CC BY
80
2013
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Сер. 11
Вып. 4
ФАРМАКОЛОГИЯ
УДК 579.252.5 57.017.35
И. В. Духовлинов, Р. И. Аль-Шехадат, Е. А. Федорова, К. З. Шаинидзе, А. И. Орлов
ОПТИМИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ ПРЕПАРАТА ДЛЯ РЕГЕНЕРАТИВНОЙ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ ПОВЕРХНОСТНЫХ ТКАНЕЙ ЧЕЛОВЕКА РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ
Общеизвестно, что одним из ключевых элементов системы медицинской помощи при травмах является стимуляция процессов регенерации поврежденных клеток и тканей. Большинство современных методов стимуляции регенерации основаны либо на улучшении трофики тканей, окружающих поврежденный участок, либо на повышении скорости пролиферации входящих в их состав клеток (в первую очередь это относится к клеткам соединительной ткани). Наибольшей эффективностью обладают препараты, действующим началом которых являются митогенные факторы роста, способные специфически запускать деление клеток-мишеней. Источником митогенных факторов роста могут быть экстракты и вытяжки из биологических продуктов (тимус крупного рогатого скота, плацента человека и др.) либо рекомби-нантные белки, выделенные из организмов-продуцентов (бактерии, дрожжи, культивируемые клетки млекопитающих и др.). Рядом работ была установлена возможность применения генной терапии для лечения ран. Так, молекула ДНК, включенная в состав биосовместимой матрицы и несущая какой-либо генный продукт, может быть доставлена в репаративные клетки в области раны [1]. В числе таких генов рас-
Духовлинов Илья Владимирович — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела общей патологии и патофизиологии (группа генной инженерии) ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН; e-mail: dukhovlinov@gmail.com
Аль-Шехадат Руслан Исмаилович — кандидат биологических наук, научный сотрудник отдела общей патологии и патофизиологии (группа генной инженерии) ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН; e-mail: alshekhadat@yahoo.com
Федорова Екатерина Александровна — научный сотрудник отдела общей патологии и патофизиологии (группа генной инженерии) ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН; e-mail: ekaterinafedorova89@gmail. com
Шаинидзе Кристина Зурабовна — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела общей патологии и патофизиологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН; e-mail: Kristina-shainidze@ yandex.ru
Орлов Антон Иосифович — доктор химических наук, зам. директора по инновационной деятельности ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН; e-mail: anton.orlov@mail.ru
© И. В. Духовлинов, Р. И. Аль-Шехадат, Е. А. Федорова, К. З. Шаинидзе, А. И. Орлов, 2013
сматриваются, в том числе, различные ростовые факторы, включая инсулиноподоб-ный фактор роста.
Инсулиноподобный фактор роста человека первого типа (ИФР-1, IGF-1) является пептидным ростовым фактором, опосредующим эффекты соматотропного гормона (СТГ). Показано, что обработка ИФР-1 улучшает заживление тканей [2-6]. ИФР-1 использовался для снижения проявлений токсической невропатии [7]. Имеются неблагоприятные побочные эффекты, такие как гипогликемия, изменения психического состояния, отек, утомление и головные боли, которые ограничивают терапевтическое применение пептида ИФР-1 [8]. Указанные побочные эффекты обусловливаются применением сверхдоз свободного ИФР-1, которые необходимы для достижения биологической эффективности и стимуляции процессов регенерации в конкретном локальном месте при системном введении [8]. В связи с этим был разработан способ локальной доставки пептида ИФР-1 к месту повреждения с помощью конструкции, включенной в состав биосовместимой матрицы и несущей инсулиноподобный фактор роста. Введенный в ткани, окружающие повреждения, вектор экспрессии, содержащий ген фактора роста, позволяет поддерживать постоянный уровень фактора роста в месте повреждения, стимулируя таким образом процесс регенерации.
Ключевым моментом, определяющим эффективность генной терапии, является выбор способа переноса ДНК в клетки-мишени, в связи с чем актуальной является разработка невирусных методов переноса ДНК, в том числе так называемой «голой» ДНК [9]. Преимуществом введения «голой» плазмидной ДНК для лечения повреждений является местный характер ее действия, так как она проникает в клетки преимущественно в области введения, в отличие от введения ДНК в липосомах [10, 11].
Литературные данные показывают, что хранение плазмидных препаратов при температуре -80°С предупреждает образование открытых циркулярных, т. е. поврежденных плазмид. В отличие от этого, длительное хранение ДНК плазмиды при 4°C приводит к быстрому снижению интактной, закрытой циркулярной формы плазмидной ДНК и увеличению открытых циркулярных и линейных молекул ДНК.
Вследствие этого, главной целью данного исследования являлась разработка стабильного и сохраняющего биологическую активность при долговременном хранении и при стресс-испытаниях препарата для генной терапии повреждений поверхностных тканей человека различной этиологии (механические, химические, термические травмы, местные радиационные и электрические повреждения и т. п.).
В рамках данного исследования разработаны гелевая форма препарата для наружного применения, а также жидкая и лиофилизированная формы для парентерального применения при лечении ран и других поверхностных повреждений, которые изучены на предмет стабильности и сохранения биологической активности входящих в их состав плазмидных ДНК при различных условиях хранения.
Материал и методы. Получение плазмидной ДНК pCIGF и создание лекарственных композиций, ее содержащих, осуществлялось в несколько этапов.
1. Наработка очищенного препарата плазмидной ДНК. Музейная культура штамма Escherichia coli/pCIGF представляет собой ночную бульонную культуру, полученную трансформацией штамма E. colli DH10B/R (GIBCO, США) рекомбинант-ной плазмидной ДНК pCIGF и выращенную из отдельной колонии на среде Луриа-Бертани (LB) с добавлением ампициллина до конечной концентрации 100 мкг/мл.
Культивирование вели при температуре 37°С, частоте вращения мешалки от 50 до 250 об/мин, обеспечивающей насыщение культуры кислородом не менее 30%, до достижения оптической плотности 20-40 ед, после чего осуществляли сепарирование биомассы, которая и являлась биологической субстанцией для выделения препарата pCIGF.
Очистку препаратов плазмидной ДНК проводили по методу, предложенному Horn с соавторами [12]. Затем применяли только реактивы фармакопейной чистоты (pharmaceutical) и свободную от ЛПС деионизированную воду, проводили работу в стерильных условиях. ДНК растворяли в буфере для хроматографии, которая проводилась на оборудовании AKTAexplorer (Amersham Pharmacia Biotech, Sweden) при скорости протока жидкости 0,75 мл/мин. Фракции, содержащие не менее 50% суперскрученной формы плазмидной ДНК, объединяли. ДНК осаждали этанолом и повторно наносили на колонку SR 50/100 (Amersham Phаrmacia Biotech, Sweden), наполненную Sephacryl S-1000. Объединяли фракции, содержащие не меньше 90% суперскрученной формы плазмиды. ДНК осаждали этанолом и ресуспендировали в физиологическом растворе хлорида натрия.
Для оценки препарата pCIGF использовали анализ изменения оптической плотности (А) в диапазоне длин волн 200-300 нм. Для этого проводили серию измерений оптических плотностей с шагом 10 нм. Далее строили график зависимости оптической плотности от длины волны. При Этом соотношения А2б0нм/А280нм и А2б0нм/А230нм характеризовали чистоту плазмидной ДНК и, соответственно, были не меньше 1,81,75.
Для определения концентрации плазмидной ДНК в препарате использовали спектрофотометрический метод. Для этого проводили измерение оптической плотности исследуемого образца в стандартной кювете из кварцевого стекла шириной 1 см на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, Россия) при длине волны 260 нм. Концентрацию плазмидной ДНК определяли по формуле:
[ДНК] = А260 X N X 50 [мкг/мл],
где А260 — оптическая плотность исследуемого образца при длине волны 260 нм, N — разведение исходного образца.
Конечная концентрация плазмидной ДНК в препарате должна составлять 1 мг/мл. Контроль структуры плазмидной ДНК оценивали при помощи электрофореза. При этом содержание суперскрученной формы плазмиды было не менее 95% в препарате, а присутствие РНК не детектировалось. Контроль идеинтичности целевого гена проводили секвенированием. Всего было получено 10 мг плазмидной ДНК pCIGF. Концентрированный препарат pCIGF хранили при 4°С в защищенном от света месте. Полученная партия плазмиды использовалась для изготовления инъекционной, лиофильно высушенной и гелевой форм препарата. Для длительного хранения было заложено при температурах -20°, +4°, +20°, +37°С по одной серии каждой лекарственной формы.
2. Подбор гелевых компонентов, в которых плазмидная ДНК структурно и функционально стабильна. В результате подбора веществ, обеспечивающих структурную и функциональную стабильность плазмидной ДНК, было изучено 15 различных композиций. В каждой композиции изучалась концентрация плазмидной ДНК и ее структурная стабильность в течение времени, на 1, 5, 10, 20, 30 день. Использовалась
схема так называемого «ускоренного хранения», когда образцы фармацевтических гелей выдерживались указанное время при температуре 37°С и 45°С. Стабильность плазмидной ДНК при этих параметрах свидетельствует о значительной вероятности ее стабильности в течение длительного времени при температурах 4°С и 20°С. Для определения концентрации плазмидной ДНК в препарате использовали спектрофо-тометрический метод. Содержание суперскрученной формы плазмиды в препарате не менее 95%, присутствие РНК не детектировалось. Контроль идеинтичности целевого гена проводили секвенированием.
3. Исследование условий получения стабильных лиофильно-высушенной и жидкой форм препарата ДНК pCIGF. Исследовалась возможность получения стабильных лиофильно-высушенной и жидкой форм препарата ДНК pCIGF. Для этого использовались различные режимы лиофилизации, включающие в себя варианты предварительного замораживания раствора ДНК pCIGF при различных температурах (от -20°С до -80°С). В качестве защитной среды изучались альбумин, реополиглюкин, поливинилпирролидон, трегалоза в составе различных буферных систем. При получении каждого образца оценивалась структурная стабильность ДНК pCIGF, его способность к растворению и биологическая активность после сублимационного высушивания. Для определения концентрации плазмидной ДНК в препарате использовали спектрофотометрический метод. Конечная концентрация плазмидной ДНК в препарате должна составлять 1 мг/мл. Контроль структуры плазмидной ДНК оценивали при помощи электрофореза. В качестве компонентов защитной жидкой среды изучались аскорбиновая кислота, альфа-токоферол ацетат, тролокс, поли-винилпирролидон в составе различных буферных систем (ацетатной, фосфатной и сукцинатной).
Структурная стабильность гена в составе генотерапевтической конструкции оценивалась с помощью метода секвенирования. Реакцию секвенирования ДНК проводили ферментативным циклическим методом. Реакцию амплификации проводили в термоциклере в течение 35 циклов: 20 с при 95°C, 15 с при 50°C, 1 мин при 60°C, визуализацию продуктов реакции оценивали с помощью электрофореза. Обработку результатов и определение нуклеотидных последовательностей осуществляли с использованием пакетов программ (Sequence Analyzer, Chromas Lite 2.0, BioEdit 7.0.5.2).
Контроль биологической активности препарата включал проведение трансфек-ции клеток линии 293, выделение суммарной РНК, проведение ОТ и ПЦР с последующим электрофорезом результатов ОТ и ПЦР в 1% агарозном геле. В геле детектировалась полоса кДНК, соответствующая положительному контролю и ожидаемому результату. Интенсивность экспрессии определялась методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.
Результаты и обсуждение. В процессе подбора компонентов, образующих гель, в которых плазмидная ДНК обладала бы структурной и функциональной стабильностью, были получены 2 гелевые композиции, в которых плазмидная ДНК остается стабильной в течение 30 дней при температуре 45°С и, следовательно, имеет перспективу длительного хранения при более низкой температуре. Были разработаны 2 фармацевтические композиции для лиофилизированной и жидкой форм геноте-рапевтического препарата для регенерации, в которых плазмидная ДНК была стабильна и сохраняла трансформирующую и биологическую активности.
Исследование условий получения стабильных лиофильно-высушенной и жидкой форм препарата ДНКpCIGF. Установлено, что фосфатный буфер способствует денатурации ДНК pCIGF в процессе лиофилизации. Введение детергента Tween-20 не помогает предотвратить агрегацию ДНК pCIGF после растворения сухого препарата. Наличие 0,5 аргинина в растворе ДНК pCIGF делает невозможным получение сухой формы препарата при любых температурных режимах заморозки, с максимальным вакуумом. При использовании аскорбиновой кислоты и альфа-токоферол ацетата наблюдалась агрегация плазмидной ДНК и ухудшение ее способности к трансформации эукариотических клеток in vitro на 60%. Использование в данных системах ацетатного буфера с pH ниже 5,5 способствовало уменьшению агрегации, однако повышению трансформирующей способности всего на 20%, что выражалось в заниженной биологической активности. Установлено, что при использовании сукци-натного буфера в диапазоне pH 5,0 и pH 6,0 возможно получить истинный раствор плазмидной ДНК, однако при этом меняется электрофоретическая подвижность ДНК в препарате и полностью отсутствует биологическая активность, что может быть связано с возможным окислением гидроксильных групп в составе сахарофос-фатного остова ДНК.
Стресс-испытания и исследование стабильности и активности различных лекарственных форм препарата плазмидной ДНК pCIGF при долговременном хранении
1. Закладка на хранение и стресс-испытание различных лекарственных форм препарата плазмидной ДНК pCIGF. В соответствии с методическими указаниями ICH (в системе «гармонизированных» документов принято обозначение QIA), которые были утверждены в 1993 г., были также проведены стресс-испытания, в ходе которых был установлен срок экспериментального ускоренного хранения, который составил при температуре 50°С 45 суток, при температуре 37°C — 45 суток. Препарат был наработан в трех лекарственных формах и заложен на хранение в различных условиях.
Согласно методике определения стабильности медицинских препаратов методом ускоренного теста c расчетом константы скорости дезактивации при предельном изменении активности не более 5%, время хранения препарата: плазмидная ДНК pCIGF в жидкой инъекционной форме соответствует 1 году хранения при температуре +4°С, в лиофильно высушенной форме — 2,5 года, в гелевой форме — 9 месяцев. Физико-химические показатели наполнителей фармацевтических композиций остались без изменений.
2. Изучение биологической активности различных лекарственных форм препарата при длительном хранении. Исследование влияния условий хранения препарата в различных лекарственных формах на его активность показало, что для разных форм препарата оптимальная для хранения температура различается. Так, для сохранения активности препарата в лиофилизованной форме оптимальная температура — 4°С и 0°С, в жидкой форме — 0°С и -4°С, в гелевой форме — 0°С. Все вышеперечисленные формы препарата содержат активное вещество в наибольшем количестве при температуре 0°С. Уменьшение содержания активного вещества происходит равномерно, срок начала такого уменьшения (от 40 до 320 дней) и резкость
(резкое в гелевой форме препарата при хранении при 20°С и плавное в гелевой форме препарата при хранении при 0°С и 4°С) различаются у разных форм препарата. Установлено, что активность препарата наилучшим образом сохраняется при его хранении в лиофилизованной форме.
Таким образом, в ходе исследования установлено, что наиболее оптимальной лекарственной формой, стабильной и сохраняющей активность при долговременном хранении, является лиофилизированный препарат, содержащий плазмидную ДНК pCIGF. Разработанная лекарственная форма может применяться в терапии ран различного генеза (механические, химические, термические травмы, местные радиационные и электрические повреждения и т. п.) путем нанесения на поврежденные участки и окружающие кожные покровы. Представленные данные позволят существенно повысить эффективность действия генно-терапевтических препаратов для лечения повреждений поверхностных тканей человека различной этиологии.
Литература
1. Bonadio J., Smiley E., Patil P., Goldstein S. Localized, direct plasmid gene delivery in vivo: prolonged therapy results in reproducible tissue regeneration // Nature Medicine. 1999. Vol. 5. Р. 753-759.
2. Martin P. Wound healing — aiming for perfect skin regeneration // Science. 1997. Vol. 276, N 5309. Р. 75-81.
3. Steenfos H. Growth factors and wound healing // Scand. J. Plast. Reconstr. Hand Surg. 1994. Vol. 28. Р. 95-105.
4. Pierre E. J., Perez-Polo J. R., Mitchell A. T. et al. Insulin-like Growth Factor-I Liposomal Gene Transfer and Systemic Growth Hormone Stimulate Wound Healing // J. Bum. Care Rehab. 1997. Vol. 18 (4). Р. 287-291.
5. Valentinis B., Baserga R. IGF-I receptor signalling in transformation and differentiation // Mol. Pathol. 2001. Vol. 54. Р. 133-137.
6. Sadagurski M., Yakar Sh., Weingarten G. et al. Insulin-Like Growth Factor 1 Receptor Signaling Regulates Skin Development and Inhibits Skin Keratinocyte Differentiation // Mol. Cell. Biol. 2006. April. Vol. 26(7). Р. 2675-2687.
7. Contreras P. C., Vaught J. L., Gruner J. A. et al. Insulin-like growth factor-I prevents development of a vincristine neuropathy in mice // Brain Research. 1997. Vol. 774 (1-2). Р. 20-26.
8. Jabri N., Schalch D. S., Schwartz S. L. et al. Adverse effects of recombinant human insulin-like growth factor I in obese insulin-resistant type II diabetic patients // Diabetes. 1994. Vol. 43. Р. 369-374.
9. Bondy C. A., Underwood L. E., Clemmons D. R. et al. Clinical uses of insulin-like growth factor I // Ann. Int. Med. 1994. Vol. 120. Р. 593-601.
10. Herweijer H., Wolff J. A. Progress and prospects: naked DNA gene transfer and therapy // Gene Ther. 2003. Mar. Vol. 10 (6). Р. 453-458.
11. Shimamura M., Morishita R. Naked plasmid DNA for gene therapy // Curr. Gene. Ther. 2011. Dec. Vol. 11(6). Р. 433.
12. Horn N., Meek J., Budahazi G., Marquet M. Cancer gene therapy using plasmid DNA: purification of DNA for human clinical trials // Hum. Gene Therapy 1995. Vol. 6. Р. 565-573.
Статья поступила в редакцию 15 августа 2013 г.
