CC BY
96
2013
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Сер. 11
Вып. 3
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА
УДК 579.252.5+57.017.35
И. В. Духовлинов, Р. И. Аль-Шехадат, Е. А. Федорова, К. З. Шаинидзе, А. И. Орлов
ОЦЕНКА РЕГЕНЕРАЦИИ ТКАНЕЙ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕННО-ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА, СОДЕРЖАЩЕГО ПЛАЗМИДУ PCIGF, НА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ РАН РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА У МЫШЕЙ И КРЫС
Известно, что регенерационная способность поверхностных слоев кожи служит важнейшим механизмом поддержания процессов восстановления организмом утраченных или поврежденных структур, поддерживая строение и функции организма, его целостность [1]. Создание препаратов, ускоряющих заживление ран различного происхождения, в том числе и послеоперационных, является одной из приоритетных задач современной медицины. Разработанный препарат является эффективным для ускорения процессов регенерации и заживления ран различной этиологии и относится к группе генно-терапевтических лекарственных средств, где в качестве основы используется введение в область раны субстанции, содержащей различные векторы, несущие гены факторов роста и соответствующие регуляторные элементы. Данный подход является перспективным и в сравнении с традиционным применением рекомбинантных белков имеет целый ряд значительных преимуществ:
• при применении генной терапии не требуются частые инъекции препарата, поскольку экспрессия целевых генов в организме пациента может продол-
Духовлинов Илья В. — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела Общей патологии и патофизиологии (группа генной инженерии), Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН; e-mail: [email protected]
Аль-Шехадат Руслан И. — кандидат биологических наук, научный сотрудник отдела Общей патологии и патофизиологии (группа генной инженерии), Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН; e-mail: [email protected]
Федорова Екатерина А. — научный сотрудник отдела Общей патологии и патофизиологии (группа генной инженерии), Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН; e-mail: [email protected]
Шаинидзе Кристина З. — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела Общей патологии и патофизиологии, Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН; e-mail: [email protected]
Орлов Антон И. — доктор химических наук, зам. директора по инновационной деятельности, Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН; e-mail: anton.orlov@ mail.ru
© И. В. Духовлинов, Р. И. Аль-Шехадат, Е. А. Федорова, К. З. Шаинидзе, А. И. Орлов, 2013
жаться, в зависимости от типа используемой конструкции и целей терапии, от нескольких дней до многих лет и даже пожизненно;
• уровни образующегося в организме целевого белка более постоянны, не наблюдается значительных колебаний;
• образующиеся с помощью векторов в клетках пациента человеческие белки совершенно не отличаются от природных, поскольку проходят все этапы естественных посттрансляционных изменений;
• очистка препаратов для генной терапии в целом проще и легче может быть стандартизирована;
• не требуется рефолдинг терапевтических конструкций в отличие от рекомби-нантных белков, вырабатываемых продуцентами.
Для генной терапии используется целый ряд векторов, прежде всего вирусных. Однако последние имеют целый ряд недостатков, таких как возникающий иммунный ответ на вирусный вектор (например, аденовирусный), риск опухолевой трансформации (ретровирусные векторы) и др. В этом смысле наиболее безопасными векторами являются плазмиды. Было показано, что при внутримышечной инъекции обычной, «голой» плазмидной ДНК она встречает диффузионный тканевой барьер и трансформирует лишь клетки, находящиеся около места инъекции [2, 3]. Безусловно, величина этого диффузионного барьера зависит от состояния тканей и межклеточного матрикса, однако дальше места инъекции, по всему организму, значительного распространения не происходит [4-7].
Таким образом, молекула ДНК, включенная в состав биосовместимой матрицы и несущая какой-либо генный продукт, может быть доставлена в репаративные клетки преимущественно в области раны. В числе таких генов рассматриваются, в том числе, различные ростовые факторы, включая инсулиноподобный фактор роста.
Эффективность препарата определяется его способностью экспрессировать инсулиноподобный фактор роста человека (IGF-1), который стимулирует пролиферацию [8-11] и активную регенерацию клеток и тканей организма [11]. Помимо локального действия и безопасности применения подобной терапии [12], ее преимущество заключается также в снижении доз инъекционных препаратов и частоты их введения [12].
Целью настоящей работы явилось изучение регенерационных свойств этого препарата в двух основных лекарственных формах (разведенный лиофилизат в виде инъекций и гелевая форма, применяемая наружно). Анализ биологической активности и эффективности применения обеих лекарственных форм будет проводиться на различных экспериментальных моделях повреждения поверхностных тканей у мышей и крыс.
Материал и методы
1. Оценка регенерации тканей с использованием гелевой и лиофилизованной форм препарата на модели резаных ран. 1.1. Экспериментальные животные. В работе были использованы самки беспатогенных мышей линии BALB/c весом 20-22 г (НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН), которых содержали в ус-
ловиях SPF-вивария, при 12-часовом цикле день/ночь. Эти животные получали стерильное питание и воду ad libitum. Каждая группа включала 5 животных.
1.2. Резаная рана. Резаная рана — наносимая острым предметом (нож, бритва, стекло) [13]. При воздействии на ткани усилие сосредоточивается на узкой площади, на которой развивается высокое давление, легко разделяющее ткани в направлении действия ранящего предмета. Окружающие ткани при этом повреждаются незначительно. Однако при относительно небольшом механическом усилии ранящее орудие продвигается на значительную глубину и легко повреждаются глубоко расположенные ткани. При резаных ранах болевой синдром выражен умеренно, кровотечение значительное, а зияние зависит от взаимоотношения оси раны и лангеровских линий. Резаные раны опасны повреждением сосудов, нервов, полых органов.
1.3. Нанесение резаных ран. Анестезию мышей проводили с использованием трибромэтанола. После анестезии кожа экспериментальных животных подготавливалась — удалялся волосяной покров. Резаные раны наносились с помощью хирургического скальпеля на глубину 2 мм, захватывая подлежащую мышечную ткань, в области нижней части спины. Все операции проводились в асептических условиях, раны после нанесения обрабатывались спиртом.
1.4. Введение плазмидной ДНК. Сразу после нанесения ран животным наносили гелевую форму препарата плазмиды: наносили гель один раз в день на раневую поверхность в течение 6 дней; либо вводили раствор плазмидной ДНК: лиофилизо-ванную форму препарата разводили в воде, наносили 5 микроуколов инсулиновым шприцом вокруг раны 1 раз в 3 дня, в течение 9 дней. В качестве контроля выступала группа мышей, которым не была введена плазмидная ДНК, но были нанесены раны. Забой животных проводили 24 ч, 72 ч или 7 дней после введения плазмидной ДНК. Асептически забирали часть кожи с раной. Гомогенизировали ткань многократным пропусканием через иглу шприца (d = 1,2 мм). Действие препарата pCIGF также анализировали с использованием иммуногистохимии.
1.5. Оценка экспрессии гена в составе плазмиды pCIGF. Оценку экспрессии синтетического гена с плазмиды pCIGF проводили на первые, третьи и седьмые сутки после переноса мышам плазмиды методом RealTime PCR (RT-PCR). Образцы тканей получали, как описано выше, и использовали для выделения РНК. В качестве отрицательного контроля использовали мышей, не обработанных плазмидой. Выделение РНК из тканей осуществляли с использованием набора «TRI Reagent» производства фирмы «Sigma» (США) по инструкции изготовителя. На 100 мг клеток использовали 2 мл лизирующего раствора «TRI Reagent». Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически. Выделенная РНК была обработана ДНКазой 1. Отсутствие контаминации выделенной РНК плазмидой проверялось методом PCR с использованием праймеров к гену в составе плазмиды pCIGF. Синтез кДНК проводили с помощью набора Revert Aid® First Strand cDNA Synthesis Kit (производства фирмы «Fermentas», Литва). Для измерения относительного содержания мРНК применяли метод RealTime PCR с использованием SYBR GREEN (SYBR Green Supermix («Bio-Rad», США)). Все образцы нормировались по уровню экспрессии гена «домашнего хозяйства» b-актина. Реакцию проводили с использованием термоциклера IQ5 («Bio-Rad», США), предварительный анализ данных осуществляли с использованием прилагающегося программного обеспечения. Эффективность амплификации определяли по внешней стандартной кривой с использованием серии разведе-
ний образца 5 нг, 10 нг, 30 нг, 50 нг. Рассчитанная эффективность амплификации для используемых праймеров составила 0,98 усл. ед. В качестве отрицательного контроля использовалась реакция без добавления ДНК. Нормализацию данных проводили по количеству ткани, концентрации РНК и кДНК. Расчеты проводили методом ACt, по формуле R = (1+E)ACt, где Ct — пороговый цикл, ACt = Ct(Mod)norm — Ct(Nat) norm, Е — эффективность амплификации, R — увеличение количества продукта ПЦР после n циклов.
1.6. Оценка изменения размера раны на теле экспериментальных животных. Измерение площади раны на теле экспериментальных животных осуществлялось с помощью фотографирования пораженного участка. Анализ фотографического материала выполнялся с помощью системы компьютерного анализа изображений ImageTool for Windows (version 2,0, USA) согласно основным принципам стереоло-гии в морфометрии.
1.7. Гистологическое исследование биоптатов. Образцы тканей были получены, как описано выше, фиксировались четверо суток в 4% формалине, приготовленном на PBS, после чего проводились по спиртам возрастающей концентрации и ксилолу. Далее образцы заключались в коммерческий парафин Histomix. После заливки в среду Histomix были получены срезы толщиной 6 мкм. Для последующей работы использовались предметные стекла Superfrost. Парафиновые срезы далее проводились через ксилол и серию спиртов убывающей концентрации, после чего окрашивались красителями гематоксилин-эозин по стандартной методике. Полученные препараты изучались и фотографировались на микроскопе Leica. Митотиче-ский индекс для каждого животного определяли по препаратам раны, окрашенным гематоксилин-эозином (см. выше) в 10 визуальных полях зрения по трем срезам раны с общим содержанием не менее 1000 ядер.
1.8. Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета Statistica, Release 5.0 производства компании StatSoft Inc, а также программы Microsoft Office Excel 2003 (Microsoft Corporation). Различия считались достоверными при р < 0,05 в парном тесте Стьюдента с неравными отклонениями.
2. Регенерация тканей с помощью плазмидной ДНК в модели операционных ран. 2.1. Экспериментальные животные. В опыте было использовано 20 белых крыс линии «Вистар», поступивших из НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН. Животных содержали в условиях SPF-вивария, при 12-часовом цикле день/ ночь. Эти животные получали стерильное питание и воду ad libitum. Крыс разделили по принципу аналогов на две группы: 1 — опытная группа — на боковой поверхности брюха наносились чистые операционные раны; 2 — контрольная группа — на боковой поверхности брюха наносились чистые операционные раны. Каждая группа включала 5 животных.
2.2. Операционная рана. По происхождению все раны подразделяются на операционные и случайные. Операционные раны наносятся умышленно, с лечебной или диагностической целью, в особых асептических условиях, с минимальной трав-матизацией тканей, при обезболивании, с тщательным гемостазом и, как правило, с сопоставлением и соединением швами рассеченных анатомических структур. При операционных ранах отсутствует боль, к минимуму сведена возможность кровоте-
чения, а зияние обычно устраняется в конце операции наложением швов, т. е. основные признаки раны искусственно устраняются.
2.3. Нанесение операционных ран. Раневые повреждения кожного покрова наносились под общим ингаляционным наркозом парами эфира. Оперативное вмешательство проводили в правом боковом положении. Местное обезболивание места разреза проводили подкожным введением 2% раствора новокаина. Подготовка операционного поля заключалась в удалении шерстяного покрова и обработке кожи 70% раствором этилового спирта. При нанесении чистой операционной раны скальпелем производили рассечение кожных покровов до подкожной клетчатки. В качестве шовного материала использовали шелк хирургический № 4 — в зависимости от длины разреза одной крысе накладывали один или два шва. Во время проведения опыта все животные чувствовали себя хорошо, ни в опытных, ни в контрольных группах послеоперационных осложнений не наблюдалось.
2.4. Введение плазмидной ДНК (см. п. 1.4).
2.5. Оценка изменения размера раны на теле экспериментальных животных (см. п. 1.6). Измерение площади раны на теле экспериментальных животных осуществлялось с помощью целлофанограммы поверхности ран. Такая фиксация площади поражения осуществлялась на 5-й, 10-й и 15-й день опыта.
2.6. Гистологическое исследование биоптатов. На 5-й, 10-й и 15-й день опыта производили взятие образцов раневой ткани для проведения гистологических исследований регенеративных процессов (см. п. 1.7).
2.7. Статистическая обработка результатов (см. п. 1.8).
3. Результаты и обсуждение. 3.1. Анализ экспрессии гена с плазмиды pCIGF. Анализ экспрессии гена в составе плазмиды pCIGF, обеспечивающего регенерацию тканей, показал наличие экспрессии в регенерирующих тканях с первого дня (образование раны и введение препарата) до заживления ран, при внесении в организм препарата плазмиды в гелевой и в разведенной лиофилизованной форме (рис. 1). Препарат плазмиды в форме разведенного лиофилизата, инъецированного вокруг раны, обеспечивает немного больший уровень экспрессии целевого гена с плазмиды рСЮД чем таковой в форме геля. Однако гелевая форма препарата также обеспечивает высокий уровень экспрессии белка, ответственного за регенерацию тканей. Более того, последний вариант является менее болезненным и менее инвазивным.
3.2. Оценка скорости регенерации тканей у мышей в модели резаных ран (оценка изменения размера ран). Оценку скорости регенерации тканей у мышей проводили, измеряя площади ран на 7, 10, 14 и 21 сутки после начала эксперимента. Результаты суммированы в таблице 1.
Таблица 1. Оценка скорости регенерации тканей у мышей в модели резаных ран при применении
двух лекарственных форм препарата
Применяемое вещество 1 день 7 день 10 день 14 день 21 день
рСЮБ разведенный лиофилизат 60±13,5 28,5±6 12±3 0 0
рСЮБ гель 61±12 25±7,5 10±4,5 1±0,5 0
Контроль 62±13,5 46,5±8 28,5±6 10,5±4,5 0
Y
s J
а о x
X
pCIGF гель
В — pCIGF разведенный в воде лиофилизат
Рис. 1. Анализ экспрессии синтетического гена с плазмиды pCIGF методом RealTime PCR после переноса в поверхностные ткани мышей вектора экспрессии pCIGF.
По оси абсцисс (X) — точки снятия данных, по оси ординат (Y) — значения циклов выхода кривой реакции на плато.
Перенос в поверхностные ткани с помощью инъекций свободной ДНК (светлые столбцы), с помощью нанесения гелевой формы препарата данной плазмиды (темные столбцы). Точка снятия данных 1 соответствует 3 суткам после введения препаратов, точка 2 — 5 суткам, точка 3 — 7 суткам. На графике приведены данные значения циклов выхода кривой реакции на плато. Приведены средние значения трех независимых экспериментов. Планки погрешности соответствуют стандартной ошибке среднего.
3
1
2
В таблице приведены средние значения площади раны (в мм2) в экспериментальных и контрольных группах мышей: pCIGF разведенный лиофилизат — мыши, инъецированные вектором pCIGF; pCIGF гель — мыши, которым наносили плазми-ду в составе геля; контроль — мыши, которым не вводили рСГСЕ
На рисунке 2 приведены фотографии мышей, инъецированных плазмидой pCIGF, на 14-е сутки после начала эксперимента. Инъекции разведенного лиофили-зата препарата pCIGF и нанесение гелевой формы препарата плазмиды приводили к существенному ускорению процесса заживления раны по сравнению с контрольными группами. Через 14 суток после начала эксперимента у мышей, инъецированных pCIGF, происходило полное заживление раны, тогда как в контрольных группах площадь раны составляла около 10 мм2 (~17% от исходного размера) (рис. 2, табл. 1). а 6
Рис. 2. Состояние резаной раны на 14-й день после начала эксперимента у мышей, инъецированных плазмидой pCIGF (а) и не инъецированных данной плазмидой (б). У мышей, инъецированных плазмидой, наблюдается полное заживление раны.
3.3. Гистологическая оценка регенерации тканей у мышей в модели резаных ран. На 8-е сутки после начала эксперимента проводили гистологическое исследование биоптатов ран. Установлено, что у мышей, инъецированных плазмидой, грануляционная ткань выражена гораздо сильнее (более толстый слой, большее количество сосудов), по сравнению с контрольной группой животных. Кроме того, у мышей, инъецированных плазмидой, более развит слой эпидермиса на границе раны (рис. 3). Параллельно проводили оценку митотического индекса фибробластов в области раны. Установлено, что перенос мышам pCIGF приводит к возрастанию числа пролифери-рующих фибробластов в 2,6 раза (митотический индекс 1,6%) по сравнению с контрольной группой животных (митотический индекс 0,6%). Аналогичные результаты получены и при исследовании действия гелевой формы препарата плазмиды рСЮЕ
а ■■. б
Рис. 3. Препарат (парафиновый срез 6 мкм, окраска гематоксилин-эозином, увеличение х40) раны поверхностных тканей мыши, обработанной плазмидой рСЮБ (а) и не обработанной данной плазмидой (б).
Биоптаты получены на 10-е сутки после начала эксперимента. Черные стрелки указывают на сосуды, пунктирная стрелка указывает на участок неповрежденного эпидермиса, точечная — на участок раны.
3.4. Оценка скорости регенерации тканей у крыс в модели операционных ран (оценка изменения размера ран). Оценку скорости регенерации тканей у крыс проводили, измеряя площади ран на 5-е, 10-е, 15-е сутки после начала эксперимента. Результаты суммированы в таблице 2.
Таблица 2. Оценка скорости регенерации тканей у крыс в модели операционных ран при применении препарата в виде разведенного лиофилизата и геля
Время после введения pCIGF разведенный лиофилизат pCIGF гель Контрольная группа
Начало опыта 177,2 мм2 177,0 мм2 122 мм2
5 дней (площадь / % заживления) 36 мм2/79,7% 39,6 мм2/87% 37,7 мм2/69,1%
10 дней (площадь / % заживления) 7,6 мм2/95,8% 8,4 мм2/100% 6 мм2/95,1%
В первой опытной группе на 5-й день опыта у 80% животных отпал первичный струп (при 40% в контроле), что указывает на более интенсивные регенерацион-ные процессы, чем в контрольной группе. Площадь раневой поверхности в опытной группе в случае использования разведенного лиофилизата плазмиды составила 36 мм2, в случае использования гелевой формы плазмиды — 39,6 мм2, в контроле — 37,7 мм2, процент регенерации в первом случае составил 79,7%, во втором — 87%, что на 10,6% и на 17,9% больше, чем в контроле (табл. 2).
На 10-й день опыта площадь раневой поверхности у животных опытной группы в случае использования разведенного лиофилизата плазмиды составила 7,6 мм2, в случае использования гелевой формы препарата плазмиды — 8,4 мм2, в контрольной — 6 мм2, регенерация в первой группе составила 95,8%, во второй — 100%, что на 0,7% и 4,9% выше аналогичного показателя в контроле. Инъекции разведенного лиофилизата препарата pCIGF и нанесение гелевой формы препарата плазмиды приводили к существенному ускорению процесса заживления операционной раны по сравнению с контрольными группами. Через 10 суток после начала эксперимента у крыс, инъецированных pCIGF, происходило практически полное заживление раны, у крыс, которым плазмидная ДНК наносилась в форме геля, происходило полное заживление, а в контрольных группах площадь раны составляла около 6 мм2 (~5% от исходного размера) (табл. 2).
3.5. Гистологическая оценка регенерации тканей у крыс в модели операционных ран. На 5-е сутки после начала эксперимента проводили гистологическое исследование биоптатов ран. В опытной группе (после введения препарата плазмиды и в геле-вой форме, и в растворенной форме лиофилизата) на 5-й день опыта в гистологическом срезе операционной раны не отмечается гнойных телец и полиморфноядерных гранулоцитов, полностью исчезли признаки отека и активной сосудистой гиперемии, что присутствует в гистологических срезах животных контрольной группы. Данный факт указывает на снижение выраженности остаточных явлений воспалительного процесса у животных опытной группы и на положительную динамику регенеративного процесса.
Таким образом, структурные различия между опытной и контрольной группами затрагивают зону подкожной клетчатки и выражаются в несколько более раннем прекращении воспалительного процесса у животных опытной группы.
В проведенных опытах показано, что изготовленный препарат pCIGF в лиофи-лизованной и гелевой формах обладает высоким регенерационным потенциалом и стабильной биологической активностью: обеспечивается постоянная экспрессия целевого белка в клетках млекопитающих, локализованных в непосредственной близости к ране.
Показано, что данные лекарственные формы препарата обеспечивают регенерацию поврежденных тканей с примерно одинаковой эффективностью, по одному механизму, различается лишь скорость регенерации. В случае резаных ран ткань регенерирует быстрее при инъекционном введении разведенной лиофилизованной формы препарата плазмиды. В случае операционных ран регенерация идет быстрее при использовании гелевой формы препарата.
Таким образом, обе изготовленные лекарственные формы препарата (лиофили-зат, гель) обеспечивают регенерацию тканей и показаны к использованию при лечении (для заживления) различных ран.
Литература
1. Нузов Б. Г. Стимуляция репаративной регенерации тканей. 2005. 165 с.
2. Shimamura M., Morishita R. Naked plasmid DNA for gene therapy // Curr. Gene. Ther. 2011. Dec. Vol. 11 (6). P. 433.
3. Herweijer H., Wolff J. A. Progress and prospects: naked DNA gene transfer and therapy // Gene Ther. 2003. Mar. Vol. 10 (6). P. 453-458.
4. Jiao S., Acsadi G., Jani A. et al. Persistence of plasmid DNA and expression in rat brain cells in vivo // Exp. Neurol. 1992. Vol. 115. P. 400-413.
5. Jiao S., Schultz E., Wolff J. A. Intracerebral transplants of primary muscle cells: a potential "platform" for transgene expression in the brain // Brain Res. 1992. Vol. 575. P. 143-147.
6. Jiao S., Williams P., Berg R. K. et al. Direct gene transfer into non-human primate myofibers in vivo // Human Gene Therapy. 1992. Vol. 3. P. 21-33.
7. Davis H. L., Demeneix B. A., Quantin B. et al. Plasmid DNA is superior to viral vectors for direct gene transfer into adult mouse skeletal muscle // Hum. Gen. Ther. 1993. Vol. 4. P. 733-740.
8. Valentinis B., Baserga R. IGF-I receptor signalling in transformation and differentiation // Mol. Pathol. 2001. Vol. 54. P. 133-137.
9. RadcliffK., Tang T. B., Lim J. et al. Insulin-like growth factor-I regulates proliferation and osteoblastic differentiation of calcifying vascular cells via extracellular signal-regulated protein kinase and phosphati-dylinositol 3-kinase pathways // Circ. Res. 2005. Vol. 96. P. 398-400.
10. Sadagurski M., Yakar Sh., Weingarten G. et al. Insulin-Like Growth Factor 1 Receptor Signaling Regulates Skin Development and Inhibits Skin Keratinocyte Differentiation // Mol. Cell. Biol. 2006. April. Vol. 26 (7). P. 2675-2687.
11. Kiepe D., Ciarmatori S., Hoeflich A. et al. Insulin-Like Growth Factor (IGF)-I Stimulates Cell Proliferation and Induces IGF Binding Protein (IGFBP)-3 and IGFBP-5 Gene Expression in Cultured Growth Plate Chondrocytes via Distinct Signaling Pathways // Endocrinology. July 1. 2005. Vol. 146, N 7. P. 3096-3104.
12. Патент № 2372941. Фармацевтическая композиция для генной терапии заболеваний, требующих стимуляции регенераторных процессов, включая повреждения тканей человека различной этиологии, на основе синтетического модифицированного гена инсулиноподобного фактора роста человека первого типа (ИФР-1, IGF-1) (срок действия от 02.07.2007).
13. Корж А. А. Справочник по травматологии и ортопедии / под ред. А. А. Коржа и Е. П. Межени-ной. Киев: Здоровье, 1980. 216 с.
Статья поступила в редакцию 21 мая 2013 г.
