CC BY
18
Раздел 02.00.10
Биоорганическая химия
УДК 547-316.:547-32 DOI: 10.17122/bcj-2020-1-32-35
А. Р. Чанышева (к.х.н., доц.), Ю. К. Юсупова (магистрант), Н. В. Привалов (магистрант), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
ОПТИМИЗАЦИЯ КЕТОРЕДУКТАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ PETROSELINUM CRISPUM ДЛЯ СИНТЕЗА (5)-1-(4-МЕТОКСИФЕНИЛ)ЭТАНОЛА
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств, 450062, РБ, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: aliyach@mail.ru
A. R. Chanysheva, Y. K. Yusupova, N. V. Privalov, V. V. Zorin
OPTIMIZATION OF THE KETO REDUCTASE ACTIVITY OF PETROSELINUM CRISPUM ENZYMES
FOR THE SYNTHESIS OF (S)-1-(4-METHOXYPHENYL)ETHANOL
Ufa State Petroleum Technological University 1, Kosmonavtov Str, 450062, Ufa, Russia; ph. (347) 2431935, e-mail: aliyach@mail.ru
Предложен метод синтеза (5)-1-(4-метоксифе-нил)этанола, используемого для получения различных лекарственных препаратов, путем биовосстановления прохирального и-метоксиаце-тофенона в присутствии доступного биокатализатора Р.спзрпш. Проведены исследования по оптимизации кеторедуктазного потенциала ферментов клеток Р.спзрпш с помощью экзогенных восстановителей (изопропанол, этанол или глюкоза) коферментов ЫАВ+ (ЫАВР+) с целью повышения выхода и оптической чистоты целевого (5)-1-(4-метоксифенил)этанола.
Ключевые слова: биовосстановление; биокатализатор; вторичные спирты; ферменты; и-ме-токсиацетофенон; (5)-1-(4-метоксифенил)эта-нол; энантиоселективный биокатализ.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта главы Республики Башкортостан молодым исследователям в 2020 году.
Энантиоселективное биовосстановление прохиральных кетонов с участием различных биокатализаторов (ферментных препаратов, клеток микробного и растительного происхождения) является удобным методом для получения оптически чистых вторичных спиртов -строительных блоков для синтеза лекарственных и сельскохозяйственных препаратов, феромонов, отдушек и др. 1-10.
Дата поступления 22.01.20
The method for the synthesis of (S)-1-(4-methoxyphenyl)ethanol used in the production of various drugs is proposed. The method is based on bioreduction of prochiral p-methoxyacetophenone in the presence of available P.crispum culture cells. We performed research on optimization of the ketoreductase potential of P.crispum cell enzymes using exogenous reducing agents (isopropanol, ethanol or glucose) of NAD+ (NADP+) coenzymes in order to increase the yield and optical purity of the target (S)-1-(4-methoxyphenyl) ethanol.
Key words: biocatalyst; bioreduction; enantioselective biocatalysis; enzymes; p-metho-xyacetophenone; (5)-1-(4-methoxyphenyl)ethanol; secondary alcohols.
This study was financially supported by the grant of the head of Republic of Bashkortostan to young researchers in 2020.
Ранее нами была исследована возможность синтеза оптически чистого (5)-1-(4-ме-токсифенил)этанола — предшественника ряда фармацевтических препаратов 11-13 из п-меток-сиацетофенона в присутствии клеточного катализатора на основе культуры Daucus carota и различных экзогенных восстановителей. Установлено, что в изученных условиях энантиосе-лективное восстановление п-метоксиацетофе-нона наиболее эффективно протекает в присут-
ствии 3% изопропанола в течение 144 ч и приводит к образованию (5)-1-(4-метоксифенил)-этанола с выходом 19% и оптической чистотой 55% ее 14.
В данной работе нами была изучена биотрансформация п-метоксиацетофенона в (5)-1-(4-метоксифенил)этанол, катализируемая доступным биокатализатором на основе клеток Р.спзрит, а также проведены исследования по оптимизации кеторедуктазного потенциала ферментов клеток Р.спзрит с помощью экзогенных восстановителей (изопропанол, этанол или глюкоза) коферментов МЛБ+ (МЛВР+).
Биовосстановление п-метоксиацетофенона, катализируемое клетками Р.спзрит, в воде при комнатной температуре в течение 24 ч приводит к образованию (5)-1-(4-метоксифе-нил)этанола с выходом 12% и оптической чистотой 72% ее, однако при дальнейшей биотрансформации (144 ч) оптическая чистота спирта снижается до 37% ее.
и-метоксиацетофенон (5)-1 -(4-метоксифенил)этанол
При биотрансформации п-метоксиацетофенона в присутствии этанола (1—5 %) в качестве
экзогенного восстановителя образуется (5)-1-(4-метоксифенил)этанол с выходом 2—9 % и оптической чистотой 20—88 % ее (табл.1), а в присутствии изопропанола (1—5 %) выход и оптическая чистота целевого продукта составляют 1—30 % и 6—90 % ее, соответственно (табл. 2).
Так, в присутствии 2% изопропанола выход и оптическая чистота (5)-1-(4-метоксифенил)-этанола составляют 30 и 80 % ее, соответственно. При увеличении продолжительности биотрансформации и концентрации изопропанола выход и оптическая чистота (5)-1-(4-метоксифенил)этанола существенно снижаются.
При биовосстановлении п-метоксиацетофенона в воде при комнатной температуре в течение 24 ч в присутствии глюкозы в эквимолярном соотношении (субстрат/глюкоза) образуется (5)-1-(4-метоксифенил)этанол с выходом 14% и оптической чистотой 80% ее. Однако при увеличении продолжительности реакции до 48 ч выход спирта незначительно возрастает, а оптическая чистота снижается до 75% ее (табл. 3).
Примечательно, что во всех случаях с увеличением продолжительности биовосстановления оптическая чистота (5)-1-(4-метоксифенил)этанола снижается, что, возможно, связано со стерео-инверсией энантиомеров спирта.
Таблица 1
Зависимость выхода и оптической чистоты (8 )-1-(4-метоксифенил)этанола от концентрации этанола при биовосстановлении п-метоксиацетофенона_
Концентрация этанола, % Время, ч
24 48 72 144
Выход, % Оптическая чистота, % ее Выход, % Оптическая чистота, % ее Выход, % Оптическая чистота, % ее Выход, % Оптическая чистота, % ее
0 12 72 11 47 8 42 12 37
1 4 69 6 60 5 67 7 31
2 6 74 6 72 7 55 7 40
3 5 77 7 64 7 47 8 31
4 5 88 4 69 2 70 9 20
5 3 79 3 77 2 43 3 64
Т = 25—27 оС, растворитель — вода, концентрация субстрата 1.4 г/л, катализатор — Р. спзрит.
Таблица 2
Зависимость выхода и оптической чистоты (8)-1-(4-метоксифенил)этанола от кон_центрации изопропанола при биовосстановлении п-метоксиацетофенона_
Концентрация изопропанола, Время, ч
24 48 72 144
% Выход, Оптическая Выход, Оптическая Выход, Оптическая Выход, Оптическая
% чистота, % % чистота, % % чистота, % % чистота, %
ее ее ее ее
0 12 72 11 47 8 42 12 37
1 6 70 13 50 13 20 16 6
2 8 24 30 80 27 65 15 18
3 2 90 1 77 3 56 2 20
4 2 87 1 13 2 68 2 48
5 3 79 2 8 6 11 10 6
Т = 25—27 0С, растворитель — вода, концентрация субстрата 1.4 г/л, катализатор — Р. спзрит.
Башкирский химический журнал. 2020. Том 27. N° 1 33
Таблица 3
Зависимость выхода и оптической чистоты (5)-1-(4-метоксифенил)этанола от продолжительности биовосстановления л-метоксиацетофенона с участием биокатализатора Р. оперит в присутствии глюкозы
Условия Время, ч
24 48 72 144
Выход, Оптическая Выход, Оптическая Выход, Оптическая Выход, Оптическая
% чистота, % % чистота, % % чистота, % % чистота, %
ee ee ee ee
Без глюкозы 12 72 11 47 8 42 12 37
С глюкозой 14 88 16 75 13 60 14 30
Т = 25—27 °С, растворитель — вода, концентрация
За ходом протекания реакций следили хроматографически, используя заведомо синтезированные образцы рацемического (Я,Б)-1-(4-метоксифенил)этанола с применением энан-тиоселективной колонки А81ес СНШАЬ ЭЕХТМ В-РМ, на которой время удерживания (^)-1-(4-метоксифенил)этанола меньше, чем (5)-1-(4-метоксифенил)этанола.
Строение (5)-1-(4-метоксифенил)этанола подтверждали с помощью методов ЯМР 1Н и С13-спектроскопии, хромато-масс-спектромет-рии и поляриметрии.
Таким образом, в изученных условиях удается осуществить энантиоселективное биокаталитическое восстановление п-метоксиаце-тофенона в (5)-1-(4-метоксифенил)этанол в присутствии доступного биокатализатора на основе клеток культуры Р.ст1$риш и изопропа-нола (2%) с выходом целевого продукта 30% и оптической чистотой 80% ее.
Экспериментальная часть
Спектры ЯМР *Н и ЯМР 13С записаны на спектрометре Вгикег АМ-300 (300.13 МГц ОН), 75.47 МГц (13С)), в качестве внутреннего стандарта использовали ТМС. Спектры ЯМР 13С записаны в режиме полного подавления по протонам, в режиме JMOD.
Масс-спектральный анализ проводили на хромато-масс-спектрометре ССМ5-ОР20105 БЫшаёги (электронная ионизация при 70 эВ) с использованием капиллярной колонки НР-Литература
1.
2.
3.
субстрата 1.4 г/л, катализатор — P. crispum.
1MS (30 м х 0.25 мм х 0.25 мкм), температура испарителя 280 0C, температура ионизационной камеры 200 0C. Анализ проводили в режиме программирования температуры от 100 до 280 оС со скоростью 20 оС/мин, газ-носитель — гелий (объем потока — 1.1 мл/мин).
Хроматографический анализ проводили на аппаратно-программном комплексе на базе газового хроматографа «Хроматэк-Кристалл-5000.2» с пламенно-ионизационным детектором. Использовали энантиоселективную колонку Astec CHIRAL DEXTMB-PM (30 м х 0.25 мм х 0.12 мкм).
Поляриметрический анализ осуществляли на автоматическом поляриметре АА-55 Optical Activity Limited (стандартная длина волны 589 нм) в хлороформе.
Получение (5)-1-(4-метоксифенил)эта-нола. п-Метоксиацетофенон (0.1 г) добавляли в суспензию клеток P.crispum (15 г) в 70 мл воды, реакционную смесь помещали в орбитальный шейкер (150 об/мин) и перемешивали при комнатной температуре. Пробы отбирались каждые 24 ч. По завершении реакции суспензию фильтровали, биомассу промывали водой. Фильтраты экстрагировали диэтиловым эфиром. Эфирные вытяжки сушили Na2SO4 и отгоняли на роторно-пленочном испарителе.
Спектральные характеристики 1-(4-меток-сифенил)этанола совпадают с литературными данными 14.
Maczka W.K., Mironowicz A. Enantioselective 1. reduction of bromo- and methoxyacetophenone derivatives using carrot and celeriac enzymatic system // Tetrahedron: Asymmetry.— 2004.— V.15.— Pp.1965-1967. 2.
Patil D. Biocatalysis using plant material: A green access to asymmetric reduction // International Journal of ChemTech Research.— 2015.- V.8, №8.- Pp.318-324. 3.
Чанышева А.Р., Юнусова Г.В., Воробьева Т.Е., Зорин В.В. Энантиоселективный синтез (5)-1-фенилэтанола — предшественника низкомолекулярных биорегуляторов // Экологическая химия.— 2017.— Т.26, №6.— С.6-10.
References
Maczka W.K., Mironowicz A. [Enantioselective reduction of bromo- and methoxyacetophenone derivatives using carrot and celeriac enzymatic system]. Tetrahedron: Asymmetry, 2004, vol.15, pp.1965-1967.
Patil D. [Biocatalysis using plant material: A green access to asymmetric reduction]. International Journal of ChemTech Research, 2015, vol.8, no.8, pp.318-324. Chanysheva A.R., Yunusova G.V., Vorobyova T.E., Zorin V.V. [Enantioselective synthesis of (S)-1-phenylethanol, a precursor to low-molecular-weight bioregulators]. Russian Journal of General Chemistry, 2016, vol.86, no.13, pp.3021-3024. doi: 10.1134/S107036321613017X.
4. Ishihara K., Hamada H., Hirata T., Nakajima N. Biotransformation using plant cultured cells // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic.— 2003.- V.23.— Pp.145-170.
5. Suga T., Hirata T., Lee Y.S. The enantioselective biotransformation of a-terpineol and its acetate with the cultured cells of Nicotiana tabacum // Chem. Lett.— 1982.— Pp.1595-1598.
6. Чанышева A. P., Воробьева Т. E., Шейко E. A., Зорин В. В. Энантиоселективное восстановление ацетофенона лиофилизированными клетками D. Carota // Баш. хим. ж.— 2018.— Т.25, №2.— С.41-45.
7. Чанышева A.P., Воробьева E.H., Зорин В. В. Энантиоселективное биовосстановление ацето-фенона в (R)- и (5)-1-фенилэтанолы // Экологическая химия.— 2017.— Т.26, №6.— С. 296300.
8. Чанышева A.P., Шейко E.A., Зорин В.В. Сте-реоселективное биовосстановление гексан-2-она в (25)-(+)-гексан-2-ол // Экологическая химия.— 2018.— Т.27, №4.— С.229-232.
9. Шейко E. A., Медникова E. Э., Воробьева Т. E., Чанышева A. P. Исследование условий энантиоселективного биовосстановления ацето-фенона в (5)-(—)-1-фенилэтанол // Баш. хим. ж.— 2018.— Т.25, №1.— С.55-58.
10. Chanysheva A. R., Vorobyova T. E., Zorin V.V. Relative reactivity of substituted acetophenones in enantioselective biocatalytic reduction catalyzed by plant cells of Daucus carota and Petroselinum crispum // Tetrahedron.— 2018.— V.75.— P.130494.
11. Andrade L. H., Utsunomiya R. S., Omori A. T., Porto A. L., Comasseto J. V. Edible catalysts for clean chemical reactions: Bioreduction of aromatic ketones and biooxidation of secondary alcohols using plants // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic.— 2006.— V.38, №2.— Pp.84-90.
12. Dai Y., Huan B., Zhang H.-S., He Y.-C. Effective Biotransformation of Ethyl 4-Chloro-3-Oxobutanoate into Ethyl (S)-4-Chloro-3-Hydroxybutanoate by Recombinant E. coli CCZU-T15 Whole Cells in [ChCl][Gly]-Water Media // Applied Biochemistry and Biotechnology.— 2016.— V.181, №4.— Pp.1347-1359.
13. Wei P., Liang J., Cheng J., Zong M.-H., Lou W.Y. Markedly improving asymmetric oxidation of 1-(4-methoxyphenyl)ethanol with Acetobacter sp. CCTCC M209061 cells by adding deep eutectic solvent in a two-phase system // Microbial Cell Factories.— 2016.— V.15, №1.— Pp.1-11.
14. Чанышева A. P., Шейко E. A., Юсупова Ю.К., Зорин В. В. Стереоселективное биовосстановление п-метоксиацетофенона в (5)-1-(4-метокси-фенил)этанол // Баш. хим. ж.— 2019.— Т.26, №2.— С.44-47.
4. Ishihara K., Hamada H., Hirata T., Nakajima N. [Biotransformation using plant cultured cells]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2003, vol.23, pp.145-170.
5. Suga T., Hirata T., Lee Y.S. [The enantioselective biotransformation of a-terpineol and its acetate with the cultured cells of Nicotiana tabacum], Chem. Lett., 1982, pp.1595-1598.
6. Chanysheva A. R., Vorobyeva T. E., Sheiko E. A., Zorin V. V. Enantioselektivnoe vosstanovlenie acetofenona liofilizirovannymi kletkami D. Carota [Enantioselective Reduction of Acetophenone by Lyophilized D. Carota Cells]. Bashkirskii khimicheskii zhurnal [Bashkir Chemical Journal], 2018, vol.25, no.2, pp.41-45.
7. Chanysheva A. R., Vorobyova E. N., Zorin V. V. [Enantioselective Bioreduction of Acetophenone into (R)- and (S)-1-Phenylethanols]. Russian Journal of General Chemistry, 2017, vol.87, no.13, pp.3259-3262. doi: 10.1134/ S1070363217130229.
8. Chanysheva A.R., Sheiko E.A., Zorin V.V. [Stereoselective bioreduction of hexan-2-one into (2S)-( + )-hexan-2-ol]. Russian Journal of General Chemistry, 2018, vol.88, no. 13, pp. 2934-2936. doi: 10.1134/S1070363218130170.
9. Sheiko E. A., Mednikova E. E., Vorobyeva T. E., Chanysheva A. R. Issledovanie uslovii enantiose-lektivnogo biovosstanovleniya acetofenona v (S)-(-)-l-feniljetanol [Investigation of enantiose-lective bioreduction conditions of acetophenone to (S)-(—)-1-phenylethanol]. Bashkirskii khimi-cheskii zhurnal [Bashkir Chemical Journal], 2018, vol.25, no.1, pp.55-58.
10. Chanysheva A. R., Vorobyova T. E., Zorin V.V. [Relative reactivity of substituted acetophenones in enantioselective biocatalytic reduction catalyzed by plant cells of Daucus carota and Petroselinum crispum]. Tetrahedron, 2018, vol.75, p.130494.
11. Andrade L. H., Utsunomiya R. S., Omori A. T., Porto A. L., Comasseto J. V. [Edible catalysts for clean chemical reactions: Bioreduction of aromatic ketones and biooxidation of secondary alcohols using plants]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2006, vol.38, no.2, pp.84-90.
12. Dai Y., Huan B., Zhang H.-S., He Y.-C. [Effective Biotransformation of Ethyl 4-Chloro-3-Oxobutanoate into Ethyl (S)-4-Chloro-3-Hydroxybutanoate by Recombinant E. coli CCZU-T15 Whole Cells in [ChCl][Gly]-Water Media]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2016, vol.181, no.4, pp.1347-1359.
13. Wei P., Liang J., Cheng J., Zong M.-H., Lou W.Y. [Markedly improving asymmetric oxidation of 1-(4-methoxyphenyl)ethanol with Acetobacter sp. CCTCC M209061 cells by adding deep eutectic solvent in a two-phase system]. Microbial Cell Factories, 2016, vol.15, no.1, pp.1-11.
14. Chanysheva A. R.; Sheiko E. A.; Yusupova Y. K.; Zorin V. V. Stereoselektivnoye biovosstanovleniye p-metoksiatsetofenona v (S)-1-(4-metoksifenil)-etanol [Stereoselective bioreduction of p-methoxy-acetophenone into (S)-1-(4-methoxyphenyl)etha-nol]. Bashkirskii khimicheskii zhurnal [Bashkir Chemical Journal], 2019, vol.26, no.2, pp.44-47.
