CC BY
19
УДК 547.61
DOI: 10.17122/bcj-2018-2-41-45
А. Р. Чанышева (к.х.н., доц.), Т. Е. Воробьева (магистрант), Е. A. Шейко (магистрант), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНОЕ ВОССТАНОВЛЕНИЕ АЦЕТОФЕНОНА ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫМИ КЛЕТКАМИ
D. CAROTA
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347)2431935, e-mail: aliyach@mail.ru
A. R. Chanysheva, T. E. Vorobyova, E. A. Sheiko, V. V. Zorin
ENANTIOSELECTIVE REDUCTION OF ACETOPHENONE BY LYOPHILIZED D. CAROTA CELLS
Ufa State Petroleum Technological University 1, Kosmonavtov Str., 450062, Ufa, Russia; ph. (347)2431935, e-mail: aliyach@mail.ru
Исследована возможность использования лио-филизированных клеток D. carota (в том числе клеток, лиофилизированных с применением различных криопротекторов) для энантиоселек-тивного биовосстановления ацетофенона в (S)-(—)-1-фенилэтанол. Показано, что биовосстановление ацетофенона в течение 96 ч в аэробных условиях при температуре 23—27 оС в водной среде в присутствии лиофилизирован-ных клеток D. carota, протекает энантиоселек-тивно и позволяет получать (5)-(—)-1-фенилэта-нол с выходом 12% и оптической чистотой 93% ее. При биовосстановлении ацетофенона в тех же условиях с участием клеток D. carota, лио-филизированных в присутствии криопротекто-ра глюкозы, выход целевого (5)-(—)-1-фенилэ-танола возрастает до 22% при оптической чистоте 93% ee. Активность клеток D. carota, лиофилизированных в присутствии диметил-сульфоксида, снижается, и выход (5)-(—)-1-фе-нилэтанола составляет 5%.
Ключевые слова: ацетофенон; криопротектор; лиофилизированные клетки; (5)-(—)-1-фенилэта-нол; энантиоселективное биовосстановление.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки России в рамках базовой части государственного задания в сфере научной деятельности (№ 4.6451.2017/8.9).
Асимметрическое восстановление прохи-ральных кетонов с участием клеточных биокатализаторов является перспективным методом получения энантиомерно чистых спиртов — важных компонентов катализаторов органи-
Дата поступления 18.04.18
Possibility of lyophilized D. carota cells (including cells lyophilized using different cryoprotectants) application for enantioselective bioreduction of acetophenone to (S)-(—)-1-phenylethanol was investigated. Bioreduction of acetophenone for 96 hours under aerobic conditions at 23—27 0C in an aqueous medium in the presence of lyophilized D. carota cells proceeds enantioselectively and allows the production of (S)-(—)-1-phenylethanol in 12% yield and optical purity of 93% ee. After bioreduction of acetophenone with D. carota cells lyophilized in the presence of glucose as cryoprotectant under the same conditions the yield of the desired (S)-(—)-1-phenylethanol increases to 22% with an optical purity of 93% ee. Activity of D. carota cells lyophilized in the presence of dimethyl sulfoxide is reduced and the yield of (S)-(—)-1-phenylethanol is 5%.
Key words: acetophenone; cryoprotectant; enantioselective bioreduction; lyophilized cells; (S)-(—)-1-phenylethanol.
This work was supported by the Ministry of Education and Science of Russia within the framework of the basic part of the state task in the field of scientific activity (№4.6451.2017/8.9).
ческого синтеза, биоразлагаемых полимеров, ароматизаторов, агрохимикатов, лекарственных препаратов, обладающих высокой биологической активностью 1-6.
Ранее нами с целью создания метода получения (5)-(—)-1-фенилэтанола — предшественника ряда низкомолекулярных биорегулято-
ров 7 был использован биокатализатор на основе клеток D. carota и найдены условия, позволяющие в течение 144 ч получать (5)-(—)-1-фе-нилэтанол с высоким выходом 95% и оптической чистотой 97% ee.
Ферментативная активность биокатализатора зависит от ряда факторов: температуры, pH растворителя, условий культивирования, длительности хранения и др. Одной из проблем является поддержание биокатализаторов на основе клеточных культур в активном состоянии в течение длительного времени. Для решения этой задачи разработан ряд методов, одним из которых является лиофилизация 8-10.
Лиофилизация является эффективным способом сохранения активности клеточных культур. Однако в ходе лиофилизации клетки могут подвергаться деструкции, что приводит к снижению их жизнеспособности и активности 8.
Многочисленные исследования были направлены на изучение факторов, влияющих на криоконсервацию клеточных культур 9-12. Среди них — клеточная устойчивость, которая в значительной степени зависит от состава кри-озащитных добавок до лиофилизации. При этом подбор оптимальных криопротекторов играет ключевую роль.
В данной работе была исследована возможность использования лиофилизированных клеток D. carota (в том числе клеток, лиофи-лизированных с применением различных кри-опротекторов) для энантиоселективного биовосстановления ацетофенона до соответствующего (5)-(—)-1-фенилэтанола.
Восстановление ацетофенона в течение 96 ч в аэробных условиях при температуре 23— 27 оС в водной среде, содержащей 2.4 г/л субстрата и 25 г/л суспензии клеток D. carota, приводит к образованию (5)-(—)-1-фенилэта-нола с выходом 51% и оптической чистотой 95% ee (табл. 1).
Стереоселективное биовосстановление ацетофенона в аналогичных условиях в присутствии лиофилизированных клеток D. carota, приводит к (S)-(—)-1 -фенилэтанолу с выходом 12% и оптической чистотой 93% ee.
Низкий выход целевого (5)-(—)-1-фенилэ-танола, вероятно, обусловлен медленным замораживанием клеток, при котором происходит рост кристаллов льда и разрушение клеток. Ак-
тивность поврежденных клеток при этом снижается и, как следствие, конверсия исходного субстрата в присутствии лиофилизированных таким способом клеток D. carota уменьшается 13.
Известно, что предварительная обработка клеток различными криопротекторами (моно-и полисахаридами, гликолями, органическими кислотами, аминокислотами и их солями и др.) 14-19 позволяет сохранить активность клеточных культур, смягчить разрушительные эффекты лиофилизации и расширить диапазон оптимальных условий лиофилизации.
Нами была исследована также возможность использования в биовосстановлении аце-тофенона клеток D. carota, лиофилизирован-ных в присутствии глюкозы и диметилсуль-фоксида (ДМСО).
Предполагается, что глюкоза, сахароза, трегалоза и другие сахара способствуют дегидратации клетки до замораживания и препятствуют образованию кристаллов льда внутри клетки. Они обеспечивают защитное действие на наружной поверхности клеточной мембраны. Действие углеводов сводится к уменьшению осмотического давления воды и генерированию аморфной стеклянной фазы. Эта иммобилизация предотвращает агрегацию или механический стресс, вызванный кристаллизацией воды.
Установлено, что биотрансформация с участием клеток D. carota, лиофилизирован-ных в присутствии глюкозы, в течение 96 ч позволяет получить (S)-(—)-1-фенилэтанол с выходом 22% и оптической чистотой 93% ee (табл. 1).
Защитное действие диметилсульфоксида как криопротектора основано на высокой скорости проникновения через клеточную мембрану и образовании большого количества водородных связей с молекулами жидкой фазы клетки. Это приводит к уменьшению вероятности образования внутриклеточных кристаллов льда, а также к снижению эффекта концентрирования внутриклеточных солей при отрицательных температурах, что уменьшает степень
20
криоповреждения клетки .
Однако, биовосстановление ацетофенона с участием клеток D. carota, лиофилизирован-ных в присутствии диметилсульфоксида в течение 96 часов приводит к образованию (S)-(— )-1-фенилэтанола лишь с выходом 5% и оптической чистотой 93% ee (табл.а 1).
Помимо криозащитных свойств, ДМСО обладает токсическим действием по отношению к биообъектам 21, что, вероятно, и обьяс-няет существенное снижение выхода целевого (5)-(—)-1-фенилэтанола.
Таблица 1
Выходы и оптическая чистота (5)-(-)-1-фенилэтанола, полученного при восстановлении ацетофенона с участием нелиофилизированных и лиофилизированных клеток D. carota в отсутствии и в присутствии различных криопротекторов при температуре 23-27 оС в водной среде
Время реакции, ч Выход, % / Оптическая чистота ее, % *
Клетки D. carota Лиофилизированные клетки D. carota Лиофилизированные клетки D. carota (криопротектор: ДМСО) Лиофилизированные клетки D. carota (криопротектор: глюкоза)
24 20/92 5/91 2/91 13/91
48 38/94 8/92 3.6/90 16/93
72 43/95 10/93 4/93 19/92
96 51/95 12/93 5/94 22/93
* - по данным энантиоселективного ПЖХ анализа
За ходом протекания реакций следили хромато графически, используя заведомо синтезированные образцы рацемического фенилэ-танола с применением энантиоселективной колонки Astec CHIRALDEXTM B-PM (30 м х 0.25 мм х 0.12 мкм), на которой время удерживания (^)-(+)-1-фенилэтанола меньше, чем (5)-(—)-1-фенилэтанола.
Структуру (S)-(—)-1-фенилэтанола подтверждали с помощью методов ЯМР и 13С-спектроскопии, а также хромато-масс-спектро-метрии. Конфигурация (5)-(—)-1-фенилэтано-ла была подтверждена поляриметрически.
Анализ кинетики накопления (5)-(—)-1-фе-нилэтанола в процессе биовосстановления ацето-фенона показывает, что восстановление наиболее эффективно протекает с участием биокатализатора D. carota, не подверженного лиофилиза-ции (табл. 1). При стереоселективном биовосстановлении ацетофенона в аналогичных условиях в присутствии лиофилизированных клеток D. carota выход (S)-(—)-1-фенилэтанола снижается. Однако при биовосстановлении ацетофенона с участием клеток D. carota, лиофилизирован-ных в присутствии криопротектора глюкозы, выход целевого (S)-(—)-1-фенилэтанола значительно возрастает (22% (93% ee), в сравнении с выходом, полученным в присутствии клеток D. carota, лиофилизированных без криопротектора. Активность лиофилизированных в присутствии ДМСО клеток D. carota падает, очевидно, поскольку ДМСО обладает токсическим действием.
Исследование оптических свойств (S)-(—)-1-фенилэтанола показывает, что лиофилизиро-ванные клетки D. carota энантиоселективно осуществляют восстановление ацетофенона с образованием целевого продукта с высокой оптической чистотой.
Таким образом, лиофилизированные клетки D. carota могут быть использованы в качестве биокатализатора для энантиоселективного восстановления ацетофенона в (5)-(—)-1-фени-л этанол. Однако для создания эффективного
метода получения оптически чистого (S)-(—)-1-фенилэтанола с высоким выходом необходимо проведение дальнейших исследований по оптимизации условий лиофилизации биокатализатора.
Экспериментальная часть
Спектры ЯМР 1Н и ЯМР 13С записаны в CDCl3 на приборе Bruker АМ-300 (300.13 МГц (1Н) и 75.47 МГц (13С)) и Bruker АМ-500 (600.30 МГц (1Н) и 159.96 МГц (13С)). Химические сдвиги в спектрах ЯМР 1Н измеряли относительно ТМС, в спектрах ЯМР 13С — относительно сигнала растворителя (77.0 м.д.). Хромато-масс-спектральный анализ проводили на приборе GCMS-QP2010S Shimadzu (электронная ионизация при 70 эВ). Хрома-тографический анализ продуктов проводили на программно-аппаратном комплексе Хрома-тэк-Кристалл 5000.2 с пламенно-ионизационным детектором, газ-носитель - гелий (1.1 мл/ мин), энантиоселективная колонка Astec CHIRALDEXTM B-PM (30 м х 0.25 мм х 0.12 мкм). Удельное вращение полученных продуктов ([a]20D продукта) измеряли на автоматическом поляриметре АА-55 Optical Activity Ltd. (1=589 нм). Стандартная величина удельного вращения (5)-(—)-1-фенилэтанола [«]20d = —44о [22].
Подготовка биокатализатора. Биокатализатор на основе клеток D. carota был предварительно обработан криопротектором, в качестве которого был использован 1.28 М раствор ДМСО (10% от общей массы клеток) или 30%-ный раствор глюкозы (20% от общей массы клеток).
Условия лиофилизации. Предварительно обработанные криопротектором клетки были подвержены заморозке в морозильной камере Sanyo MDF-193 при —50 оС, и высушены в вакууме (10 Па) в лиофильной сушилке Scientz 10ND при температуре 20 оС, температура в конденсаторе составляла —50 оС. Полный цикл лиофилизации составил 26 ч.
Получение ( S1 )-(—)-1-фенилэтанола.
Ацетофенон (0.1 г) добавляли в суспензию биокатализатора на основе клеток D. carota (15 г) в 70 мл воды, после чего реакционную смесь помещали в орбитальный шейкер (150 об/мин) и перемешивали при температуре 23—27 °С. По достижению необходимой конверсии суспензию фильтровали, биомассу промывали три раза водой. Фильтраты экстрагировали диэтиловым эфиром (3x125 мл). Эфирные вытяжки сушили Na2SO4, концентрировали и анализировали.
Литература
1. Suan C.L., Sarmidi M.R. Immobilised lipase-catalysed resolution of (R, S)-1-phenylethanol in recirculated packed bed reactor // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic.— 2004.— V.28, №2-3.- Pp. 111-119.
2. Patel R., Namee C.G., Banerjee A., Howell J.M., Robison R.S., Szarka L.J. Stereoselective reduction of ¿8-keto esters by Geotrichum candidum // Enzyme and Microbial Technology.- 1992.- V.14.- Pp.731-738.
3. Medson C., Smallridge A.J., Trewhella M.A. The stereoselective preparation of ^-hydroxy esters using a yeast reduction in an organic solvent // Tetrahedron: Asymmetry.-- 1997.- V.8.-Pp.1049-1054.
4. Чанышева А.P., Воробьева E.H., Зорин В.В. Энантиоселективное биовосстановление ацетофе-нона в (R)- и ^)-1-фенилэтанолы // Экологическая химия.- 2017.- Т.26, №6.- C.296-300.
5. Шейко Е.А., Медникова Е.Э., Воробьева Т.Е., Чанышева А.Р. Исследование условий энантио-селективного восстановления ацетофенона в ^)-(-)-1-фенилэтанол // Баш. хим. ж.- 2018.-Т.25, №1.- С.55-58.
6. Шакиров А.Н., Петухова Н.И., Дельмухаметов P.P., Корнеева С. В., Зорин В. В. Энантиоселек-тивное биовосстановление ацетофенона и его функциональных производных // Баш. хим. ж.- 2012.- Т.19, №2.- С.71-73.
7. Чанышева А.Р., Юнусова Г.В., Воробьева Т.Е., Зорин В.В. Энантиоселективный синтез (S)-1-фенилэтанола - предшественника низкомолекулярных биорегуляторов // Экологическая химия.— 2017.- Т.26, №6.- С.6-10.
8. Costa E., Usall N., Teixido N., Garcia N., Vinas I. Effect of protective agents, rehydration media and initial cell concentration on viability of Pantoea agglomerans strain CPA-2 subjected to freeze-drying // Journal of Applied Microbiology.- 2000.- V.89.- Pp.793-800.
9. Villa R., Molinari F. Reduction of Carbonylic and Carboxylic Groups by Plant Cell Cultures // Journal of Natural Products.- 2008.- V.71.-Pp.693-696.
10. Fonseca F., Marin M., Morris G. J. Stabilization of Frozen Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus in Glycerol Suspensions: Freezing Kinetics and Storage Temperature Effects // Applied and Environmental Microbiology.-2006.- V.72, №10.- Pp.6474 - 6482.
(5)-(—)-1-Фенилэтанол. Спектр ЯМР 5, м. д.: 1.40 д (3H, CH3), 4.71-4.77 м (1Н, СН), 7.22-7.42 м (5Н, СНАг). Спектр ЯМР 13C, 5, м. д.: 25.18 (1C, CH3), 70.05 (1C, CH), 125.34 (2C, СНАг), 127.18 (1C, СНАг), 128.28 (2C, СНАг), 145.92 (1C, СНАг). Масс-спектр, m/z (1отн., %): 122 (30), 107 (85), 79 (100), 78 (23), 77 (57), 51 (23), 50 (11), 44 (17),43 (39), 39 (10).
Синтез рацемического ^),^)-1-фенилэта-
« 23
нола осуществляли по известной методике .
References
1. Suan C.L., Sarmidi M.R. [Immobilised lipase-catalysed resolution of (R, S)-1-phenylethanol in recirculated packed bed reactor]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2004, vol.28, no.2-3, pp.111119. doi: 10.1016j.molcatb.2004.02.004.
2. Patel R., Namee C.G., Banerjee A., Howell J.M., Robison R.S., Szarka L.J. [Stereoselective reduction of ¿8-keto esters by Geotrichum candidum]. Enzyme and Microbial Technology, 1992, vol.14, pp.731-738. doi: 10.1016/0141-0229(92)90113-3.
3. Medson C., Smallridge A.J., Trewhella M.A. [The stereoselective preparation of ^-hydroxy esters using a yeast reduction in an organic solvent]. Tetrahedron: Asymmetry, 1997, vol.8, pp.1049-1054. doi: 10.1016/ S0957-4166(97)00050-5.
4. Chanysheva A. R., Vorobyova E. N., Zorin V. V. [Enantioselective Bioreduction of Acetophenone into (R)- and (S)-1-Phenylethanols]. Russian Journal of General Chemistry, 2017, vol.26, no.6, pp.296-300. doi: 10.1134/s1070363217130229.
5. Sheiko E.A., Mednikova E.E., Vorobyova T.E., Chanysheva A.R. Issledovanie uslovii enantioselektivno-go vosstanovleniya atsetofenona v (S)-(—)-1-fenil-etanol [Investigation of enantioselec-tive bioreduction conditions of acetophenone to (S)-(-)-1-phenyl-ethanol]. Bashkirskii khimicheskii zhurnal [Bashkir Chemical Journal], 2018, vol.25, no.1, pp.55-58.
6. Shakirov A.N., Petukhova N.I., Delmuhametov R.R, Korneeva S.V. Zorin V.V. Enantioselektivnoe biovos-stanovlenie atsetofenona i ego funktsionalnykh proizvodnykh [Microbiological enantioselective reduction of acetophenon and its functional derivatives]. Bashkirskii khimicheskii zhurnal [Bashkir Chemical Journal], 2012, vol.19, no.2, pp.71-73.
7. Chanysheva A.R., Yunusova G.V., Vorobyova T.E., Zorin V.V. [Enantioselective synthesis of (S)-1-phenylethanol, a precursor to low-molecular-weight bioregulators]. Russian journal of general chemistry, 2016, vol.86, no.3, pp.3021-3024. doi: 10.1134/S107036321613017X.
8. Costa E., Usall N., Teixido N., Garcia N., Vinas I. [Effect of protective agents, rehydration media and initial cell concentration on viability of Pantoea agglomerans strain CPA-2 subjected to freeze-drying]. Journal of Applied Microbiology, 2000, vol.89, pp.793-800. doi: 10.1046/j.1365-2672.2000.01182.x.
9. Villa R., Molinari F. [Reduction of Carbonylic and Carboxylic Groups by Plant Cell Cultures]. Journal of Natural Products, 2008, vol.71, pp.693-696. doi: 10.1021/np070386s.
11. Dumont F., Marechal P., Gervais P. Viability after Freezing at Different Cooling Rates // Applied and Environmental Microbiology.-2004.- V.70, №1.- Pp.268-272.
12. Zhang J., Liu Q., Chen W., Du G., Chen J. Short communication: Protection of lyophilized milk starter Lactobacillus casei Zhang by glutathione // Journal of Dairy Science.- 2016.- V.99.-Pp.1- 7.
13. Kazici H.C., Bayraktar E., Mehmetoglu U. Optimization of the asymmetric synthesis of chiral aromatic alcohol using freeze-dried carrots as whole-cell biocatalysts // Green Processing and Synthesis.- 2016.- V.5, №2.- P.131-137.
14. Lamprech E.D., Foster E.M. The survival of starter organisms in concentrated suspensions // The Journal of Applied Bacteriology.- 1963.-V.26.- Pp.359-369.
15. Chavarri F.J., De Paz M., Nunez M. Cryoprotective agents for frozen concentrated starters from non-bitter Streptococcus lactis strains // Biotechnology Letters.- 1988.-V.10.- Pp.11-16.
16. Teixeira P.C., Castro M.H., Malcata F.X., Kirby R.M. Survival of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus following spray-drying // Journal of Dairy Science.- 1995.- V.78.- Pp.1025-1031.
17. Andersen A.B., Fog-Petersen M.S., Larsen H., Skibsted L.H. Storage stability of freeze-dried starter cultures Streptococcus thermophilus as related to physical state of freezing matrix // Journal of Food Science and Technology.-1999.- V.32.- Pp.540-547.
18. Carvalho A.S., Silva J., Ho P., Teixeira P., Malcata F.X., Gibbs P. Protective effect of sorbitol and monosodium glutamate during storage of freeze-dried lactic acid bacteria // LAIT journal.- 2003.- V.83.- Pp.203-210.
19. Fonseca F., Beal C., Mihoub F., Marin M., Corrieu G. Improvement of cryopreservation of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CFL1 with additives displaying different protective effects // International Dairy Journal.- 2003.- V.13.- Pp.917-926.
20. Fuller B., Lane N., Benson E. Life in the frozen state. London: CRC Press, 2004.- 672 p.
21. Rowley S.D., Anderson G.L. Effect of DMSO exposure without cryopreservation on haemopoetic progenitor cells // Bone Marrow Transplant.- 1993.- V. 11, №5.- Pp.389-393.
22. Каталог фирмы Sigma-Aldrich, Inc. «(5)-(-)-1-Phenylethanol» Электронный ресурс, режим доступа : https: //www. sigmaaldrich. com/catalog/ product/aldrich/685836.
23. Агрономов A. E. Лабораторные работы в органическом практикуме.- М.: Химия, 1974.- 376 с.
10. Fonseca F., Marin M., Morris G. J. [Stabilization of Frozen Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus in Glycerol Suspensions: Freezing Kinetics and Storage Temperature Effects]. Applied and Environmental Microbiology, 2006, vol. 72, no. 10, pp. 6474 - 6482. doi: 10.1128/AEM.00998-06.
11. Dumont F., Marechal P., Gervais P. [Cell Size and Water Permeability as Determining Factors for Cell Viability after Freezing at Different Cooling Rates]. Applied and Environmental Microbiology, 2004, vol.70, no.1, pp.268-272. doi: 10.1128/AEM.70.1.268-272.2004 .
12. Zhang J., Liu Q., Chen W., Du G., Chen J. [Short communication: Protection of lyophilized milk starter Lactobacillus casei Zhang by glutathione]. Journal of Dairy Science, 2016, vol.99, pp.1-7. doi: 10.3168/jds.2015-9540.
13. Kazici H.C., Bayraktar E., Mehmetoglu U. [Optimization of the asymmetric synthesis of chiral aromatic alcohol using freeze-dried carrots as whole-cell biocatalysts]. Green Processing and Synthesis, 2016, vol.5, no.2, pp.131-137. doi: 10.1515/gps-2015-0118.
14. Lamprech E.D., Foster E.M. [The survival of starter organisms in concentrated suspensions]. The Journal of Applied Bacteriology, 1963, vol.26, pp.359-369. doi: 10.1111/j. 1365-2672.1963.tb04786.x.
15. Chavarri F.J., De Paz M., Nunez M. [Cryoprotective agents for frozen concentrated starters from non-bitter Streptococcus lactis strains]. Biotechnology Letters, 1988, vol.10, pp.11-16. doi: 10.1007/BF01030016.
16. Teixeira P.C., Castro M.H., Malcata F.X., Kirby R.M. [Survival of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus following spray-drying]. Journal of Dairy Science, 1995, vol.78, pp.1025-1031. doi: 10.3168/jds.S0022-0302(95)76718-2.
17. Andersen A.B., Fog-Petersen M.S., Larsen H., Skibsted L.H. [Storage stability of freeze-dried starter cultures Streptococcus thermophilus as related to physical state of freezing matrix]. Journal of Food Science and Technology, 1999, vol.32, pp.540-547. doi: 10.1006/fstl.1999.0594.
18. Carvalho A.S., Silva J., Ho P., Teixeira P., Malcata F.X., Gibbs P. [Protective effect of sorbitol and monosodium glutamateduring storage of freeze-dried lactic acid bacteria]. LAIT journal, 2003, vol.83, pp.203-210. doi: 10.1051/lait:2003010.
19. Fonseca F., Beal C., Mihoub F., Marin M., Corrieu G. Improvement of cryopreservation of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CFL1 with additives displaying different protective effects]. International Dairy Journal, 2003, vol.13, pp.917-926. doi: 10.1016/S0958-6946(03)00119-5.
20. Fuller B., Lane N., Benson E. [Life in the frozen state]. London, CRC Press, 2004, 672 p.
21. Rowley S.D., Anderson G.L. [Effect of DMSO exposure without cryopreservation on hematopoietic progenitor cells]. Bone Marrow Transplant, 1993, vol.11, no.5, pp.389-393.
22. Catalog of the company Sigma-Aldrich, Inc. «(S)-(— )-1 - Phenylethanol» https: //www. sigma aldrich.com/catalog/product/aldrich/685836.
23. Agronomov A. E. Laboratornye raboty v organicheskom praktikume [Laboratory work in organic chemistry practice]. Moscow, Khimiya Publ., 1974, 376 p.
