CC BY
61
УДК 34.31.33: 582.579.2
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КЛУБНЕПОЧЕК В КАЧЕСТВЕ ПЕРВИЧНЫХ ЭКСПЛАНТОВ ПРИ МИКРОКЛОНАЛЬНОМ РАЗМНОЖЕНИИ ВИДОВ РОДА GLADIOLUS L.
H. Л. Шибанова, канд. биол. наук, доцент; М. А. Черткова, аспирант;
Т. В. Мельникова, магистрант,
ФГБОУ ВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» ул. Букирева, 15, г. Пермь, Россия, 614990 E-mail: [email protected]
Аннотация. Исследования проводились в 2014-2016 гг. в лаборатории микроклонального размножения растений кафедры ботаники и генетики растений и в Учебном ботаническом саду Пермского государственного национального исследовательского университета. Представлены результаты по микроклональному размножению двух видов из рода Gladiolus L.: Gl. murielae Kelway и Gl. x hybridus hort. (Магма, Дочь Европы, Павлин, Бахромчатый, Конго, Виктор Талалихин). Установлено, что для стерилизации эксплантов Gl. x hybridus оптимальным является следующий порядок использования стерилизующих агентов: 7% раствор гипохлорита натрия (15-25 мин) и 96% этанол (30 сек). Для Gl. murielae предпочтителен обратный порядок. Выход стерильной культуры для изученных видов составил более 87%. При добавлении ауксинов (ИУК 1 мг/л, 2,4-Д
I,5 мг/л) в питательную среду MS на клубнепочках наблюдался процесс образования морфогенно-го каллуса, коэффициент размножения при этом составил 3,67±2,04 шт/эксплант для Gl. murielae и 5,14±1,21 шт/эксплант для Gl.x hybridus. Действие цитокининов (6-БАП 1,5 мг/л) прослеживалось в увеличении числа проростков по сравнению с безгормональной средой. Коэффициент размножения составил 1,80±0,41 шт/эксплант и 2,00±0,27 шт/эксплант, соответственно. Приживаемость растений, переведенных из условий in vitro в in vivo, составила 80-100%, что значительно выше, чем у особей, выращенных обычным способом (33-36%). Растения, выращенные из клубнепочек в культуре in vitro, зацветали уже на второй год, что отличало их от гладиолусов, полученных in vivo, у которых цветение наблюдалось только на третий-четвертый год. Ключевые слова: микроклональное размножение, клубнепочки, Gladiolus x hybridus hort., Gladiolus murielae Kelway.
Введение. Активная селекционная работа с гладиолусами ведется уже более ста лет, и интерес к этим растениям неизменно растет. Методы клонального микроразмножения позволяют значительно сократить селекционный процесс [1].
Однодольные растения, к которым относится гладиолус, труднее регенерируют в культуре in vitro, чем двудольные [2]. Первое сообщение о возможности размножения видов рода Gladiolus L. в культуре in vitro появилось в 1970 г. [3]. Исследования последних лет направлены на изучение биологических особенностей различных типов эксплантов, оптимизацию минерального и органического состава питательных сред, повышение коэффициента размножения в культуре in
vitro, получение здорового посадочного материала [4, 5, 6, 7, 8].
Цель данной работы - микроклональное размножение видов рода Gladiolus L. с использованием клубнепочек в качестве первичных эксплантов.
Методика. Исследования проводились в 2014-2016 гг. в лаборатории микроклонально-го размножения растений кафедры ботаники и генетики растений и в Учебном ботаническом саду Пермского государственного национального исследовательского университета. В качестве первичных эксплантов использовали клубнепочки двух видов гладиолуса - Gl. murielae Kelway и Gl. х hybridus hort., который был представлен шестью сортами: Магма (596-Р-87 Мирошниченко), Дочь Европы (544-
С-85 Мирошниченко), Павлин (557-СР-95 Баранов), Бахромчатый (573-СР-02 Киселев), Конго (558-С-91 Мурин), Виктор Талалихин (554-С-86 Громов).
Стерилизацию материала проводили двумя способами, отличающимися порядком использования стерилизующих агентов:
I режим стерилизации: раствор нейтрального детергента - 15 мин; промывка проточной водой - 10 мин; 96% этанол - 10 сек, 7% раствор гипохлорита натрия - 15 мин, с последующей промывкой в трех порциях стерилизованной дистиллированной воды по 5 мин в каждой.
II режим стерилизации: раствор нейтрального детергента - 15 мин; промывка проточной водой - 10 мин; 7% раствор гипо-хлорита натрия - 15-25 мин, 96% этанол -30 сек с последующей промывкой в трех порциях стерилизованной дистиллированной воды по 5 мин в каждой.
Простерилизованный материал и экс-планты, полученные при последующих пассажах, высаживали в пробирки на наиболее часто используемую для культуры растительных тканей твердую питательную среду с минеральной основой по Т. Murashige и F. Skoog (MS) [9], 3% сахарозой, 0,7% агар-агаром. Исследовали влияние на культуру гладиолуса состава питательной среды (полная MS и 'Л MS), витаминов по Р.Г. Бутенко [10], а также регуляторов роста: Р-индолилуксусной кислоты (ИУК) в концентрации 1 мг/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) в концентрации 1,5 мг/л, 6-бензиламинопурина (6-БАП) в концентрации 1,5 мг/л.
Питательные среды стерилизовали паром при температуре +120°С под давлением 1,1 атмосферы в течение 20 минут. Стерилизацию культуральных сосудов, инструментов и обо-
В результате анализа данных по выходу стерильной культуры можно отметить, что сорта гладиолуса гибридного по-разному реагируют на выбранный режим стерилизации. Средний процент выхода стерильной культу-
рудования осуществляли согласно общепринятым методикам [10] . Процесс высадки экс-плантов на питательную среду производили в ламинар-боксе в соответствии с правилами работы со стерильным материалом. Эксплан-ты содержали в условиях искусственного освещения (2790 люкс) при температуре +25±2°С.
Через 10-14 дней после очередного пассажа выбраковывали материал, имевший признаки инфицирования. Одновременно вычисляли отношение числа стерильных объектов к общему числу эксплантов, подвергнутых стерилизации. Жизнеспособность стерильного материала определяли в процентах как число стерильных объектов с признаками регенерации. Также учитывалось образование морфо-генного и неморфогенного каллуса.
Часть растений, полученных в культуре in vitro, переносили в Учебный ботанический сад ПГНИУ, где выращивали в условиях открытого грунта.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартного пакета анализа Microsoft Exсel.
Результаты. Микроклональное размножение гладиолусов проводилось в три этапа, выделение которых является общепринятым [11]. Первый этап включал стерилизацию эксплантов и их посадку на твердую питательную среду MS. В дальнейшем проводилось микроразмножение или получение каллуса. Заключительный этап состоял в укоренении растений in vitro и перевод их in vivo.
Определяющую роль на первом этапе микроклонального размножения имеет стерильность культуры. Методика стерилизации, использованная нами, показала хорошие результаты (табл.1).
ры у сортов гладиолуса гибридного по I режиму стерилизации составляет 75,97±5,85%, по II режиму - 87,77±0,68. Разница между этими показателями оказалась не достоверной ^=2,00<;05=2,45). Однако II режим стерилиза-
Таблица 1
Стерильность культуры гладиолусов
Gl. murielae Gl. х hybridus Магма Gl. х hybridus Дочь Европы Gl. х hybridus Павлин Gl. murielae Gl. х hybridus Бахромчатый Gl. х hybridus Конго Gl. х hybridus Виктор Талалихин
I режим стерилизации II режим стерилизации
93,5 % 66,7 % 78,6 % 82,6 % 82,9 % 88,6 % 86,7 % 88,0 %
ции показал близкие результаты по выходу стерильной культуры, и его можно рекомендовать для стерилизации сортов гладиолуса гибридного. Для Gl. murielae более подходящим является I режим стерилизации, при ис-
пользовании которого выход стерильной культуры составил 93,5 %.
Результаты по развитию эксплантов гладиолуса на твердой питательной среде МБ представлены в табл. 2.
Таблица 2
Развитие эксплантов гладиолуса на твердой питательной среде МБ
—-—.среда Полная МБ 'Л МБ
вид I II III IV V VI VII VIII
Gl. murielae 94,10 88,50 100,00 100,00 60,00 100,00 100,00 100,00
Магма 80,00 83,00 60,00 - - - - -
Дочь Европы 75,00 70,00 71,40 - - - - -
-5 'К -о Павлин 90,90 83,30 100,00 - - - - -
Бахромчатый - 100,00 - 100,00 80,00 80,00 100,00 100,00
Конго - 50,00 - 80,00 75,00 100,00 100,00 50,00
О Виктор Талалихин - 100,00 - 33,30 50,00 80,00 60,00 100,00
Среднее значение 81,97 81,05 77,13 71,10 68,33 86,67 86,66 83,33
±5,75 ±8,52 ±14,57 ±14,57 ±11,36 ±8,16 ±16,33 ±20,41
Примечание: I - без витаминов, II - с витаминами, III - с витаминами и ИУК (1 мг/л), IV - с витаминами и 6-БАП (1,5 мг/л), V - с витаминами и 2,4-Д (1,5 мг/л), VI - с витаминами, VII - с витаминами и 6-БАП (1,5 мг/л), VIII- с витаминами и 2,4-Д (1,5 мг/л).
Прочерк означает отсутствие данных.
В результате анализа результатов по развитию эксплантов гладиолуса на твердой питательной среде MS можно сделать заключение, что Gl. murielae менее прихотлив к условиям выращивания и показывает хорошие результаты на всех средах. В развитии эксплан-тов гладиолуса гибридного на разных средах выявлены сортовые различия. Однако достоверной разницы между выходом жизнеспособного материала и составом среды не выявлено (1=[0,12; 1,01] <1;о5=1,96). Возможно, это
связано с изначальным выбором типа экс-планта - клубнепочкой, которая содержит в своем составе все необходимые для прорастания вещества.
На средах с добавлением ауксинов на клубнепочках наблюдается процесс образования морфогенного каллуса, на средах с цито-кининами происходило образование проростков, число которых было больше, чем на безгормональной среде (рис.1).
Рис. 1. Развитие клубнепочек гладиолуса на разных средах: п - проростки, к - каллус
Процесс развития гладиолусов из клубнепочек в условиях культуры in vitro проходит быстрее, чем в условиях in vivo. Коэффициент размножения составляет 1,80±0,41 шт/эксплант для Gl. murielae и 2,00±0,27 шт/эксплант для Gl. х hybridus.
В мае 2015 г. 37 растений, выращенных in vitro, и 36 особей, полученных in vivo, были перенесены в условия открытого грунта Учебного ботанического сада ПГНИУ. Через 4 месяца после посадки растения были выкопаны для оценки коэффициента размножения (рис.2).
Рис. 2. Растения гладиолуса: а - in vitro, осень 2015 г; б - in vivo, осень 2015 г, в - Gl. х hybridus Дочь Европы, весна 2016 г: 1 - клубнелуковицы, прошедшие этап размножения в культуре in vitro, 2 - клубнелуковицы,
выращенные обычным способом.
Приживаемость растений в условиях открытого грунта представлена в табл. 3.
Таблица 3
Приживаемость растений гладиолуса в открытом грунте
б
а
в
Gl. х hybridus Магма Gl. х hybridus Дочь Европы Gl. х hybridus Дочь Европы Gl. murielae
In vitro In vivo
80,0 % 100,0 % 33,3 % 36,0 %
Растения, пересаженные из пробирок, хорошо приживались. Наиболее жизнеспособным оказался сорт Дочь Европы (100,0%). Приживаемость растений, выращенных in vivo, была значительно ниже и составила для Gl. х hybridus Дочь Европы - 33,3%, для Gl. murielae - 36,0%. Растения, высаженные из пробирок в почву, были более крупными и жизнеспособными, у них происходило образование клубнепочек. Растения, полученные in vivo, оказались небольших размеров, слабыми и не образовывали клубнепочки.
Среднее количество образовавшихся клубнепочек на одно растение, полученное в культуре in vitro, составило 4-5 штук, что согласуется с литературными данными [12], в которых отмечается, что растения, перенесенные с корнями из пробирок в открытый грунт, через 4-6 месяцев формировали клубнелуковицы. У растений in vivo клубнепочки не образовались. На второй год посадки растения, прошедшие этап микроразмножения in vitro,
зацветали в отличие от растений, выращенных обычным способом.
Выводы. Использование клубнепочек в качестве первичных эксплантов при микро-клональном размножении двух видов рода Gladiolus L. оказалось эффективным. Выход стерильной культуры составил для Gl.х hybridus - 88% , для Gl. murielae - 94%. На этапе микроразмножения хорошие результаты получены при добавлении к питательной среде MS таких регуляторов роста, как Р-индолилуксусной кислоты (1 мг/л), 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (1,5 мг/л), 6-бензиламинопурина (1,5 мг/л). Приживаемость растений, переведенных из условий in vitro в in vivo, превышает 80%, что значительно выше, чем у особей, выращенных обычным способом (33-36%). При использовании техники микроклонального размножения продолжительность развития гладиолуса сокращается в несколько раз по сравнению с его жизненным циклом в естественных условиях.
Литература
1. Шипунова А. А. Клональное микроразмножение садовых растений : автореф. дис. ... канд. с.-х. наук. М., 2003. 24 с.
2. Kamo К. Effect of phytohormones on plant regeneration from callus of Gladiolus cultivar 'Jenny Lee' // In vitro plants. 1994. P. 26-31.
3. Ziv, M., Halevy A.H., Shilo R. Organ and plantlet regeneration of gladiolus through tissue culture // Ann. Bot. 1970. № 34. Р. 671-676.
4. Мокшин Е. В. Морфо-физиологические особенности клонального микроразмножения in vitro различных сортов лилий и гладиолусов : автореф. дис. ... канд. биол. наук. Саранск, 2005. 20 с.
5. Осипова Е. Ю. Технология размножения гладиолуса in vitro // 61-я студ. науч. конф. (Генетика, селекция и биотехнология). М. : РГАУ-МСХА им. К. А. Тимирязева, 2008. С. 54-55.
6. Prasad V. S. S., Dutta Gupta E. S. In vitro shoot regeneration of gladiolus in semi-solid agar versus liquid cultures with support systems // Plant Cell Tiss Organ Cult. 2006. № 87. Р. 263-271.
7. Gladiolus micropropagation in temporary immersion system / Ruffoni B. |et al.]. // Propagation of Ornamental Plants. 2008. Vol. 8. № 2. Р. 102-104.
8. Ахмед А. К. Создание высокоэффективной системы микроклонального размножения генетически стабильных растений гладиолуса : автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 2000. 16 с.
9. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissued cultures // Physiol. plant. 1962. Vol. 15. P. 473-497.
10. Бутенко Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М. : Наука, 1964, 272 с.
11. Высоцкий В. А. Клональное микроразмножение растений // Культура клеток растений и биотехнология. М. , 1986. С. 91-102.
12. Калинин Ф. Л., Кушнир Г. П., Сарнацкая В. В. Технология микроклонального размножения растений. Киев : Наукова думка, 1992. 232 с.
THE USE OF CORMELS AS PRIMARY EXPLANTS OF MICROPROPAGATION OF GLADIOLUS L.
N. L. Shibanova, Cand. Bio. Sci., Associate Professor M. A. Chertkova, Post-Graduate Student T.V. Melnikova, Master's Degree Student Perm State National Research University 15 Bukireva St., Perm 614990 Russia E-mail: [email protected]
ABSTRACT
Research was conducted at the Microclonal Propagation Laboratory of the Botany and Plant Genetics Department and at the Botanical garden of the Perm State National Research University in 2014-2016. The article presents data on micropropagation of two species of the genus Gladiolus L.: Gl. murielae Kelway and Gl. * hybridus hort. (6 cultivars). It is found that for the sterilization of explants Gl. * hybridus it is better to use the 7% sodium hypochlorite solution (15-25 min) and then 96% ethanol (30 sec), for Gl. murielae preferred reverse order of use of sterilizing agents. Sterile culture was more than 87%, respectively. When adding auxin (P-indoleacetic acid 1 ml/l, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 1.5 ml/l) into the culture MS medium on cormels observed the formation of morphogenic callus, multiplication factor in this case amounted to 3.67±2.04 pcs / explant for Gl. murielae and 5.14± 1.21 pcs / explant for Gl. х hybridus. Action cytokinins (6-benzylaminopurine 1.5 ml/l) traced to increase the number of seedlings compared with medium without hormone, reproduction rate was 1.80±0.41 pcs / explant and 2.00±0.27 pcs / explant, respectively. Plants were transferred from conditions in vitro to in vivo. Plant survival was 80-100%, significantly higher than individuals grown normally (3336%). Plants grown from cormels in vitro blossomed in the second year. Usually, gladiolus from cormels blooms for the third or fourth year.
Key words: micropropagation, cormels, Gladiolus х hybridus hort., Gladiolus murielae Kelway.
References
1. Shipunova A. A. Klonal'noe mikrorazmnozhenie sadovykh rastenii (Micropropagation of garden plants), avtoref. dis. ... kand. s.-kh. nauk, Moscow, 2003, 24 p.
2. Kamo K. Effect of phytohormones on plant regeneration from callus of Gladiolus cul-tivar 'Jenny Lee', In vitro plants, 1994, P. 26-31.
3. Ziv, M., Halevy A.H., Shilo R. Organ and plantlet regeneration of gladiolus through tissue culture, Ann. Bot., 1970, No. 34, P. 671-676.
4. Mokshin E. V. Morfo-fiziologicheskie osobennosti klonal'nogo mikroraz-mnozheniya in vitro razlichnykh sortov lilii i gladiolusov (Morphological and physiological characteristics of clonal micropropagation in vitro of different varieties of Lilium and Gladiolus), avtoref. dis. ... kand. biol. nauk, Saransk, 2005, 20 p.
5. Osipova E. Yu. Tekhnologiya razmnozheniya gladiolusa in vitro (Gladiolus breeding technology in vitro), Genetika, selek-tsiya i biotekhnologiya: 61-ya stud. nauch. konf., Moscow, RGAU-MSKhA im. K. A. Timiryazeva, 2008, pp. 54-55.
6. Prasad V. S. S., Dutta Gupta E. S. In vitro shoot regeneration of gladiolus in semi-solid agar versus liquid cultures with support systems, Plant Cell Tiss Organ Cult., 2006, No. 87, pp. 263-271.
7. Ruffoni B. at al. Gladiolus micropropagation in temporary immersion system, Prop-agation of Ornamental Plants, 2008, Vol. 8, No. 2, pp. 102-104.
8. Akhmed A.K. Sozdanie vysokoeffektivnoi sistemy mikroklonal'nogo razmno-zheniya geneticheski stabil'nykh ras-tenii gladiolusa (Creating of a highly effective system of micropropagation of genetically stable plant of gladiolus), avtoref. dis. ... kand. biol. nauk, Moscow, 2000, 16 p.
9. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with to-bacco tissued cultures, Physiol. plant., 1962, Vol. 15, pp. 473-497.
10. Butenko R.G. Kul'tura izolirovannykh tkanei i fiziologiya morfogeneza rastenii (Culture of isolated tissue and physiology of plant's morphogenesis), Moscow, Nauka, 1964, 272 p.
11. Vysotskii V.A. Klonal'noe mikrorazmnozhenie rastenii (Clonal micropropagation of plants), Kul'tura kletok rastenii i biotekhnologiya, Moscow, 1986, pp. 91-102.
12. Kalinin F.L., Kushnir G.P., Sarnatskaya V.V. Tekhnologiya mikroklonal'nogo razmnozheniya rastenii (The technology of micropropagation of plants), Kiev, Naukova dumka, 1992, 232 p.
