Оптимизация питательной среды при микроклональном размножении георгины культурной Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

2005 Биология Вып. 6

УДК 581.165.7

ОПТИМИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ПРИ МИКРОКЛОНАЛЬНОМ РАЗМНОЖЕНИИ ГЕОРГИНЫ КУЛЬТУРНОЙ

С.А. Шумихин

Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15

Оптимизация питательной среды по составу фитогормонов, проведенная симплекс-методом в 2 этапа с использованием 6 сред, выявила оптимальное соотношение фитогормонов, которое позволило существенно повысить регенерационные способности большинства клонов георгины

Микроразмножение растений в культуре in vitro в настоящее время является наиболее эффективным способом их коммерческого воспроизводства и одним из путей сохранения растительного биоразнообразия. Кроме того, использование методов криоконсервации позволяет создавать генетические «банки» тканей и достаточно быстро реагировать на изменение спроса. Вместе с тем широкое использование микроклонирования требует оптимизации отдельных его этапов. Исследования, проведенные нами ранее на георгине, выявили необходимость оптимизации условий культивирования на питательных средах по составу фитогормонов (Шумихин, 1997; 2004).

Задачей данного исследования являлся количественный подбор концентраций регуляторов роста в питательной среде для клонального микроразмножения георгины культурной.

Влияние различных регуляторов роста на культуру тканей георгины изучено нами на примере клона 3, который отличается средними способностями к регенерации in vitro. Кроме того, на последнем этапе эксперимента использовали клоны георгины 0, 192 и 202. В качестве культуральной использовали наиболее часто рекомендуемую для культуры растительных тканей твердую питательную среду с минеральной основой по Т. Мурасиге и Ф. Скугу (Murashige, Skoog, 1962), витаминами по Р.Г. Бутенко (1964), 2% сахарозой, 0,7-0,8% агар-агаром. Исследовали влияние на культуру георгины индолилуксусной кислоты (ИУК) в концентрациях 0,5; 0,75 мг/л и 1 мг/л, кинетина (К) в концентрациях 0,04; 0,06 мг/л и 0,08 мг/л, гиббе-релловой кислоты (ГК) в концентрациях 0,08; 0,12 мг/л и 0,16 мг/л и кокосового молока (15 мг/л). Стимуляторы роста добавляли в культуральные среды перед их стерилизацией.

Изучали влияние на регенерацию растений комплексных по составу фитогормонов питатель-

ных сред. Для этого использовали симплекс-метод планирования эксперимента, описанный в литературе как один из методов оптимизации процессов в химической технологии (Зедгенидзе, 1976; Ахна-зарова, Кафаров, 1978; Саутин, Пунин, 1991). При выборе первоначальных концентраций регуляторов роста и уровней их варьирования руководствовались рекомендациями Л.Н. Трофимец с соавторами (1990).

Питательные среды стерилизовали паром при температуре +120°С под давлением 1,1 атмосферы в течение 15 минут. Стерилизацию культуральных сосудов (пробирок), инструментов и оборудования осуществляли согласно общепринятым методикам (Бутенко, 1964). Процесс высадки эксплантов на питательную среду производили в ламинар-боксе в соответствии с правилами работы со стерильным материалом (Бутенко, 1964).

Пересадку растений на новую питательную среду осуществляли через 6 недель. При этом производили массовый отбор, исключая растения, не соответствующие по своим характеристикам контрольным образцам. Нормально развитые расте-ния-регенеранты расчленяли на микрочеренки (вторичные экспланты) длиной 15-25 мм, содержащие не менее одного узла. В каждую пробирку высаживали обычно по 2 микрочеренка. Одновременно определяли коэффициент микроразмножения как среднее по опыту количество микрочеренков, полученных от одного растения-регенеранта за один пассаж. Его использовали в качестве основного критерия при оценке успешности оптимизации состава питательной среды для микроразмножения. Контролем служили растения, выращенные на питательных средах того же состава, но при отсутствии регуляторов роста. Повторность опытов двухкратная.

Посаженные растения находились в условиях

© С. А. Шумихин, 2005

круглосуточного освещения люминесцентными лампами интенсивностью 1000-3000 люкс при температуре +22...24°С. Каждый пассаж на питательную среду, содержащую фитогормоны, предварялся двумя-тремя циклами выращивания растений на среде того же состава, но без регуляторов роста. Тем самым исключается влияние на экс-планты условий культивирования в предыдущем пассаже (Шатило, Келдыш, Морозова, 1991).

Для анализа роста использовали методическую разработку И.В. Кармановой (1976). Линейные замеры растений-регенерангов проводили с периодичностью 7 дней. Фиксировали следующие биометрические параметры: скорость роста побегов (скорость регенерации), абсолютный прирост побегов, присутствие у регенератов корней, абсолютный прирост корней. Кроме того, отмечали начало пролиферации пазушных побегов и время закладки корневых зачатков. Через 5-6 недель культивирования вычисляли процент корнеобразования (количество растений с корнями, выраженное в процентах).

Полученные результаты обрабатывали методами вариационной статистики (Доспехов, 1985) с использованием программ SuperCalc 4 (version 1.00), Statgraphics (version 3.0).

Как выяснилось в предыдущих исследованиях,

генетически разнокачественный материал георгины изначально обладает неодинаковой способностью к регенерации in vitro (Шумихин, 1997). Кроме того, при длительном культивировании на питательных средах, не содержащих регуляторов роста, происходит снижение общей способности клонов к регенерации. На первом этапе оптимизации питательных сред необходимо произвести подбор концентраций фитогормонов как экзогенных индукторов морфогенеза.

Результаты изучения влияния различных групп фитогормонов на регенерацию георгины in vitro представлены в табл. 1.

Из всех вариантов опыта наименьший абсолютный прирост побегов (37,0 мм) и наименьшее количество узлов (2,45) отмечены при выращивании эксплантов на питательной среде с кокосовым молоком, причем уменьшение регенерационных способностей в этом случае оказалось достоверно значимым при Р=0,05 в сравнении с контролем (среда без фитогормонов). По-видимому, в использованной концентрации кокосовое молоко не увеличивает регенерационный потенциал эксплантов георгины. Более того, оно оказало прямо противоположное, угнетающее рост действие.

Таблица 1

Регенерация микрочеренков георгины клона 3 на питательных средах с различными

регуляторами роста

Состав среды Абсолютный прирост побега, мм Количество узлов

М+т CV,% t* М+т CV,% t*

М-С контроль 65,1±7,6 52,0 - 3,70+0,29 35,2 -

М-С+ГК 0,08 мг/л 68,3±6,3 40,9 0,33 3,90+0,16 18,4 0,60

М-С+ГК 0,12 мг/л 76,6+7,8 45,6 1,05 4,10+0,26 28,4 1,02

М-С+ГК 0,16 мг/л 93,9+5,4 25,9 3,09 4,30+0,13 13,3 1,89

М-С+К 0,04 мг/л 69,2+4,8 31,0 0,46 4,25+0,18 18,4 1,62

М-С+К 0,06 мг/л 72,1+6,2 38,4 0,72 4,10+0,26 28,4 1,02

М-С+Л 0,08 мг/л 72,6+6,3 38,9 0,76 4,35+0,22 23,0 1,78

М-С+ИУК 0,5 мг/л 50,5+3,7 34,1 1,73 3,63+0,16 19,7 0,21

М-С+ИУК 0,75 мг/л 60,4+6,0 44,5 0,48 3,88+0,24 27,1 0,48

М-С+ИУК 1 мг/л 58,8+7,7 58,6 0,58 4,23+0,26 27,5 1,36

М-С + кокосовое молоко 15 мг/л 37,0±6,2 74,4 2,88 2,45±0,18 33,7 3,63

* Фактическое значение нормированного отклонения при сравнении результатов регенерации на средах с регуляторами роста и без них (^5=2,02).

При использовании гибберелловой кислоты (ГК), кинетина (К) и ИУК во всех концентрациях также не наблюдали (при Р=0,05) улучшения роста культуры по сравнению с контролем, хотя с повышением концентраций фитогормонов в питательной среде, как правило, отмечалось незначительное увеличение регенерационных способностей эксплантов. Исключение составила питательная среда с ГК в концентрации 0,16 мг/л. При 42 днях культивирования на ней абсолютный прирост побегов составил в среднем 93,9+5,4 мм, что достоверно отличалось от контрольного показателя (65,1+7,6 мм), однако по количеству узлов разница в этом случае оказалась статистически незначи-

мой. Вытягивание побегов под действием экзогенной ГК отмечалось ранее и другими исследователями (Кулаева, 1982).

Динамика роста побегов менялась в течение культивирования. В контроле и во всех случаях использования фитогормонов проявлялась одна и та же закономерность. Наименьший среднесуточный прирост побегов (0,54-0,89 мм в сутки) наблюдали в 1-ю неделю регенерации после пассажа, а наибольший (2,16-2,95 мм в сутки) - в течение 3-й недели культивирования. С 4-й по 6-ю недели во всех случаях происходило постепенное снижение скорости роста побегов. После 6 недель выращивания in vitro становились заметными признаки

дегенерации культуры, связанные, по-видимому, с истощением питательных сред: наблюдались хлороз и отмирание нижних листьев, а также резкое падение скорости роста побегов.

Из литературы известно, что рост стебля в длину регулируется прежде всего ауксином и гибберелли-нами, причем действие гиббереллинов проявляется только в тканях, содержащих ауксин (Полевой, Са-ламатова, 1991). Не вызывает сомнений и роль в ростовых процессах цитокининов как основных индукторов клеточного деления (Бутенко, 1975).

Поэтому, связывая постепенное снижение регенерационных способностей у клонов георгины в условиях in vitro с недостатком эндогенно синтезируемых ими регуляторов роста, можно предположить усиление ростовых процессов на питательных средах, содержащих комплекс фитогормонов, по сравнению с питательными средами, содержащими отдельные регуляторы роста. Для проверки этого предположения необходимо получить среду с оптимальным соотношением фитогормонов, обеспечивающую успешную регенерацию.

При решении задач оптимизации состава питательных сред для культуры in vitro высокую эффективность показали методы математического планирования эксперимента (Максимов, Федоров,

Таблица 2

Регенерация микрочеренков георгины клона 3 на питательных средах, разработанных симплекс-

методом

1969; Смирнов, Латыпов, Перчуляк, 1986 и другие). Для решения нашей задачи - оптимизации питательной среды по содержанию фитогормонов - мы использовали симплекс-метод (метод последовательного отражения), не применявшийся ранее в исследованиях по культуре тканей. Концентрации фитогормонов в исходной серии опытов следующие: ГК - 0,08 мг/л; К - 0,04 мг/л; ИУК - 1 мг/л. Они соответствуют концентрациям, наилучшим для регенерации эксплантов (что было установлено в предыдущем исследовании, табл.1). Уровни варьирования концентраций были выбраны нами с таким расчетом, чтобы получить наиболее широкие границы изменчивости изучаемых факторов (фитогормонов). Как мы отмечали выше, эффективность микроклонирования наиболее точно определяется количеством узлов, образуемых растениями in vitro. Способность к регенерации может быть установлена по такому показателю, как абсолютный прирост побега. Поэтому в качестве критерия оптимизации мы параллельно использовали оба эти показателя.

Результаты регенерации эксплантов клона 3 на питательных средах, разработанных с помощью симплекс-метода, представлены в табл. 2.

Номер питатель- Концентрация фитогормонов в среде, мг/л Абсолютный прирост побега, мм Количество узлов

ной среды ГК К ИУК М ± m CV,% t* М ± m CV,% t*

Контроль - - - 65,1±7,6 52,0 - 3,70+0,29 35,2 -

1 0,240 0,103 1,204 106,5±5,3 22,2 4,48 4,50+0,11 11,1 2,56

2 0,080 0,103 1,204 96,4±6,6 30,5 3,12 4,25±0,20 21,4 1,55

3 0,160 0,034 1,204 83,2+6,1 32,6 1,87 4,30±0,25 26,2 1,56

4 0,160 0,080 0,388 102,9±7,6 52,0 3,52 4,30±0,18 18,6 1,76

5 0,160 0,157 0,660 77,4±5,6 22,2 1,3 4,40+0,15 15,5 2,13

6 0,290 0,123 0,297 58,0+6,5 49,9 0,71 3,80±0,25 30,3 0,26

* Фактическое значение нормированного отклонения при сравнении результатов регенерации на средах с фитогормонами и без них (^ = 2,02).

Начальная серия опытов, проводимых на питательных средах 1-4, показала высокую эффективность одновременного использования комплекса фитогормонов для регенерации культуры, нежели их применение по отдельности. Абсолютный прирост побега на питательных средах 1, 2 и 4 существенно превосходил контрольный. Количество узлов достоверно выше (при Р=0,05) было лишь на питательной среде 1.

Динамика роста побегов на комплексных по фитогормонам питательных средах не отличалась от описанной нами выше для контроля. Однако на питательных средах 1, 2 и 4 скорость роста побегов достигала максимума на четвертую неделю культивирования (3,60—4,63 мм в сутки), тогда как в контроле и на средах, содержащих один из фитогормонов, это происходило на неделю раньше и среднесуточный прирост при этом был меньше

(2,16-2,95 мм в сутки). По-видимому, соотношение регуляторов роста в средах 1, 2 и 4 способствует более длительному сохранению высоких темпов регенерации. В конечном итоге это отражается на высоком абсолютном приросте побегов. На питательной среде 3 экспланты достигали максимальной скорости регенерации, как и в контроле, в третью неделю культивирования (3,19 мм в сутки). Соответственно на этой питательной среде наблюдался меньший абсолютный прирост побегов, чем на средах 1, 2 и 4. На комплексных питательных средах признаки дегенерации растений проявлялись так же, как и в остальных случаях после шести недель выращивания in vitro. Таким образом, для получения максимального количества клоно-вого материала период между пассажами не должен превышать шести недель (42 дня).

На основании результатов начальной серии

опытов нами были рассчитаны концентрации фитогормонов для питательных сред 5 и 6. Регенерация эксплантов на этих средах существенно не отличалась от контрольных.

Таким образом, второй шаг оптимизации по симплекс-методу (питательные среды 5 и 6) пока-

зал, что экстремум по обоим критериям оптимальности достигнут при соотношении фитогормонов в питательной среде 1.

На оптимизированную для клона 3 питательную среду были высажены экспланты клонов 3 (повторно), 202,0 и 192 (табл. 3).

Таблица 3

Регенерация эксплантов разных клонов георгины на питательной среде!

Абсолютный прирост побега, мм Количество узлов 1<)5

Клон М ± т СУ,% М ± ш СУ,%

3 74,2±3,7 22,5 1,07 4,45±0,11 11,5 2,40 2,02

202 106,0±2,3 4,3 10,76 4,75±0,25 10,5 2,66 2,10

0 112,9±10,5 ■ 33,5 1,31 4,54±0,31 24,8 2,78 2,04

192 35,9±3,3 9,1 5,08 3,30±0,13 17,3 1,93 2,02

* Фактическое значение нормированного отклонения при сравнении с результатами регенерации на питательных средах без фитогормонов (табл. 4).

Таблица 4

Клон Абсолютный прирост побега, мм Количество узлов

М+т СУ,% 1* М+т СУ,% 1*

‘Тартан’ 62,0+6,5 47,1 0,91 3,55+0,21 26,6 0,28

3 65,1 ±7,6 52,0 1,61 3,70+0,29 35,2 1,58

192 83,6+8,8 47,2 0,84 3,70+0,16 19,8 2,21

0 94,9+8,8 47,2 0,84 3,50+0,21 27,0 2,99

202 53,0±4,9 16,1 7,39 3,67±0,33 15,7 3,59

* Фактическое значение нормированного отклонения при сравнении результатов регенерации после первого и шестнадцатого пассажей (105=2,02).

По сравнению с контролем (табл. 4) абсолютный прирост побегов на питательной среде 1 достоверно увеличился у клона 202, достоверно уменьшился у клона 192 и остался без изменения у клонов 3 и 0. Коэффициент микроклонального размножения при этом был существенно выше, чем в контроле, у клонов 3, 202 и 0, а достоверно уменьшился у клона 192.

Таким образом, полученная в результате оптимизации питательная среда 1 повышает регенерационные способности эксплантов. Она является оптимальной для микроразмножения большинства изученных нами клонов. В отношении других клонов георгины и ее культуры в целом мы можем высказать обоснованное предположение, что оптимальные концентрации фитогормонов хотя и специфичны для отдельных сортов и клонов, в большинстве случаев они будут близки.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты «Урал» - 2004 № 04-04-96069).

Библиографический список

Ахназарова С.Л., Кафаров В.В. Оптимизация эксперимента в химии и химической технологии. М.: Высш. школа, 1978. 319 с.

Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964. 272 с.

Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. М.: Аг-ропромиздат, 1985. 351 с.

Зедгенидзе И.Г. Планирование эксперимента для исследования многокомпонентных систем. М.: Наука, 1976. 390 с.

Карманова И.В. Математические методы изучения роста и продуктивности растений. М.: Наука, 1976. 223 с.

Кулаева О.Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РНК и белка. М.: Наука, 1982. 83 с.

Максимов В.Н., Федоров В.Д. Применение методов математического планирования эксперимента при отыскании оптимальных условий культивирования микроорганизмов. М.: Изд-во МГУ, 1969. 129 с.

Полевой В.В., Сапаматова Т.С. Физиология роста и развития растений. Л.: Изд-во ЛГУ, 1991.240 с.

Саутин С.Н., Лунин А.Е. Мир компьютеров и химическая технология. Л.: Химия, 1991. 114 с.

Смирнов В.А., Латыпов С.А., Перчуляк Л.П. Оптимизация питательной среды для побегообразования в культуре клеток томатов // Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986. С. 128-132.

Трофимец Л.Н., Бойко В.В., Анисимов Б.В. и др. Безвирусное семеноводство картофеля. М.: Аг-ропромиздат, 1990. 32 с.

Шатило В.И., Келдыш М.А., Морозова С.Е. Гормональная индукция органогенеза в культуре

изолированных апексов георгины // Бюл. Гл. бот. сада. 1991. Вып. 159. С. 68-72.

Шумихин С.А. Клональное размножение Dahlia variabilis Desf. in vitro // Вестн. Перм. ун-та. 1997. Вып.З. Биология. С. 65-71.

Шумихин С.А. Оптимизация отдельных этапов мик-роклонального размножения георгины культур-

ной: стерилизация эксплантов // Вестн. Перм. ун-та. 2004. Вып. 2 Биология. С. 61-63. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissued cultures // Physiol, plant. 1962. Vol. 15. № 3. P. 473^97.

Поступила в редакцию 03.10.2005

The optimisation of the growing medium for clonal propagation of Dahlia x cul-

torum in vitro

S.A. Shumikhin

Pecularities of the microclonal propagation of dahlia have been considered. The resultats of optimization nutrient medium for dahlia micropropagation has been described.