CC BY
39
Сравнительное исследование фармакокинетики и биораспределения карбазольного соединения CBL0100 в составе различных топических лекарственных форм на морских свинках
Еремина Н.В.14, Казей В.И. Кравцова О.Ю.2, Скрабелинская Е.И.2, Пурмаль А.В.3,
Дурнев А.Д. 4
1 — Общество с ограниченной ответственностью «Панацела Лабс»
2 — Общество с ограниченной ответственностью «Лаборатория Биоскрининга»
3 — Кливленд БиоЛабс, Инк
4 — ФГБНУ«НИИ Фармакологии им. В.В. Закусова»
Резюме. Экспериментальный препарат CBL0100 разрабатывается в качестве противогрибкового средства для местного применения. Для оценки влияния состава лекарственной формы на трансдермальное всасывание было проведено сравнительное исследование его фармакокинетики и биораспределения после однократного нанесения на кожу морских свинок. В исследовании использовали две различные прописи CBL0100 (прототипы готовых лекарственных форм для топических аппликаций) — крема на эмульсионной (ЭМ) и полиэтиленгликолевой (ПЭГ) основах с содержанием активного вещества 1, 0,2 и 0,02% по массе. Концентрацию активного вещества в плазме крови и гомогенатах органов и тканей животных определяли методом ВЭЖХ-МС/ МС. В предварительном эксперименте по изучению распределения CBL0100 между плазмой и клеточными компонентами крови in vitro установлено, что исследуемое соединение преимущественно обнаруживается в клеточной фракции крови, что, судя по форме фармакокинетических кривых, влияет на скорость его элиминации из плазмы. Показано, что после однократного накожного нанесения крема CBL0100 проникает в системный кровоток и интенсивно распределяется в селезёнку, печень, почки и лёгкие морских свинок. В то же время его содержание в мышечной ткани и сердце незначительно; в мозг CBL0100 проникает умеренно. Установлено, что пропись на ЭМ основе обеспечивает повышенную по сравнению ПЭГ основой биодоступность CBL0100.
Ключевые слова: CBL0100, карбазольные соединения, фармакокинетика, биораспределение
Comparative study of the pharmacokinetics and biodistribution of various topical formulations of carbazole derivative CBL0100 in guinea pigs
Eremina N.V. 1 4, Kazey V.I. 1, Kravtsova O.Y. 2, Skrabelinskaya E.I. 2, Purmal A.V. 3, Durnev A.D. 4
1 — Panacela Labs LLC 2 — Bioscreening Laboratory Co. Ltd 3 — Cleveland BioLabs, Inc.
4 — FSBSI «Zakusov Institute of Pharmacology»
Abstract. An experimental drug CBL0100 is developed as an antifungal agent for topical application. In order to assess the effect of composition of the formulation on transdermal absorption, a comparative absorption study of its pharmacokinetics and biodistribution after a single topical application on the guinea pigs' skin. Two different formulations of CBL0100 (prototypes of final dosage forms for topical applications) — cream emulsion and polyethylene glycol vehicles with a content of active substance 1, 0,2 and 0,02% mass. in each of these formulations were used in the study. CBL0100 concentration in blood plasma and homogenates of organs and tissues of animals was analyzed by HPLC — MS/MS. During the preliminary blood-to-plasma partitioning in vitro experiment it was determined that CBL0100 is found mostly in the cell fraction of the blood, which, based upon the pharmacokinetic curves shape affects elimination from plasma. It was revealed that after a single topical application active compound enters the systemic circulation and intensively distributed into the spleen, liver, kidneys and lungs of guinea pigs. At the same time, its content in the muscular tissue and the heart is negligible; CBL0100 moderately penetrates into the brain. In general, it was shown that the emulsion composition provides improved bioavailability of CBL0100 compared to the polyethylene glycol composition.
Keywords: CBL0100, carbazole compounds, pharmacokinetics, biodistribution
Автор, ответственный за переписку:
Еремина Наталья Вахитовна — младший научный сотрудник ФГБНУ «НИИ Фармакологии им. В.В. Закусова»; адрес: г. Москва, 125315, ул. Балтийская, 8; e-mail: neremina@panacelalabs.com, тел. +7 (915) 224-52-87
Введение
Разработка новых противогрибковых препаратов является актуальной по причине роста заболеваемости различными микозами [1] и появлением резистентных штаммов патогенных грибков [2].
В исследованиях, проведенных ранее [3], была отобрана группа соединений карбазольного ряда, обладающих противогрибковой активностью in vitro, из которой был выбран лекарственный кандидат CBL0100, наиболее активный в отношении ряда патогенов (Mi-crosporum canis, Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans, Candida albicans). В ходе дальнейшей разработки препарата была подтверждена эффективность CBL0100 на in vivo модели [4].
Целью настоящего исследования являлось изучение фармакокинетики и биораспределения CBL0100 после его однократного нанесения на кожу морских свинок в виде различных формуляций и в разных дозах.
Методы исследования
Дизайн эксперимента
Эксперимент был проведён в соответствии с действующим Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств [5].
В работе были использованы образцы двух экспериментальных мягких лекарственных форм с активным веществом 6-(2-^^-диэтиламино) этил)-1,2,10,11-тетрагидро-6Н-бис(циклопента[с] карбазол)-3,9-диона гидрохлорид (CBL0100) в концентрациях 1%, 0,2% и 0,02% по массе, которые были разработаны и произведены компанией ЗАО «Рети-ноиды». Активная субстанция CBL0100 была наработана компанией АО «Фарм-Синтез».
На левом боку каждого животного (морские свинки — самцы, питомник «Андреевка» ФГБУ «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА России, масса 300-350 г, возраст 6-9 нед) выбривали шерсть на квадратном участке кожи площадью 5^5 см и осторожно скарифицировали острым скальпелем кожу для имитации пораженной грибком поверхности. Перед нанесением препарата животное обездвиживали путём фиксации в рестрейнере. Шпателем наносили по 1 г соответствующей композиции исследуемого препарата, затем аккуратно распределяли по поверхности скарифицированной кожи и слегка втирали, после чего во избежание слизывания препаратов животным надевали защитный воротничок и помещали в индивидуальные клетки, в которых они находились до окончания эксперимента.
Отбор проб крови в объёме 0,5 мл осуществляли из ретроорбитального синуса через 2, 6, 12 и 24 ч после нанесения препарата. Кровь отбирали в пробирки, содержащие 100 мкл 5% раствора К3ЭДТА, и центрифугировали 10 мин при 11 180 g для получения плазмы.
После взятия последних проб крови животных подвергали эвтаназии углекислым газом и производили отбор органов (сердце, селезёнка, печень, почки, лёгкие, головной мозг) и тканей (кожа и мышцы в месте нанесения препарата). Перед забором кожи её тщательно несколько раз протирали ватным тампоном, смоченным 70% этиловым спиртом, для предотвращения загрязнения проб остатками препарата.
Определение концентрации CBL0100 в крови и тканях морских свинок
и расчёт фармакокинетических параметров
Для определения фармакокинетических параметров препаратов была разработана и валидирована методика количественного определения CBL0100 в плазме крови и гомогенатах органов и тканей морских свинок на ВЭЖХ системе Agilent 1260 (США), совмещенной с трехквадрупольным масс-спектрометром API 3200 QTrap (Applied Biosystems / MDS SCIEX, США) [6, 7]. Масс-спектрометрическое определение проводили после ионизации в электроспрее (положительный режим) в режиме MRM (MRM-переход для CBL0100 375,3/100,2).
Приготовление растворов. Методом последовательных двукратных разведений стокового раствора CBL0100 с концентрацией 1 мг/мл готовили водные растворы субстанции с концентрациями от 100 000 до 48,8 нг/мл. Раствор с концентрацией 12 500 нг/мл использовали для приготовления спайка для создания стандарта пригодности системы, остальные растворы добавляли к интактному биоматериалу для приготовления калибровочных проб. Растворы с концентрациями 5 000 и 500 нг/мл использовали для приготовления спайков только на плазме, а также в качестве образцов контроля качества. Рабочий раствор внутреннего стандарта (IS, субстанция BAS27844359,
000 «ННТ», Россия) был приготовлен с концентрацией 100 нг/мл в ацетонитриле, содержащем 0,1% трифторуксусной кислоты (99%, Acros Organics).
Приготовление гомогенатов тканей и органов. Часть органа или мышцы массой 400—500 мг помещали в пробирку, добавляли 2-кратный по отношению к объёму пробы (предполагали, что 1 мг ткани имеет объём
1 мл) объём трис буфера (состав: 10 мМ трис (гидрок-симетил) аминометан гидрохлорид (Panreac) pH 7,4, 150 мМ NaCl (Panreac), 1% тритон X-100 (Panreac)) и гомогенизировали в течение 2 мин. Для приготовления гомогената кожи мелко нарезанные кусочки кожи гомогенизировали, затем образовавшуюся взвесь протирали пестиком через мелкое сито. Полученные гомогенаты хранили при -400С до анализа.
Приготовление образцов. Для экспериментальных проб аликвоты биоматериала морской свинки (плазма крови или гомогенат органа) объёмом 100 мкл помещали в лунки 96-луночного планшета (объём лунки 1 мл).
Стандарты для калибровки и контроля качества (подтверждение специфичности методики) создавали путём добавления к аликвотам объёмом 90 мкл интактного биоматериала 10 мкл аликвот стандартных растворов соответствующих концентраций. Для контрольных проб в соответствующие лунки добавляли 10 мкл воды.
Для определения связывания соединения CBL0100 с клеточными компонентами крови две аликвоты пулированной крови объёмом 1,5 мл, полученной из сердца двух интактных морских свинок, помещали в пластиковые центрифужные пробирки, содержащие 100 мкл 5% ЭДТА. Из одной 1,5 мл аликво-ты пулированной крови центрифугированием при 11180 g в течение 10 мин получали плазму — «А». Аликвоты интактной крови и полученной плазмы «А» (270 мкл) переносили в чистые центрифужные пробирки, добавляли по 30 мкл водного раствора CBL0100 c концентрацией 33,3 мкг/мл (конечная концентрация 3,33 мкг/мл), перемешивали на вортексе и инкубировали в течение 20 мин при 370С. После инкубации образцы плазмы «А» отставляли, а образцы крови центрифугировали при 11 180 g в течение 10 мин для получения плазмы «Б».
Далее в каждую лунку добавляли 400 мкл охлажденного рабочего раствора IS (для гомогената кожи добавляли 100 мкл осаждающего агента). Содержимое планшетов встряхивали на платформе шейке-ра в течение 10 мин, далее центрифугировали плату в течение 15 мин при 40С и 3600 об/мин, отбирали 120 мкл супернатанта в соответствующие лунки новой 96-луночной платы (объём лунки 0,5 мл), разбавляли водой в два раза и помещали в автосэмплер системы ВЭЖХ-МС/МС для анализа.
Хроматографический анализ. Для хроматографи-ческого разделения была использована хромато-графическая колонка Luna С18 (2), 3 мкм, 20?4.0 мм (Phenomenex, США) в градиентном режиме элюиро-вания со скоростью потока подвижной фазы 1 мл/мин и температурой разделения 220С. В качестве подвижной фазы использовали растворы 0,1% муравьиной кислоты (99%, Acros Organics) в деионизиванной воде (Millipore, Bedford, MA, США; элюент А) или ацето-нитриле (HPLC grade, Honeywell, Burdick&Jackson; элюент В). Время анализа составляло 3,5 мин, время удерживания основного аналита — 1,6 мин. Для регистрации и обработки данных использовали программное обеспечение Analyst software (version 1.6.1) (Applied Biosystems/MDS SCIEX, США).
Фармакокинетические параметры (AUC((bt), AUC((b^, Tmax, Cmax, kel, T1/2, Cl) рассчитывали на основании данных концентрация — время непараметрическим методом интегральных статистических моментов (программа Phoenix WinNonlin 6.2.1.51, Pharsight Corp., USA). Статистическая обработка данных выполнена с помощью программного обеспечения Microsoft Office Excel 2011.
Результаты и обсуждение
В результате изучения специфичности разработанной хроматографической методики количественного определения при анализе проб интактного биоматериала (отдельно для плазмы и каждого органа) и спайков с CBL0100 было показано, что компоненты биологического материала и пик IS не интерферируют с пиком CBL0100 (ни по времени удерживания, ни по величине сигнала). Анализ калибровочных проб позволил выявить линейные зависимости с характеристиками, представленными в табл. 1. Градуировоч-ные кривые описываются уравнением:
S1/S2 = к*С1/С2 + b,
где: S1/S2 — отношение площадей хроматографиче-ских пиков, в counts, CBL0100и внутреннего стандарта — IS; С1/С2 — отношение концентрациий CBL0100 и IS, нг/мл; k и b — коэффициенты).
Отклонение расчётной концентрации от теоретической для калибровочных проб (валидационный параметр правильность — accuracy) составляло менее 15%.
Разработанная методика количественного определения CBL0100 была использована для анализа проб плазмы, органов и тканей, полученных от лабораторных животных.
В результате исследования связывания соединения CBL0100 с клеточными компонентами крови выявлено, что после 20-минутной инкубации до 92,5% внесенного в цельную кровь CBL0100 до концентрации 3,33 мкг/мл связывается с клеточными компонентами крови, а в плазме детектируется лишь малая его часть (7,5%). Таким образом, коэффициент распределения кровь/плазма (X) соединения CBL0100 составляет 0,075, что свидетельствует о крайне невысокой концентрации соединения, не связанного с форменными элементами крови.
На основании усредненных (статистически обработанных) данных зависимости концентрации CBL0100 в плазме животных от времени после однократной накожной аппликации препаратов CBL0100 построены фармакокинетические кривые, представленные на рис. 1, а также рассчитаны основные фар-макокинетические параметры, приведённые в табл. 2.
Как видно из табл. 2, максимальные значения концентраций CBL0100 наблюдаются через 12 ч после однократного накожного нанесения препаратов на ЭМ- и ПЭГ-основах с концентрацией 2% (8,9 и 18,3 мг/животное соответственно). Для препаратов с концентрациями 0,2% и 1% такой корреляции не наблюдается: значения T составляют 12 и 2 ч
max
для низкоконцентрированных (Cmax соответственно 8,8 и 22,4 мг/животное) и 6 и 12 ч для высококонцентрированных мазей (Cmax соответственно 145,8 и 248,8 мг/животное).
Таблица 1
Характеристики калибровочных кривых, полученных при валидации методики количественного определения CBL0100 в органах и тканях морских свинок методом ВЭЖХ/МС/МС
Ткань/ Орган Параметр
диапазон линейности, нг/мл уравнение регрессии коэффициент корреляции г ИОО, нг/мл
Сердце 9,8-1250 у = 85,7-х -683 0,9929 9,8
Почки 9,8-2500 у = 78-х -1320 0,9964 9,8
Легкие 19,5-2500 у = 41,4-х -547 0,9976 19,5
Печень 19,5-5000 у = 81-х -1110 0,9977 19,5
Селезёнка 39,1-2500 у = 42,9-х -521 0,9970 39,1
Примечание: ИОО - нижний предел количественного определения применяемой методики (чувствительность методики).
1—
- Эмульсионная основа_0,02%
- ПЭГ-основа_0,02%
-!-1-Г"
0 7 14 21 28 0 7 14 21 28 0 7
д Время (ч) в Время (ч) С
Рис. 1. Фармакокинетические кривые усредненных концентраций СВШ100 в плазме крови морских свинок после однократного накожного применения двух разных мазей (на ЭМ — и ПЭГ-основах) в полулогарифмических координатах (п=5, Меап±БЕ): А — в дозе 0,2 мг/ животное (0,02% СВЮ100 в мази); В — в дозе 2 мг/ животное (0,2% СВЮ100 в мази); С — в дозе 10 мг/ животное (1% СВШ100 в мази)
Таблица 2
Значения основных фармакокинетических параметров CBL0100 в плазме крови морских свинок после однократного накожного применения мази на ЭМ- и ПЭГ-основах в разных дозах
Эмульсионная основа_0,2% ПЭГ-основа_0,2%
-1-1-г
14 21
Время (ч)
Эмульсионная основа_1% ПЭГ-основа_1%
14 21
Время (ч)
28
100
10
Параметр Единица измерения Доза нанесенного СВШ100 (ЭМ-основа), мг/животное Доза нанесенного СБЮ100 (ПЭГ-основа), мг/животное
0,2 2 10 0,2 2 10
ч-нг/мл 180,2 171,5 1038,1 194,9 285,5 3479,6
дис0_ ч-нг/мл - - 1080,0 202,0 - -
T max ч 12,0 12,0 6,0 2,0 12,0 12,0
C max нг/мл 8,8 8,9 145,8 22,4 18,3 248,8
1/ч - - 0,161 0,138 - -
Т1/2 ч - - 4,3 5,0 - -
а мл/ч - - 9258,9 989,9 - -
Примечание: «-»—невозможно определить параметр, так как фаза элиминации не выявлена.
Сравнивая попарно величины площадей под фар-макокинетическими кривыми (ЛиС0_24) для мазевых композиций аналогичных концентраций можно заметить, что суммарная концентрация СВЬ0100 в плазме крови в течение первых 24 ч наблюдения выше для ПЭГ-основы, чем для ЭМ-основы.
Следует отметить, что для обеих основ наблюдаются отклонения от линейной дозовой фармакоки-нетической зависимости, что коррелируется с ранее выявленным связыванием с форменными элементами крови.
Исследование распределения СБЬ0100 в тканях и органах. Результаты определения концентраций СВМ100 в органах морских свинок через 24 ч после накожного нанесения представлены на рис. 2, 3. Данные о содержании СВЬ0100 в мышечной ткани и сердце экспериментальных животных представлены в табл. 3.
Стоит отметить, что независимо от состава лекарственной формы, через 24 ч после однократного нанесения мази на скарифицированную кожу морских свинок наибольшее количество активной субстан-
о
X S
Ей
и X S X и а о s
X га х га а о
Ей
О
о н о
_J
ta
и
Доза нанесенного СБЬОДОО, мг
^^ — Мозг ^^ • Легкие — А — Почки — Печень "-XяСелезенка — Кожа
Рис. 2. Концентрации CBL0100 в органах морских свинок после однократного накожного применения мази на ЭМ-основе в разных дозах
о
X S
Ей
и X
и а о S
х га х га а о
J
Доза нанесенного CBL0100, мг
—* -Мозг —ш • Легкие — А -Почки — Печень-"*"■ Селезенка — Кожа
Рис. 3. Концентрации CBL0100 в органах морских свинок после однократного накожного применения мази на ПЭГ- основе в разных дозах.
ции обнаруживается в коже и селезёнке, что, с одной стороны, говорит о накоплении препарата в месте введения, а с другой стороны, о значительном проникновении в системный кровоток. Депонирование CBL0100 в селезёнке согласуется с результатами in vitro эксперимента по распределению между кровью и плазмой, а именно с тем, что при попадании в кровь вещество связывается (или проникает) в клеточные элементы крови и проникает в селезёнку.
Таблица 3
Концентрации (в нг/г) CBL0100 в мышечной ткани и сердце морских свинок после однократного накожного применения мазей на ЭМ- и ПЭГ-основах
Орган/ ткань ЭМ-основа ПЭГ-основа
среднее SD среднее SD
0,02% CBL0100 (0,2 мг вещества/животное)
Сердце 38,4 - 51,0 -
Мышца 29,9 - BQL -
0,2% СBL0100 (2 мг вещества/животное)
Сердце 50,8 15,2 47,3 18,3
Мышца BQL - BQL -
1% СBL0100 (10 мг вещества/животное)
Сердце 46,5 8,0 33,2 4,9
Мышца 43,0 12,0 30,8 1,0
Примечание: BQL—ниже предела количественного определения.
Обсуждение
В результате проведенных работ была разработана биоаналитическая методика с применением ВЭЖХ-МС/МС для количественного определения CBL0100 в различных биопрепаратах. Разработанная методика позволила провести аналитическую часть сравнительного исследования фармакокинетики и количественно определить CBLB100 в плазме крови, сердце, лёгких, печени, почках, селезёнке и коже после однократного накожного применения двух различных кремовых композиций препарата на эмульсионной и полиэтиленгликолевой основах в дозах 10, 2 и 0,2 мг/ животное.
Было установлено, что при накожном нанесении CBL0100 интенсивно проникает в системный кровоток и распределяется в сильно васкуляризированные органы морских свинок — селезёнку, печень, почки и лёгкие, что коррелирует с данными по распределению соединения между кровью и плазмой. Концентрация CBL0100 достигает максимальных значений в коже и селезёнке, в то же время его содержание в слабо васкуляризированной мышечной ткани незначительно. В мозг, через гематоэнцефалический барьер, CBL0100 проникает умеренно. При этом, учитывая, что накожное применение противогрибкового препарата предполагает его незначительную системную абсорбцию, концентрация CBL0100 в селезёнке, которая находится на уровне содержания CBL0100 в коже, крайне высока.
В эксперименте in vitro было выявлено, что CBL0100 преимущественно распределяется в клеточный компонент крови и крайне медленно высвобождается при достижении равновесной концентрации с плазмой. Это может быть одной из причин медленной элиминации соединения из системного кровотока животных (фармакокинетические параметры,
характеризующие стадию выведения исследуемого соединения, не рассчитаны для 0,02% и 0,2% мазей на ЭМ-основе и 0,2% и 1% мазей на ПЭГ-основе в связи с тем, что не была выявлена фаза элиминации). В дальнейших исследованиях представляется целесообразным изучить пробы биоматериала в более удаленные от момента введения СВЬ0100 временные интервалы.
В целом было показано, что эмульсионная композиция способствует более высокой трансдермальной проницаемости СВЬ0100. Таким образом, в рамках разработки лекарственного препарата для лечения топических микозов крем на полиэтиленгликолевой основе позволяет сохранить эффективность антими-котика при меньшем системном воздействии.
Литература
1. Иванова М.А., Огрызенко Е.В., Бендриковская И.А., Мельниченко Н.Е., Ялхороева Р.М. Динамика заболеваемости дерматомикозами в Российской Федерации в 2003-2007 гг // Клиническая дерматология и венерология. 2009; 2: 26—31.
2. Разнатовский К.И., Родионов А.Н., Котрехова Л.П. Дерматоматомикозы. СПб.: МАПО, 2003; 158.
3. Еремина Н.В., Жанатаев А.К., Чайка З.В., Васильева Н.В., Елинов Н.П., Богомолова Т.С. и др. Скрининг противогрибковой активности карбазол-замещенных соединений и оценка генотоксичности молекул-лидеров. Проблемы медицинской микологии. 2013; 15: 3: 42—47.
4. Еремина Н.В., Казей В.И., Чурин А.А., et. al. Пилотные исследования эффективности и острой токсичности двух лекарственных композиций инновационного препарата CBL0100 для лечения микозов. Проблемы медицинской микологии. 2014; 16: 1: 23—28.
5. Миронов А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. / Под редакцией А.Н.Миронова. М.: Гриф и К, 2012; 988.
6. Валидация аналитических методик для производителей лекарств: типовое руководство предприятия по производству лекарственных средств / Под редакцией В.В.Береговых. М.: Литтерра, 2008; 132.
7. Раменская Г.В., Шохин И.Е., Савченко А.Ю., Давыдова К.С., Кукес В.Г. Обзор требований к валидации биоаналитических методик. Ремедиум. 2011; 12: 60—63.
