CC BY
17
Раздел 02.00.03
Органическая химия
УДК 547-316.:547-32 DOI: 10.17122/bcj-2020-3-5-8
А. Р. Чанышева (к.х.н., доц.), Е. А. Шейко (магистрант), С. Т. Дибаева (магистрант), А. Л. Суфиярова (магистрант), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНОЕ БИОВОССТАНОВЛЕНИЕ 4-БРОМАЦЕТОФЕНОНА ФЕРМЕНТАМИ DAUCUS CAROTA В БИНАРНОЙ СИСТЕМЕ ВОДА:ИЗООКТАН
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: aliyach@mail.ru
A. R. Chanysheva, E. A. Sheiko, S. T. Dibaeva, A. L. Sufiyarova, V. V. Zorin
ENANTIOSELECTIVE BIOREDUCTION OF 4-BROMOACETOPHENONE BY DAUCUS CAROTA ENZYMES IN BIPHASIC SYSTEM WATER:ISOOCTANE
Ufa State Petroleum Technological University 1, Kosmonavtov Str., 450062, Ufa, Russia; ph. (347) 2431935, e-mail: aliyach@mail.ru
Исследовано энантиоселективное биовосстановление 4-бромацетофенона в бинарной системе вода:изооктан, катализируемое клетками D. carota. Биотрансформация 4-бромацетофенона в бинарной системе вода:изооктан, катализируемая клетками D. carota, приводит к образованию (S)-(—)-1-(4-бромфенил)этанола с максимальным выходом 10% (99% ее). Изучена возможность биовосстановления 4-бромацето-фенона в бинарной системе вода:изооктан, катализируемого клетками D. carota, в присутствии экзогенных восстановителей кофермента NAD+ (NADP+) (этанола, изопропанола или глюкозы). Биотрансформация 4-бромацетофенона в бинарной системе вода:изооктан в присутствии клеток D. carota и этанола (1%) дает (S)-(—)-1-(4-бромфенил)этанол с выходом 14% (99% ee), а в присутствии эквимолярного количества глюкозы — с выходом 35% (99% ee).
Ключевые слова: бинарные системы; биовосстановление; биокатализатор; 4-бромацетофе-нон; (S)-(—)-1-(4-бромфенил)этанол; вторичные спирты; ферменты; энантиоселективный биокатализ.
We studied enantioselective bioreduction of 4-bromoacetophenone in a biphasic system water: isooctane catalyzed by D. carota cells. Biotransformation of 4-bromoacetophenone in biphasic system water:isooctane, catalyzed by D. carota cells, leads to (S)-(—)-1-(4-bromophenyl)ethanol with a maximum yield of 10% (99% ee). The possibility of bioreduction of 4-bromoacetophe-none in a biphasic system water: isooctane catalyzed by D. carota cells in the presence of exogenous reducing agents of the coenzyme NAD+ (NADP +) (ethanol, isopropanol, or glucose) was studied. Biotransformation of 4-bromoacetophe-none in the biphasic system water: isooctane in the presence of D. carota cells and ethanol (1%) gives (S)-(—)-1-(4-bromophenyl) ethanol in 14% yield (99% ee), and in the presence of an equimolar amount of glucose — with a yield of 35% (99% ee).
Key words: biocatalyst; bioreduction; biphasic systems; enantioselective biocatalysis; 4-bromo-acetophenone; (S)-1-(4-bromophenyl)ethanol; enzymes; secondary alcohols.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта главы Республики Башкортостан молодым исследователям в 2020 г.
This study was financially supported by the grant of the head of Republic of Bashkortostan to young researchers in 2020.
Дата поступления 12.03.20
(S)-(—)-1 -(4-бромфенил )этанол используется в синтезе фталоцианинов, применяющихся в качестве фотосенсибилизаторов — лекарственных средств для фототерапии и флуоресцентной диагностики злокачественных опухолей, трофических язв и др. (5)-(—)-1-(4-бром-фенил)этанол участвует в синтезе карбоксами-диновых интермедиатов, используемых для получения оксидазолов — препаратов для лечения различных заболеваний и расстройств (астма, аллергия, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, воспалительные боли, сердечно-сосудистые заболевания) *'2.
Ранее нами было исследовано биокаталитическое восстановление 4-бромацетофенона до соответствующего (S)-(—)-1 -(4-бромфенил )-этанола под действием клеточного катализатора D. carota в воде 3. В результате проведенных исследований было установлено, что при энанти-оселективном биовосстановлении 4-бромацето-фенона в водном растворе, содержащем 20 ммоль/л субстрата и 100 г/л клеток D. carota, при температуре 23—27 оС в течение 96 ч процесс протекает с образованием (S)-(—)-1-(4-бромфенил)этанола с выходом 70% и оптической чистотой 98% ee (по данным энантиоселективной газо-жидкостной хроматографии и поляриметрии).
Поскольку ароматические кетоны ограничено растворимы в воде, нами с целью создания препаративного метода синтеза (S)-(—)-1-(4-бромфенил)этанола было исследовано биовосстановление 4-бромацетофенона в изоокта-не, обладающем меньшей токсичностью по сравнению с другими органическими растворителями. Однако было установлено, что в случае биотрансформации 4-бромацетофенона в аналогичных условиях в изооктане образуется (5)-(—)-1-(4-бромфенил)этанол с более низким выходом 28% и оптической чистотой 94% ee 3.
Снижение выхода и оптической чистоты продукта, по-видимому, связано с тем, что большинство биокатализаторов быстро инак-тивируется и теряет энантиоселективность в присутствии высоких концентраций органического растворителя 4.
Известно, что двухфазные системы успешно используются при биовосстановлении карбонильных соединений с участием ферментов, целых клеток микроорганизмов и растений. При этом проведение биотрансформации в двухфазных системах позволяет увеличить растворимость субстрата 5-8.
В связи с этим нами исследовано биовосстановление 4-бромацетофенона в бинарной системе вода:изооктан в присутствии клеток D. carota.
O OH
^ || ■ Daucus carota g^^^ H2O : C8H18
4-бромацетофенон (5)-1-(4-бромфенил)зтанол
Биовосстановление 4-бромацетофенона в системе вода:изооктан (1:1), содержащей 20 ммоль/л субстрата и 100 г/л клеток биокатализатора, при температуре 23—27 оС приводит к образованию (5)-(—)-1-(4-бромфенил)э-танола с максимальным с выходом всего лишь 10% (99% ее).
С целью оптимизации процесса биовосстановления была изучена возможность трансформации 4-бромацетофенона в бинарной системе вода:изооктан, содержащей экзогенные восстановители кофермента NAD+ (этанол, изопропанол или глюкозу).
Установлено, что при добавлении в реакционную смесь 1% этанола в течение 48 ч образуется продукт с чуть более высоким выходом 14% и 99% ee (табл. 1).
Таблица 1
Зависимость выхода и оптической чистоты
(S )-(-)-1-(4-бромфенил)этанола от продолжительности биовосстановления
4-бромацетофенона в бинарной системе вода:изооктан клетками культуры D. carota в присутствии этанола
Конц -я этанола, % Время, ч
24 48 72 144
выход, %/ выход, %/ выход, %/ выход, %/
ee, % ee, % ee, % ee, %
0 10/99(S) 5/99(S) 10/99 (S) 3/99(S)
1 2/99 (S) 14/99(S) 9/99 (S) 13/99(S)
2 4/99 (S) 5/99(S) 8/99 (S) 10/89(S)
3 3/99 (S) 3.5/99(S) 5/99 (S) 8/99(S)
4 1.5/99 (S) 2/99(S) 3/99 (S) 5/99(S)
5 1.2/99 (S) 1.5/99(S) 1 /99 (S) 1/99(S)
Биотрансформация исходного кетона в присутствии 1—5 % изопропанола не приводит к увеличению выхода целевого спирта, в то время, как добавление эквимолярного количества глюкозы в реакционную среду позволяет получить (5)-(—)-1-(4-бромфенил)этанол с выходом 35% и оптической чистотой 99% ee (144 ч) (табл. 2, 3).
Таблица 2
Зависимость выхода и оптической чистоты
(5)-(-)-1-(4-бромфенил)этанола от продолжительности биовосстановления
4-бромацетофенона в бинарной системе вода:изооктан клетками культуры D. carota в присутствии изопропанола
Конц-я Время, ч
изопро- 24 48 72 144
панола, выход, %/ выход, %/ выход, %/ выход, %/
% ее, % ее, % ее, % ее, %
0 10/99(S) 5/99(S) 1 0/99(S) 3/99 (S)
1 6/99(S) 8/99(S) 1 0/99(S) 0.4/25(S)
2 3.5/99 (S) 7/99(S) 5/99 S) 6/97( S)
3 2/99(S) 4/98(S) 5/99(S) 4/98(S)
4 1.2/99(S) 3/99(S) 4.5/99(S) 3/99(S)
5 2.5/99(S) 1 /99 (S) 1.2/99(S) 1.1/92(S)
Таблица 3
Зависимость выхода и оптической чистоты (Б)-(-)-1-(4-бромфенил)этанола от продолжительности биовосстановления 4-бромацетофенона в бинарной системе вода:изооктан клетками культуры D. carota в присутствии глюкозы
Время, ч 24 48 72 144
выход, %/ ее, % выход, %/ ее, % выход, %/ ее, % выход, %/ ее, %
Без добавления глюкозы 10/99(S) 5/99(S) 10/99(S) 3/9 9(S)
С глюкозой 5/99(S) 20/99(S) 25/99(S) 35/9 9(S)
Строение (5)-(—)-1-(4-бромфенил)этано-ла подтверждали с помощью методов ЯМР 1H и 13С-спектроскопии, хромато-масе-спектро-метрии и поляриметрии.
Таким образом, в изученных условиях удается осуществить энантиоселективное биовосстановление 4-бромацетофенона в бинарной системе вода:изооктан в присутствии биокатализатора D. carota в (5)-(—)-1-(4-бромфе-нил)этанол с максимальным выходом 10% (99% ее). Биотрансформация 4-бромацетофе-нона, катализируемая ферментами D. carota, в бинарной системе вода:изооктан в присутствии экзогенного восстановителя этанола (1%) приводит к образованию (S)-(—)-1-(4-бромфенил)этанола с выходом 14% (99% ee), а в присутствии эквимолярного количества глюкозы - с выходом 35% (99% ee). Анализ полученных результатов показывает, что для создания эффективного препаративного метода получения энатиомерно чистого (S)-(—)-1-(4-бромфенил)этанола, необходимо проведение дальнейших исследований по оптимизации ус-
ловий биотрансформации с участием D. carota или других клеточных биокатализаторов в бинарных системах.
Экспериментальная часть
Спектры ЯМР *Н и ЯМР 13С записаны на спектрометре Bruker АМ-300 (300.13 МГц (1Н), 75.47 МГц (13C)), в качестве внутреннего стандарта для ЯМР 1Н и ЯМР 13С использовали ТМС. Спектры ЯМР 13С записаны в режиме полного подавления по протонам, в режиме JMOD.
Масс-спектральный анализ проводили на хромато-масс-спектрометре GCMS-QP2010S Shimadzu (электронная ионизация при 70 эВ) с использованием капиллярной колонки HP-1MS (30 м х 0,25 мм х 0,25 мкм), температура испарителя 280 оС, температура ионизационной камеры 200 оС. Анализ проводили в режиме программирования температуры от 100 до 280 оС со скоростью 20 оС/мин, газ-носитель — гелий (объем потока — 1,1 мл/мин).
Хроматографический анализ проводили на аппаратно-программном комплексе на базе газового хроматографа «Хроматэк-Кристалл-5000.2» с пламенно-ионизационным детектором. Использовали энантиоселективную колонку Astec CHIRAL DEXTMB-PM (30 м х 0.25 мм х 0.12 мкм).
Поляриметрический анализ осуществляли на автоматическом поляриметре АА-55 Optical Activity Limited (стандартная длина волны 589 нм).
Получение (S)-(-)-1-(4-бромфенил Этанола
4-бромацетофенон (0.1 г) добавляли в суспензию клеток
D.carota (15 г) в 35 мл воды и 35 мл изо-октана, реакционную смесь помещали в орбитальный шейкер (150 об/мин) и перемешивали при комнатной температуре. Пробы отбирались каждые 24 ч. По завершении реакции суспензию фильтровали, биомассу промывали водой. Фильтраты экстрагировали диэтило-вым эфиром. Эфирные вытяжки сушили Na2SO4 и упаривали на роторно-пленочном испарителе.
Спектральные характеристики (S)-(—)-1-(4-бромфенил)этанола совпадают с литературными данными .
Литература
1. Patent US 20130211130 A1, USA. Process for preparing carboxamidine compounds / Fandrick K.R., Gao J.J., Mulder J. A. // Опубл. 2013.
2. Ramos A., Nascimento F. Photochemical and Photophysical Properties of Phthalocyanines Modified with Optically Active Alcohols / / Molecules.- 2015.- V. 20(8).- Pp. 13575-13590.
3. Chanysheva A. R., Vorobyova T. E., Zorin V.V. Relative reactivity of substituted acetophenones in enantioselective biocatalytic reduction catalyzed by plant cells of Daucus carota and Petroselinum crispum // Tetrahedron.- 2019.- V.75.-Pp. 130494. doi: 10.1016/j.tet.2019.130494.
4. Зорин В.В., Петухова Н.И., Шахмаев Р.Н., Ва-силова Л.Я., Чанышева А.Р., Зорин А.В., Су-нагатуллина А.Ш., Халимова Л.Х. Основы исследований в области стерео- и регионаправлен-ного биокатализа и органического синтеза биологически активных веществ.- Уфа: УГНТУ, 2018.- 286.
5. Weisi Xiong, Xiaobing Wang, Lingyi Kong. Design and application of a biphasic system that enhances productivity of Daucus carota-catalyzed asymmetric reduction // Biotechnology Letters.- 2015.- V.37.-Pp.1703. doi: 10.1007/s10529-015-1838-9.
6. Majewska E., Kozlowska M. Regio- and stereoselective reduction of trans-4-phenylbut-3-en-2-one using carrot, celeriac and beetroot enzyme systems in an organic solvent // Tetrahedron Letters.- 2013.- V.15.- Pp. 105121. doi: 10.1016/j.tetlet.2013.09.041.
7. Lou W.-Y., Wang W., Li R.-F. Efficient enantioselective reduction of 4'-methoxyacetophenone with immobilized Rhodotorula sp. AS2.2241 cells in a hydrophilic ionic liquid-containing co-solvent system // Journal of Biotechnology.- 2009.- V.143(3).-Pp.190-197.
8. Dai Y., Huan B., Zhang H.-S. Effective Biotransformation of Ethyl 4-Chloro-3-Oxobutanoate into Ethyl (S)-4-Chloro-3-Hydroxybutanoate by Recombinant E. coli CCZU-T15 Whole Cells in [ChCl][Gly]-Water Media // Applied Biochemistry and Biotechnology.- 2016.-V.181(4).- Pp. 1347-1359.
References
1. Fandrick K.R., Gao J.J., Mulder J. A. [Process for preparing carboxamidine compounds]. Patent no.20130211130 A1, USA, 2013.
2. Ramos A., Nascimento F. [Photochemical and Photophysical Properties of Phthalocyanines Modified with Optically Active Alcohols]. Molecules, 2015, vol.20(8), pp.13575-13590.
3. Chanysheva A. R., Vorobyova T. E., Zorin V.V. [Relative reactivity of substituted acetophenones in enantioselective biocatalytic reduction catalyzed by plant cells of Daucus carota and Petroselinum crispum]. Tetrahedron, 2019, vol.75, pp.130494. doi: 10.1016/ j.tet.2019.130494.
4. Zorin V.V., Petukhova N.I., Shakhmaev R.N., Vasilova L.Ya., Chanysheva A.R., Zorin A.V., Sunagatullina A.Sh., Khalimova L.Kh. Osnovy issledovaniy v oblasti stereo- i regionaprav-lennogo biokataliza i organicheskogo sinteza biologicheski aktivnykh veshchestv [Fundamentals of research in the field of stereo- and region-directed biocatalysis and organic synthesis of biologically active substances]. Ufa, USPTU, 2018, p.286.
5. Weisi Xiong, Xiaobing Wang, Lingyi Kong. [Design and application of a biphasic system that enhances productivity of Daucus carota-catalyzed asymmetric reduction]. Biotechnology Letters, 2015, vol.37, pp.1703. doi: 10.1007/ s10529-015-1838-9.
6. Majewska E., Kozlowska M. [Regio- and stereoselective reduction of trans-4-phenylbut-3-en-2-one using carrot, celeriac and beetroot enzyme systems in an organic solvent]. Tetrahedron Letters, 2013, vol.15, pp.105-121. doi: 10.1016/j.tetlet.2013.09.041.
7. Lou W.-Y., Wang W., Li R.-F. [Efficient enantioselective reduction of 4'-methoxyaceto-phenone with immobilized Rhodotorula sp. AS2.2241 cells in a hydrophilic ionic liquid-containing co-solvent system]. Journal of Biotechnology, 2009, vol.143 (3), pp.190-197.
8. Dai Y., Huan B., Zhang H.-S. [Effective Biotransformation of Ethyl 4-Chloro-3-Oxobutanoate into Ethyl (S)-4-Chloro-3-Hydroxybutanoate by Recombinant E. coli CCZU-T15 Whole Cells in [ChCl][Gly]-Water Media]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2016, vol.181(4), pp.1347-1359.
