 473-497..
The optimisation of the clonal propagation of Dahlia x cultorum in vitro: sterilizing of explants
S.A. Shumikhin
The pecularities of the microclonal propagation of dahlia have been studied. 10 methods of sterilizing the expiants have been studied. The method of the aseptic receiving of clonal material has been described.
