CC BY
37
Фармакокинетика оливамида при внутривенном введении крысам и кроликам (пилотное исследование)
Ю. А. ПОРТНОЙ, С. А. ДОВЖЕНКО, М. Б. КОБРИН, М. И. ТРЕЩАЛИН, В. А. ГОЛОБРОДО, А. Н. ТЕВЯШОВА, А. А. ФИРСОВ*
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе» (ФГБНУ «НИИНА»), Москва
Pharmacokinetics of Olivamide after Bolus Administration in Rats and Rabbits (a Pilot Study)
YU. A. PORTNOY, S. A. DOVZHENKO, M. B. KOBRIN, M. I. TRESHALIN, V. A. GOLOBRODO, A. N. TEVYASHOVA, A. A. FIRSOV*
Gause Institute of New Antibiotics, Moscow
Изучена фармакокинетика полусинтетического противоопухолевого препарата оливамида — производного оливамицина А — после внутривенного введения крысам и кроликам. Концентрацию оливамида в биопробах определяли методом ВЭЖХ. Снижение уровней оливамида в плазме крови животных носило двухфазный характер. После резкого падения концентрации препарата в течение первых 15 мин, обусловленного быстрым перераспределением оливамида между кровью и периферическими тканями, уровни оливамида снижались медленно вплоть до 24 ч. Значения тканевой доступности оливамида у крыс составляли от 5700% (селезёнка) до 450% (печень). Кумулятивная экскреция неизменённого оливамида с мочой крыс через 8 ч после инъекции составляла 18% от дозы. Усреднённые фармакокинетические профили оливамида в плазме крови животных описывали трехэкспоненциальным уравнением. Значения общего клиренса и стационарного объёма распределения у крыс оказались выше, чем у кроликов (17,9—22,0 против 16,2 мл/(минХкг) и 7,8—8,7 против 5,1 л/кг, соответственно). Среднее время удержания оливамида у кроликов было меньше, чем у крыс (5,3 против 6,3—7,3 ч). Фармакокинетика оливамида у крыс была линейной.
Ключевые слова: оливамид, фармакокинетика, доклиническое изучение.
The pharmacokinetics of olivamide, a semisynthetic antitumor derivate of olivomycin A, were studied in rats and rabbits after bolus administration. Plasma concentrations of olivamide were determined by an HPLC assay. The decrease in olivamide levels in blood plasma was biphasic in both rats and rabbits. Olivamide levels declined slowly for up to 24 hours after a sharp drop in drug concentration during the first 15 minutes due to the rapid redistribution of olivamide between blood and peripheral tissues. The tissue availability of olivamide in rats ranged from 5700% (spleen) to 450% (liver). Eight-hour cumulative renal excretion of unchanged olivamide in rats was 18% of the dose. A three-exponential equation was used to describe pharmacokinetic profiles of olivamide in rat and rabbit plasma. The total clearance and steady-state volume of distribution in rats were higher than in rabbits (17.9—22.0 vs. 16.2 ml/(minXkg) and 7.8—8.7 vs. 5.1 l/kg, respectively). The mean retention time of olivamide in rabbits was less than in rats (5.3 vs 6.3—7.3 h). Olivamide pharmacokinetics in rats were linear.
Keywords: olivamide, pharmacokinetics, preclinical study.
Введение
Клиническое применение противоопухолевых антибиотиков группы ауреоловой кислоты лимитировано низким терапевтическим индексом. Даже лучший по этому показателю оливоми-цин А характеризуется высокой токсичностью. В лаборатории химической трансформации антибиотиков ФГБНУ «НИИНА» была проведена оптимизация структуры оливомицина А, которая позволила получить его полусинтетическое производное — М,М-диметиламиноэтиламид 1'-дез-
© Коллектив авторов, 2017
*Адрес для корреспонденции: 119021, Москва, ул. Большая Пироговская, дом 11, строение 1. НИИНА им. Г. Ф. Гаузе. E-mail: [email protected]
(2,3-дигидрокси-н-бутироил)-1'-карбокси-оли-вомицина А (оливамид), не уступающее оливо-мицину А по противоопухолевой активности, но превосходящее его по переносимости [1].
Целью данной работы было получение первичных данных о фармакокинетике оливамида в опытах на животных (крысы и кролики).
Материал и методы
Лабораторные животные, режим введения препарата, регламент отбора образцов биоматериала. Фармакокинетические исследования проводили на половозрелых беспородных самцах крыс с массой тела от 200 до 270 и самцах кроликов породы «Советская шиншилла» с массой тела от 2000 до 2500 г. Оливамид вводили натощак (животные не получали пищи в течение 8 ч до его введения) внутривенно в дозах 1, 2 и 4 мг/кг (крысы) и 0,4 мг/кг (кролики — доза в пересчёте на единицу
поверхности тела животного соответствует дозе 1 мг/кг у крыс). Раствор препарата готовили непосредственно перед введением путём добавления к готовой лекарственной форме, содержащей 5 мг оливамида, 5 мл 5% раствора глюкозы. Полученный раствор вводили в хвостовую вену крысы или краевую вену уха кролика. Объём вводимого раствора рассчитывали с учётом массы тела каждого животного.
Через 5, 15, 30 мин, 1, 4, 8, 24 и 48 ч после введения препарата крысам в дозе 1 мг/кг проводили эвтаназию животных путём декапитации (для отбора биопроб в каждой временной точке использовали не менее 6 животных). Отбор крови производили в стерильные пластиковые пробирки ёмкостью 1,5 мл, в которые было заранее добавлено по 200 мкл 6% раствора натрий ЭДТА. Кровь центрифугировали в течение 40 мин при 2000 оборотов/мин. Надосадочную жидкость помещали в пробирку типа эппендорф, замораживали и хранили при температуре —20°С до проведения хроматографического анализа.
Органы животных (задняя группа мышц бедра, лёгкие, сердце, почки, печень, селезёнка) выделяли после декапита-ции, взвешивали, затем гомогенизировали при помощи механических ручных гомогенизаторов и растирали пестиком в ступке с добавлением питательной среды 199 (питательная среда для культуры клеток жидкая, с солями Хенкса и глута-мином) в соотношении 1:1 (масса/объём). Готовые гомогена-ты тканей органов помещали в бакпечатки, замораживали и хранили при температуре —20°С до проведения хроматографического анализа.
Для отбора мочи крыс помещали в индивидуальные диу-резные клетки. Мочу крыс собирали до и через 4 и 8 ч после введения препарата. Измеряли объём мочи, после чего пробы замораживали и хранили при температуре —20°С до проведения хроматографического анализа.
У крыс, которым вводили препарат в дозе 2 и 4 мг/кг, отбирали только пробы крови через те же промежутки времени за исключением точки на 48 ч (по 6 животных на каждую временную точку).
Пробы крови у каждого из 6 кроликов отбирали до и через 5, 15, 30 мин; 1; 4, 8 и 24 ч после введения оливамида при помощи внутрисердечной пункции. Образцы плазмы крови готовили так же, как описано выше.
Количественное определение оливамида в биоматериале. Анализ содержания оливамида в биопробах осуществляли методом ВЭЖХ с использованием хроматографической системы Gilson (Gilson, Франция). Непосредственно перед проведением анализа белки в пробах плазмы крови, мочи или гомогена-тах тканей органов осаждали равным объёму пробы объёмом ацетонитрила. Полученные растворы встряхивали на шейкере в течение 2 мин, затем центрифугировали при 13000 об/мин в течение 5 мин (центрифуга Eppendorf MiniSpin, Eppendorf, США). Супернатант вводили в хроматограф. Разделение проводили на колонке Luna C18(2) размером 4,6 х 250 мм, 5 мкм (Phenomenex, США) при температуре 30°С; в качестве подвижной фазы использовали 5 мМ раствор натриевой соли пентансульфокислоты в смеси 10 мМ раствора фосфата калия монозамещенного (рН 7,0) и ацетонитрила (43:57 — для плазмы крови и 40:60 — для гомогенатов периферических тканей и мочи). Детектирование проводили при помощи флуориметра ABI 980 (ABI, США), длина волны возбуждения — 400 нм, длина волны испускания — 535 нм. Скорость подачи подвижной фазы составляла 1,2 мл/мин (плазма крови) и 1,0 мл/мин (гомогенаты периферических тканей и образцы мочи), объём пробы — 10 мкл.
Предел чувствительности обнаружения оливамида в биопробах составлял около 2 нг/мл, предел количественного определения — около 5 нг/мл.
Обработка результатов определения концентрации оливамида в биопробах. Статистический анализ результатов определения концентрации оливамида в биопробах предусматривал расчёт среднеарифметических (MA) или среднегеометрических [MG = exp (Ma in)] значений и их интервальной оценки,
вычисляемой как (MA±SD), где SD — стандартное отклонение, в случае среднеарифметического или [exp (Ma ¡n±SD{n)] — в случае среднегеометрического, где MA in и SDtn, соответственно, среднеарифметическое и стандартное отклонение выборки после логарифмического преобразования её вариант. Расчёты проводили при помощи программы EXCEL 2010.
Анализ фармакокинетических данных. Индивидуальные профили изменения концентрации оливамида (С) в плазме крови кроликов и усреднённые профили, построенные по среднегеометрическим значениям его концентрации в плазме крови крыс, во времени (t) описывали трёхэкспоненциаль-ным уравнением [2]:
C(t) =A1 exp(-at) + A2exp(-ßt) + A3(exp-yt), (1)
где A], A2 и A3 — предэкспоненциальные множители, а, ß и у — комплексные параметры. Фармакокинетические профили характеризовали значениями общего клиренса (С1Т), стационарного объёма распределения (Vss) и среднего времени удержания в системном кровотоке (MRT), рассчитанными с помощью программы TOPFIT V. 1.1 (Gödecke, Schering, Thomae. 1991). Кроме того, при помощи той же программы вычисляли методом трапеций значения площади под фарма-кокинетической кривой в пределах от нуля до 24 ч (AUC244).
Усреднённые фармакокинетические профили оливамида в периферических тканях крыс характеризовали соответствующими значениями AUC244 (AUC244). Тканевую доступность антибиотика (fT) определяли по формуле [3]: fT(%) =AUCt244x100/AUC244 (2).
Результаты и обсуждение
Фармакокинетические профили оливамида в плазме крови крыс и кроликов показаны на рис. 1 и 2. Во всех случаях снижение уровней оливамида в плазме крови носило двухфазный характер. После резкого падения концентрации препарата в течение первых 15 мин (в 6 раз после его введения крысам в дозах 1 и 2 мг/кг и кроликам в дозе 0,4 мг/кг и в 20 раз после введения крысам в дозе 4 мг/кг) уровни оливамида снижались медленно вплоть до 24 ч. Эти особенности обусловлены быстрым перераспределением оливамида между кровью и периферическими тканями. Так, уже через 15 мин после введения уровни препарата в тканях мышц, сердца, лёгких, почек и селезёнки превышали соответству-
Рис. 1. Усреднённые фармакокинетические профили оливамида в плазме крови крыс после однократного введения в дозе 1 мг/кг — (> , 2 мг/кг — Д и 4 мг/кг — V-
Рис. 2. Индивидуальные фармакокинетические профили оливамида в плазме крови кроликов после однократного введения в дозе 0,4 мг/кг.
Рис. 4. Фармакокинетические профили оливамида в плазме крови крыс, описанные уравнением (1). Доза 1 мг/кг — 0 ; 2 мг/кг — А; 4 мг/кг — V . В правом верхнем углу — фрагменты кривых в пределах от 0 до 0,5 ч.
я
Ч шил
-,-,-.-о-1
0 6 12 18 24
Время (ч)
Рис. 5. Усреднённый фармакокинетический профиль оливамида в плазме крови кроликов, описанный уравнением (1).
щ змнз д Ч г
Время (ч)
Рис. 3. Усреднённые фармакокинетические профили оливамида в периферических тканях крыс после введения в дозе 1 мг/кг: селезёнка — Д; лёгкие — ■ ; сердце — О; почки — ▼; мышцы — • ; печень — □ .
ющую концентрацию в плазме крови в среднем, соответственно, в 4, 5, 6, 8 и 9 раз. В тот же момент времени лишь в тканях печени уровни оливамида были ниже, чем в крови. Как видно на рис. 3, последующее снижение концентрации препарата в периферических тканях происходит значительно медленнее, чем в крови. Например, через 24 ч после введения уровни оливамида в тканях селезёнки, лёгких, почек, сердца, мышц и печени были в 200, 100, 40, 30, 20 и 7 раз выше, чем в плазме крови, соответственно.
При этом даже через 48 ч после введения препарата, когда его уровни в плазме крови были ниже предела количественного обнаружения, концентрация препарата в тканях лёгких и селезёнки оставалась значительной: в среднем 80 и 230 нг/мг, соответственно. Значения тканевой доступности оливамида у крыс, составляли 5700%
(селезёнка), 2800% (лёгкие), 1500% (сердце), 1300% (почки) 1100% (мышцы) и 450% (печень).
Кумулятивная экскреция неизменённого оливамида с мочой крыс через 4 и 8 ч после инъекции, составляла, соответственно, 12 и 18% от дозы.
Параметры фармакокинетики оливамида у крыс и кроликов приведены в таблице. Как следует из представленных данных, значения общего клиренса (ClT) и стационарного объёма распределения (Vs) у крыс оказались выше, чем у кроликов (17,9—22,0 против 16,2 млхмин-1хкг-1 и 7,8—8,7 против 5,1 л/кг, соответственно). При этом, вопреки ожиданиям, среднее время удержания (MRT) оливамида у кроликов было меньше, чем у крыс (5,3 против 6,3—7,3 ч). Как у крыс, так и у кроликов фармакокинетические профили удовлетворительно описывались трёх-экспоненциальным уравнением (рис. 4, 5).
Паpаметpы фармакокинетики оливамида у крыс и кроликов
Вид животного Доза а ß V Clr, V MRT, auc24„
мг/кг 4-1 4-1 4-1 мл/(минХкг) л/кг 4 нгХ4/мл
Крысы 1 0,04 1,51 7,37 20,0 8,7 7,3 859
2 0,05 0,66 7,37 17,9 7,8 7,3 2380
4 0,04 0,90 7,37 22,0 8,3 6,3 5200
Кролики 0,4 0,035 0,74 5,33 16,2 5,1 5,3 281
Величина АиС24ч возрастала пропорционально дозе — в 2,8 раз при повышении дозы оливамида от 1 до 2 мг/кг и в 2,2 раза при повышении дозы от 2 до 4 мг/кг. Зависимость АиС24ч от дозы описывалась уравнением прямой, проходящей через начало координат (рис. 6), что свидетельствует о линейности фармакокинетики препарата. О том же свидетельствует незначительная вариабельность значений С1Т и V,,,,, установленных при введении оливамида крысам в разных дозах (см. таблицу).
Проведённое фармакокинетическое изучение оливамида позволило установить интенсивное проникновение препарата в периферические ткани. Для оценки кумуляции оливамида при многократном введении необходимы дальнейшие исследования.
Рис. 6. Проверка гипотезы линейности фармакокинетики оливамида у крыс.
ЛИТЕРАТУРА
1. Tevyashova AN, Olsufyeva EN, Shtil AA, Dezhenkova LG, Isakova EB, Bukhman VM et al. Chemical modification of the antibiotic olivomycin A at the side chain of the aglycone moiety yields the derivative with perspective antitumor characteristics. Bioorg & Med Chem 2011; 19: 7387-7393.
2. Соловьев В Н., Фирсов A.A., Филов В.А. Фармакокинетика (руководство). Медицина, М.: 1980. / Solov'ev V.N., Firsov A.A., Filov V.A. Farmakokinetika (rukovodstvo). Medicina, M.: 1980. [in Russian]
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Портной Юрий Абрамович — с.н.с. лаборатории фармакокинетики и фармакодинамики ФГБНУ «НИИНА», Москва Довженко Светлана Анатольевна — к.х.н., с.н.с. лаборатории фармакокинетики и фармакодинамики ФГБНУ «НИИНА», Москва
Кобрин Михаил Борисович — с.н.с. лаборатории фармакокинетики и фармакодинамики ФГБНУ «НИИНА», Москва Трещалин Михаил Иванович — н.с. лаборатории фармакологии ФГБНУ «НИИНА», Москва
3. Фирсов A. A., Жердев В.П., Портной Ю.А., Колыванов Г.Б., Литвин A.A., Барманова ЕЮ. Методические рекомендации по проведению доклинических исследований фармакокинетики лекарственных средств. В кн. «Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств» под ред. А. Н. Миронова. Изд. М.: Гриф и К. 2012; 845-855. / Firsov A. A., Zherdev V.P., Portnoj Ju.A., Kolyvanov G.B., Litvin A.A., Barmanova E.Ju. Metodicheskie rekomendacii po provedeniju doklinicheskikh issledovanij far-makokinetiki lekarstvennykh sredstv. V kn. «Rukovodstvo po provedeniju doklinicheskikh issledovanij lekarstvennykh sredstv» pod red. A. N.Mironova. Izd. M.: Grif i K. 2012; 845-855. [in Russian]
Голобродо Василиса Антоновна — к.б.н., н.с. лаборатории фармакологии ФГБНУ «НИИНА», Москва Тевяшова Анна Николаевна — д.х.н., в.н.с. лаборатории химической трансформации антибиотиков ФГБНУ «НИИНА», Москва
Фирсов Александр Алексеевич — д.б.н., профессор, чл.-корр. РАН, заведующий лабораторией фармакокинетики и фармакодинамики ФГБНУ «НИИНА», Москва
