CC BY
115
Изучение фармакокинетики трёх лекарственных форм препарата для регенеративной генной терапии повреждений поверхностных тканей человека
различной этиологии
Духовлинов И.В.1, Аль-Шехадат Р.И.1, Орлов А.И.2
1 — Общество с ограниченной ответственностью «Фарма Ген»
2 — ФГБУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» СЗО РАМН, г. Санкт-Петербург
Резюме
Целью настоящего исследования явилось сравнение фармакокинетических и фармакодинамических показателей трёх лекарственных форм нового лекарственного препарата на основе плазмидной ДНК pCIGF для регенеративной генной терапии повреждений поверхностных тканей человека различной этиологии. Доклиническое исследование фармакологических свойств и лекарственной безопасности препарата проведено на мышах, которым препарат вводился однократно и двукратно. Введение жидкой и лиофилизованной форм препарата проводили внутримышечно, гелевая форма применялась наружно. Анализировали различные органы: мозг, сердце, кровь (лейкоцитарную массу и сыворотку), лёгкое, печень, почку, селезёнку, мышцу (место укола) на наличие в них плазмиды в зависимости от времени после введения.
Ключевые слова: фармакокинетика, фармакодинамика, регенеративная генная терапия
Examine the pharmacokinetics of three formulations of the drug for regenerative gene therapy damage the surface of human tissues of various etiologies
Duhovlinov I.V.1, Al-Shekhadat R.I.1, Orlov A.I.2
1 — LLC «Pharma Gen»
2 — FGBI «Scientific Research Institute of Experimental Medicine» RAMS, St. Petersburg
Summary
The purpose of this study was to compare the pharmacokinetic and pharmacodynamic parameters of three formulations of a new drug on the basis of plasmid DNA pCIGF for regenerative gene therapy damage the surface of human tissues of various etiologies. Preclinical study of the pharmacological properties of the drug and drug safety carried out in mice, which was administered once and twice. Introduction of liquid and lyophilized forms of the drug was carried out by intramuscular injection, topically applied gel form. Analyzed various organs: brain, heart, blood, lung, liver, kidney, spleen, muscle for the presence of plasmid depending on the time after administration.
Keywords: pharmacokinetics, pharmacodynamics, regenerative gene therapy
Введение
Исследование фармакокинетических свойств новых лекарственных веществ является одним из важнейших этапов доклинических испытаний. Изучение фармакокинетики и фармакодинамики лекарственных препаратов позволяют проанализировать процессы всасывания, метаболизма, распределения и выведения исследуемых лекарственных веществ. Анализ процессов распределения позволяет детектировать органы и ткани, в которые они проникают наиболее интенсивно и/или в которых удерживаются наиболее длительно, что может способствовать более деталь-
ному изучению механизмов действия лекарственных веществ [1].
Работа посвящена исследованию фармакокинети-ческих свойств лекарственного препарата для регенеративной генной терапии повреждений поверхностных тканей человека различной этиологии (механические, химические, термические травмы, местные радиационные и электрические повреждения и т.п.).
Актуальность проекта связана с ростом травматизма, смертности и возрастающей инвалидизацией от травм в Российской Федерации в условиях неблагоприятной экологической обстановки, снижающей регенераторные способности организма человека [2].
В связи с этим неотъемлемым направлением решения данной проблемы является разработка новых медицинских технологий для лечения травматических повреждений. Одним из ключевых элементов системы медицинской помощи при травмах является стимуляция процессов регенерации. Процессы регенерации являются одним из важнейших механизмов поддержания гомеостаза организма, особенно при повреждениях различной этиологии. К ним можно отнести травмы механические, включая операционные, химические, термические, радиационные, ишемические и др. Регенерация повреждённых тканей зависит, в основном, от пролиферации в зоне поражения клеток различных типов и синтеза клетками как собственных элементов, так и компонентов межклеточного вещества.
Лечение ран с использованием данного препарата превосходит известные способы лечения ран, основанные на стимуляции регенераторных процессов. Лечение заболеваний, требующих стимуляции регенераторных процессов, включая повреждения тканей человека различной этиологии, с помощью фармацевтической композиции или препарата для генной терапии на основе синтетического модифицированного гена инсу-линоподобного фактора роста человека первого типа является эффективным и обладает существенным преимуществом, так как позволяет снизить дозы инъекционных препаратов и частоту их введения [3].
Целью данного исследования явилось изучение распределения в организме и тканевой биодоступности нового лекарственного препарата на основе плазмидной ДНК pCIGF для регенеративной генной терапии повреждений поверхностных тканей человека различной этиологии. Доклиническое исследование фармакологических свойств и лекарственной безопасности препарата проведено на мышах, которым препарат вводился однократно и двукратно. Введение жидкой и лиофили-зованной форм препарата проводили внутримышечно, гелевая форма применялась наружно. Анализировали различные органы: мозг, сердце, кровь (лейкоцитарную массу и сыворотку), лёгкое, печень, почку, селезёнку, мышцу (место укола) на наличие в них плазмиды в зависимости от времени после введения.
Материалы и методы
Получение плазмидной ДНК pCIGF и исследование фармакокинетических свойств трёх лекарственных форм препарата осуществлялось в несколько этапов:
1. Наработка очищенного препарата плазмидной ДНК
Музейная культура штамма Escherichia coli/pCIGF представляет собой ночную бульонную культуру, полученную трансформацией штамма E.colli DH10B/R (GIBCO, США) рекомбинантной плазмидной ДНК pCIGF и выращенную из отдельной колонии на среде Луриа-Бертани (LB) с добавлением ампициллина до конечной концентрации 100 мкг/мл. Культивирование
вели при температуре 37°С, частоте вращения мешалки от 50 до 250 об/мин, обеспечивающей насыщение культуры кислородом не менее 30%, до достижения оптической плотности 20-40 ед, после чего осуществляли сепарирование биомассы, которая и являлась биологической субстанцией для выделения препарата pCIGF.
Очистку препаратов плазмидной ДНК проводили по методу, предложенному Horn с соавторами [4]. Затем применяли только реактивы фармакопейной чистоты (pharmaceutical), и свободную от ЛПС деионизирован-ную воду, проводили работу в стерильных условиях. ДНК растворяли в буфере для хроматографии, которая проводилась на оборудовании AKTAexplorer (Amersh-am Pharmacia Biotech, Sweden) при скорости протока жидкости 0,75 мл/мин. Фракции, содержащие не менее 50% суперскрученной формы плазмидной ДНК, объединяли. ДНК осаждали этанолом и повторно наносили на колонку SR 50/100 (Amersham Phаrmacia Biotech, Sweden), наполненную Sephacryl S-1000. Объединяли фракции, содержащие не меньше 90% суперс-крученной формы плазмиды. ДНК осаждали этанолом и ресуспендировали в физиологическом растворе хлорида натрия.
Для оценки препарата pCIGF использовали анализ изменения оптической плотности (А) в диапазоне длин волн 200-300 нм. Для этого проводили серию измерений оптических плотностей с шагом 10 нм. Далее строили график зависимости оптической плотности от длины волны. При этом соотношения А260нм/А280нм и А260нм/А230нм характеризовали чистоту плазмидной ДНК и, соответственно, были не меньше 1,8—1,75.
Для определения концентрации плазмидной ДНК в препарате использовали спектрофотометрический метод. Для этого проводили измерение оптической плотности исследуемого образца в стандартной кювете из кварцевого стекла шириной 1 см на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, Россия) при длине волны 260 нм. Концентрацию плазмидной ДНК определяли по формуле:
[ДНК] = А260 х N х 50 [мкг/мл],
где А26д — оптическая плотность исследуемого образца при длине волны 260 нм;
N — разведение исходного образца.
Конечная концентрация плазмидной ДНК в препарате должна составлять 1 мг/мл. Контроль структуры плазмидной ДНК оценивали при помощи электрофореза. При этом содержание суперскрученной формы плазмиды было не менее 95% в препарате, а присутствие РНК не детектировалось. Контроль идентичности целевого гена проводили секвениро-ванием. Всего было получено 10 мг плазмидной ДНК pCIGF. Концентрированный препарат pCIGF хранили при 40С в защищённом от света месте. Полученная партия плазмиды использовалась для изготовления
инъекционной, лиофильно высушенной и гелевой форм препарата. Для длительного хранения было заложено при температурах -20°, +4°, +20°, +37° по одной серии каждой лекарственной формы.
2. Изучение фармакокинетики гелевой лекарственной формы препарата
Было изучено распределение плазмидной ДНК pCIGF в организме мыши при наружном применении (в случае с гелевой формой препарата) и при однократном и двукратном введении. Введение жидкой и лиофилизованной (разведена физиологическим раствором) форм препарата проводили внутримышечно (100мкг/100мкл плазмиды в физиологическом растворе на мышь). Анализировали различные органы: кожу, мозг, сердце, кровь (лейкоцитарную массу и сыворотку), лёгкое, печень, почку, селезёнку, мышцу на наличие в них плазмиды в зависимости от времени после введения. Тотальную ДНК выделяли обработкой ткани протеиназой К и депротеинизацией фенолом/хлороформом. Наличие плазмидной ДНК тестировали ПЦР с последующим электрофорезом результатов ОТ и ПЦР в 1% агарозном геле.
Результаты
3. Изучение фармакокинетики гелевой лекарственной формы препарата
Было изучено распределение плазмидной ДНК pCIGF в организме мыши при наружном применении. Анализировали различные органы: кожу, мозг, сердце, кровь (лейкоцитарную массу и сыворотку), лёгкое, печень, почку, селезёнку, мышцу на наличие в них плазмиды в зависимости от времени после введения.
Сводные данные по фармакокинетике препарата плазмиды pCIGF в форме геля (примерное содержание в анализируемых образцах) представлены в табл. 1.
Как видно из представленных результатов, плаз-мида pCIGF сразу после нанесения на кожу присутствует в мышце. Наибольшее количество плазмидной ДНК наблюдается в мышце сразу после нанесения
геля, затем это количество постепенно уменьшается. В крови (клетки) сигнал появляется через 6 ч после нанесения препарата и увеличивается через сутки, держится в течение 7 суток, затем уменьшается. В крови (сыворотка) слабый сигнал детектируется через 7 суток после введения. В сердце небольшое количество плазмиды обнаруживается через 6 ч после нанесения гелевой формы препарата и сохраняется ещё в течение 2 суток. В лёгких плазмида детектируется через 6 ч после нанесения препарата и сохраняется в течение суток. В почках небольшое количество плаз-мидной ДНК обнаруживается через 6 ч после нанесения препарата и немного увеличивается через сутки, держится до 2 суток.
В мозге, селезёнке, печени и хвосте плазмида не детектируется. Через 8 недель количество плазмиды во всех органах мыши становится ниже уровня детекции.
Исследование фармакокинетики препарата в жидкой форме и в лиофилизированной форме
Было изучено распределение плазмидной ДНК pCIGF в организме мыши, при однократном и двукратном введении. Введение жидкой и лиофили-зованной (разведена физиологическим раствором) форм препарата проводили внутримышечно (100мкг/ 100мкл плазмиды в физиологическом растворе на мышь). Анализировали различные органы: мозг, сердце, кровь (лейкоцитарную массу и сыворотку), лёгкое, печень, почку, селезёнку, мышцу (место укола) на наличие в них плазмиды в зависимости от времени после введения.
Электрофореграммы ПЦР-анализа образцов ДНК на наличие в них примеси плазмиды представлены на рис. 1.
Каждая реакция включала в себя отрицательный контроль — отсутствие ДНК (чаще всего вода) и положительный контроль, представляющий собой известные разведения плазмидной ДНК в 1 мкг геномной ДНК контрольной мыши. Сводные данные примерного количества плазмиды pCIGF в анализируемых образцах представлены в табл. 2 и 3.
Таблица 1
Приблизительная оценка количества плазмидной ДНК pCIGF в различных органах после введения гелевой формы препарата
Исследуемые органы Количество плазмидной ДНК (пг/мкг геномной)
0 часов 6 часов 1 сутки 2 суток 7 суток 8 нед.
Мышца >10 >10 10 1 0,1
Кровь (клетки) - 0,1 0,2 1 0,1 -
Кровь (сыворотка) - - - - 0,1 -
Мозг - - - - - -
Селезёнка - - - - - -
Сердце - 0,01 - 0,001 -
Лёгкое - 0,001 0,02 - - -
Печень - - - - - -
Почка - 0,001 0,02 0,001 - -
Хвост - - - - - -
а с^п! ?
Рис. 1. Присутствие плазмидной ДНК рС^ в различных структурах и органах мыши. 1 — мышцы, 2 — сыворотка и клетки крови, 3 — мозг, В — селезёнка, 5 — сердце, 6 — лёгкое, 7 — печень, В — почки
Типы веществ в пробе на электрофореграмме: 1 — Маркер 1 тпн; 2 — контроль (вода); 3 — рС^ 10фг; 4—рС^ 100фг; 5 — рС^ 1пг; 6—рС^ 10пг.
Приблизительная оценка количества плазмидной ДНК pCIGF различных органах после введения жидкой и разведённой лиофилизованной форм препарата
Таблица 2
Исследуемые органы Количество плазмидной ДНК (пг/мкг геномной)
0 часов 6 часов 1 сутки 2 суток 7 суток 8 нед.
Мышца >100 >100 10 1 -
Кровь (клетки) 5 - - 3 0,5 -
Кровь (сыворотка) - - - - 0,4 -
Мозг >10 10 - 0,1 0,05 -
Селезёнка 0,1 0,001 0,1 0,005 0,09 -
Сердце 0,05 0,02 - 0,001 0,01
Лёгкое 0,01 0,001 0,02 - - -
Печень - 0,01 0,1 0,01 0,001 -
Почка 0,1 0,001 0,02 0,001 - -
Хвост - - - - - -
Таблица 3
Приблизительная оценка количества плазмидной ДНК pCIGF в различных органах при повторном введении жидкой и лиофилизованной форм препарата
Количество плазмидной ДНК (пг/мкг геномной) Количество плазмидной ДНК (пг/мкг геномной)
Исследуемые органы при повторном введении при разовом введении
1 сутки 7 суток 1 сутки 7 суток
Мышца 10 5 10 -
Кровь (клетки) 10 1 3 0,5
Кровь (сыворотка) - 1 - 0,4
Мозг >10 - 0,1 0,05
Селезёнка 1 0,2 1 0,1
Печень 10 1 0,1 0,1
Как видно из представленных результатов, плазми-да pCIGF сразу после инъекции присутствует во всех анализированных органах, кроме печени и хвоста. Также плазмида не идентифицируется сразу после введения в клетках крови. Наибольшее количество плазмидной ДНК наблюдается в мышце сразу после инъекции, через 6 ч это количество немного уменьшается, на седьмые сутки становится ниже предела чувствительности метода. В лёгком сигнал пропадает на вторые сутки, в почке — на седьмые. В сыворотке крови слабый сигнал появляется на седьмые сутки после введения. В мозге, селезёнке и печени наличие плазмиды наблюдается в течение недели. Через 8 недель количество плазмиды в органах становится ниже уровня детекции.
По данным, представленным в табл. 3, видно, что в случае повторного введения жидкой и лиофилизован-ной форм препарата количество ДНК pCIGF в первые сутки превышает (кровь [клетки], мозг, печень) количество ДНК при разовом введении или сравнимо с ним (мышцы, селезёнка, кровь [сыворотка]). Однако через 7 суток после повторного введения препарата во всех органах, кроме мозга, наблюдается большее количество плазмидной ДНК, чем при разовом введении.
Обсуждение
Фармакокинетика исследуемого препарата отличается при использовании разных лекарственных форм. Так, например, при нанесении гелевой ДНК pCIGF обнаруживается сразу после нанесения на кожу в мышце, где и локализуется максимальное количество
нанесённого вещества. В клетках крови ДНК pCIGF детектируется через 6 ч после нанесения препарата и увеличивается через сутки, держится в течение 7 суток, затем уменьшается, тогда как в сыворотке слабый сигнал детектируется только спустя 7 суток после введения. В целом лишь в некоторых органах с обильным кровоснабжением детектируется небольшое количество плазмиды (сердце, легкие, почки), которое сохраняется в среднем не дольше 2-х суток. В мозге, селезёнке, печени и хвосте плазмида не детектируется. Через 8 недель количество плазмиды во всех органах мыши становится ниже уровня детекции.
Фармакокинетика жидкой и лиофилизованной форм препарата такова, что ДНК pCIGF сразу после инъекции присутствует во всех анализированных органах, кроме печени и хвоста, однако наибольшее количество плазмидной ДНК также наблюдается в основном в мышце. Стоит отметить, что в мозге, селезёнке и печени наличие плазмиды наблюдается в течение недели. Через 8 недель количество плазмиды в органах становится ниже уровня детекции.
Таким образом, можно заключить, что использование гелевой лекарственной формы препарата является более эффективным, так как оказывает в основном локальное действие на прилегающие к раневой поверхности клетки соединительной ткани. Однако, применение разведённого лиофилизированного препарата в виде инъекций имеет преимущество в том, что препарат может храниться более длительное время, сохраняя при этом стабильность структуры ДНК pCIGF и биологическую активность.
Литература
1. Каркищенко Н.Н., Хоронько В.В., Сергеева С.А., Каркищенко В.Н. Фармакокинетика. Феникс, Ростов-на-Дону. 2001.
2. Демографическая политика Российской Федерации на период до 2025 года. // Программа Министерства труда и социальной защиты РФ от 13.11.2012г. (информация взята с сайта Министерства труда и социальной защиты РФ http://www.rosmintrud.ru/ministry/ programms/6).
3. Bonadio J., Smiley E., Patil P., Goldstein S. Localized, direct plasmid gene delivery in vivo: prolonged therapy results in reproducible tissue regeneration. // Nature Medicine 1999. Vol. 5. P. 753—759.
4. Horn N., Meek J., Budahazi G.., Marquet M. Cancer gene therapy using plasmid DNA: purification of DNA for human clinical trials. // Hum Gene Therapy. 1995. Vol. 6. P. 565—573.
